Name: Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Leer een snelle methode voor neutrofiele chemotaxis-analyse met een microfluidische chip direct uit een bloeddruppel. Deze techniek isoleert cellen en voert assays uit in slechts 25 minuten voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada (NSERC) en de Canadese Instituten voor Gezondheidsonderzoek (CIHR). Wij bedanken het Clinical Institute of Applied Research and Education in het Victoria General Hospital in Winnipeg en Seven Oaks General Hospital in Winnipeg voor het beheer van klinische monsters van mensen. We danken Dr. Hagit Peretz-Soroka voor een goede discussie over de analysestrategieën. <style type="text/css">
</style> We bedanken professor Carolyn Ren en dr. Xiaoming (Cody) Chen van de Universiteit van Waterloo voor hun royale steun in het filmproces.

Alle protocollen voor het verzamelen van menselijke monsters werden goedgekeurd door de Joint Research Board Ethics Board van de Universiteit van Manitoba, Winnipeg. 1. Fabricage van microfluïdische inrichting ( Figuur 1A ) <ol><li> Ontwerp en print transparantie masker. <ol><li> Ontwerp het apparaat zoals eerder beschreven 25 . Zie figuur 1A . OPMERKING: het apparaat bevat twee lagen. De eerste laag (4 μm hoog) definieert het cel docking barrier kanaal om de cellen naast het gradiëntkanaal vast te vallen. De tweede laag (60 μm hoog) definieert het gradiëntgeneratiekanaal, de poort en het kanaal voor het laden van cellen, de chemische inlaatreservoirs en de afvalafvoer. De uitlijningspunten zijn ontworpen voor de twee lagen. Voor de tweede laag is de lengte en breedte van het stroomopwaartse serpentine ingangskanaal respectievelijk 60 mm en 200 μm; De lengte en breedte van de stroomafwaartseSerpentine ingangskanaal is respectievelijk 6 mm en 280 μm. </li><li> Druk de eigenschappen van de eerste en tweede laag op een transparantmasker af met een printer met hoge resolutie. OPMERKING: De afdrukresolutie hangt af van de minimale eigenschappen in het ontwerp. In het huidige ontwerp werd 32.000 dpi gekozen voor een minimale functie van 10 μm. </li></ol></li><li> Maak de siliconenwafel schoon. <ol><li> Plaats een 3 in siliconenwafel in de plasmaschoner. Breng vacuüm gedurende 3 minuten aan. </li><li> Zet de plasma power aan en zet het niveau naar HIGH. Gebruik het zuurstofplasma om de siliciumwafel gedurende 30 minuten te behandelen. </li><li> Zet de plasmaschuiver uit en haal de siliconenwafel uit; De siliconenwafel is klaar om de apparaatvorm te fabriceren. </li></ol></li><li> Maak de eerste laag door fotolithografie in een cleanroom-faciliteit. OPMERKING: De exacte fabricageparameters kunnen variëren afhankelijk van de fabricagefaciliteit. <ol><li> Verdun 10 ml SU-8 2025 met 10 ml SU-8 2000 in een glazen breker om de ontworpen fotoresist voor te bereiden. Laat het mengsel gedurende 10 minuten in de dampkoker staan ​​totdat de bellen verdwijnen. </li><li> Plaats de schoongemaakte siliconenwafer voorzichtig op de spinner met de geschikte chuck en plaats het vacuüm om de siliciumwafel te immobiliseren. </li><li> Giet 3 ml van de fotoresistmengsel voorzichtig op het midden van de siliconenwafel. Spin bij 500 rpm gedurende 5 s. Draai dan bij 3 000 rpm gedurende 30 s om een ​​uiteindelijke 4 μm dikte fotoresist coating op de silicium wafer te verkrijgen. </li><li> Verwijder de siliconenwafel voorzichtig uit de spinner en bak de siliconenwafel gedurende 4 minuten bij 95 ° C op een kookplaat. </li><li> Plaats de siliconenwafel voorzichtig op een maskerbinder en zet de UV-belichtingstijd op 6 s. Bevestig het transparantmasker van de eerste laag voorzichtig op een transparante glazen plaat met plakband. </li><li> Plaats de transparante glazen plaat met het bijgevoegde masker voorzichtig op de uitlijning en lig het masker af met de siliconenwafel. Stel de si uitLiconwafel naar de UV om de celdockstructuur te patronen. </li><li> Verwijder de glasplaat voorzichtig en verwijder de blootgestelde siliconenwafel. Bak de siliconenwafel op een kookplaat gedurende 4 minuten bij 95 ° C. </li><li> Breng de siliconenwafel over op een afzuigkap en plaats deze in een glazen pan met de SU-8-ontwikkelaar. Schud dit voor 30 s voorzichtig. </li><li> Reinig de siliconenwafel met behulp van een verse SU-8-ontwikkelaar, gevolgd door isopropylalcohol (IPA) in de dampkap. Droog de siliconenwafel door stikstofgas in de dampkap; De eerste laag is klaar. </li></ol></li><li> Maak de tweede laag op de eerste laag. <ol><li> Gebruik kleefband om de uitlijningstekens op de eerste laag te bedekken. Plaats de siliconenwafel voorzichtig met de eerste laag op de vacuümklem van de spinner en vacuüm aan om de siliconenwafel te immobiliseren. </li><li> Giet 3 ml SU-8 2025 fotoresist op de siliconenwafel. Draai de siliconenwafel bij 500 rpm gedurende 5 s. Draai dan bij 2000 rpm voor 30S om een ​​uiteindelijke 60 μm dikte fotoresist coating op de silicium wafer te verkrijgen. </li><li> Verwijder de siliciumwafel voorzichtig uit de spinner en plaats deze op een kookplaat; Bak bij 65 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de kleefband voorzichtig om de uitlijningsteken op de eerste laag te openen. Leg de siliconenwafel op een kookplaat en bak 6 min bij 95 ° C. </li><li> Plaats de siliconenwafel voorzichtig op een maskerbinder en stel de UV-belichtingstijd in op 18 s. </li><li> Bevestig het transparantmasker van de tweede laag voorzichtig op een transparante glazen plaat met plakband. </li><li> Zet de glazen plaat voorzichtig met het bijgevoegde masker op de uitlijder en lig het masker en de eerste laag op de siliconenwafel uit door de kruisuitlijningstekens te gebruiken met behulp van de inspectiemicroscoop van de uitlijning. </li><li> Breng de fotoresistcoated siliconenwafel bloot aan UV om de cellading- en gradiëntkanalen te patronen. </li><li> Verwijder de glasplaat voorzichtig en haal de silicium wAfer. Bak de siliconenwafel op een kookplaat bij 65 ° C gedurende 2 minuten en breng de siliciumwafel over naar een andere 95 ° C kookplaat en bak 6 min. </li><li> Breng de siliconenwafel naar de dampkap en plaats deze in een glazen pan met de SU-8-ontwikkelaar. Schud dit voor 6 minuten voorzichtig. </li><li> Reinig de siliconenwafel met behulp van een nieuwe SU-8-ontwikkelaar, gevolgd door IPA in de dampkap. </li><li> Droog de siliconenwafel met stikstofgas in de dampkap. Plaats de siliconenwafel op een kookplaat en bak de mal gedurende 30 minuten bij 150 ° C; De tweede laag is klaar. </li></ol></li><li> Mastervormoppervlakmodificatie. OPMERKING: Een silanisatieoppervlakmodificatiestap wordt toegepast op de SU-8 schimmel om polydimethylsiloxaan (PDMS) vrijlating van de mal in zachte lithografie te vergemakkelijken. <ol><li> Neem 10 μl tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl (trichloorsilaan) oplossing in een micropipette tip. Zet de micropipettaart in een 15 ml plastic buis aLos de kap van de buis los. </li><li> Plaats de buis en de SU-8 patroon silicium wafer in een droogmiddel en plaats het vacuüm gedurende 1 uur; De maskervorm is klaar voor het vervaardigen van het PDMS-apparaat. </li></ol></li><li> Fabriceer het PDMS-apparaat. <ol><li> Bereid de PDMS oplossing door 40 g PDMS base en 4 g verhardingsmiddel in een plastic beker te mengen. Plaats de voorbereide SU-8 meesterschimmel in een Petri-schaal en giet 44 g PDMS-oplossing zorgvuldig op de schimmel. </li><li> Plaats de Petri-schotel in een droogmiddel en vacuüm om de PDMS-oplossing gedurende 20 minuten te ontdoen. Plaats de Petri-schotel in een oven en kuur de PDMS bij 80 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na het bakken, haal de Petri schotel uit en plaats het op een schone bank. Snijd de PDMS-plaat uit de SU-8 schimmel en snij het af. </li><li> Pons de cel laadpoort uit met een puncher met een diameter van 3 mm. Steek de inlaatreservoirs en de afvaluitlaat uit met een puncher met een diameter van 6 mm. </li><li> Verwijder het stof op deOppervlak van de PDMS-plaat met plakband. Plaats de PDMS-plaat en een schone glazen glijbaan in de plasma machine. Breng het vacuüm gedurende 3 minuten aan. </li><li> Zet de plasma power aan en zet het niveau naar HIGH. Zet de luchtklep voorzichtig aan en plaats de PDMS-plaat en de glasdia voor 3 minuten. </li><li> Zet de plasmaschakel uit en laat het vacuüm los. Pak de PDMS-plaat en de glazen glijbaan voorzichtig uit met behulp van een pincet. </li><li> Plaats de PDMS-plaat (met kanaalconstructies met de bedrukte zijde) direct op de glazen glijbaan; Druk voorzichtig op de PDMS-plaat om het aan het glas te binden. Vul het microfluïdische kanaal onmiddellijk met gedeïoniseerd water; De fabricage en montage van de microfluidische inrichting zijn voltooid. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van microfluïdische celmigratieassays <ol><li> Microfluïdische apparaatvoorbereiding. <ol><li> Bereid 50 μg / ml fibronectine oplossing door 50 μL voorraad fibronectine oplossing (1 mg / ml) te verdunnen tot 95081; L Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) in een biosafety-kast. </li><li> Bereid het migratiemedium op door 9 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640) en 1 mL RPMI-1640 met 4% boviene serumalbumine (BSA) te mengen. </li><li> Verwijder het gedeïoniseerd water uit het apparaat. </li><li> Voeg 100 μL fibronectinoplossing toe aan het apparaat van de uitlaat. Wacht 3 minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen gevuld zijn met fibronectine oplossing. Plaats het microfluïdische apparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bedekte Petri-schotel. </li><li> Verwijder de fibronectine oplossing van het apparaat. Voeg 100 μL migratiemedium toe vanaf de uitlaat. Wacht 3 minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen met migratiemedium zijn gevuld. </li><li> Incubeer het apparaat nog eens 1 uur bij kamertemperatuur; Het apparaat is dan klaar voor het chemotaxis experiment. </li></ol></li><li> Chemoattractant oplossing preparaat voor chemotaxis experiment. <ol><li> Bereid 100 nM fMLP oplossing in tTotaal 1 ml migratie medium. Meng 5 μL voorraad FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) met de fMLP oplossing in een 1,5 ml buis. OPMERKING: FITC-Dextran wordt gebruikt voor gradientmeting. Alternatief, gebruik Rhodamine als de gradiënt indicator. De fMLP chemoattractant oplossing is dan klaar voor chemotaxis experiment. </li></ol></li><li> Sputummonstervoorbereiding. OPMERKING: Neutrofiele chemotaxis geïnduceerd door een gradiënt van sputummonster van COPD-patiënten werd getest als een klinische diagnostische toepassing van deze all-on-chip methode. <ol><li> Verkrijg een human ethics protocol om sputummonsters van COPD patiënten te verzamelen. OPMERKING: Wij hebben goedkeuringen verkregen om monsters te verzamelen in het Seven Oaks General Hospital in Winnipeg (goedgekeurd door de Universiteit van Manitoba). </li><li> Verkrijg de geïnformeerde schriftelijke toestemmingsformulieren van alle vakken. </li><li> Verzamel de spontane sputummonsters van COPD-patiënten. Plaats 500 μL sputummonster in een 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 500 μL 0,1% diThiothreitol in de 1,5 ml buis en meng zachtjes. Plaats de buis gedurende 15 minuten in een waterbad bij 37 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 753 xg gedurende 10 minuten en verzamel vervolgens het supernatant. Centrifugeer het supernatant bij 865 xg gedurende 5 minuten en verzamel vervolgens het uiteindelijke supernatant. Bewaar de verzamelde supernatant in een -80 ° C vriezer voor gebruik. </li><li> Doe de sputumoplossing als u klaar bent voor chemotaxis-experimenten. Overdracht 900 μL migratie medium naar een 1,5 ml buis en meng met 100 μL sputum oplossing in een biosafety kabinet; De sputumoplossing is dan klaar voor chemotaxis-experiment. </li></ol></li><li> Bloedmonsterverzameling. <ol><li> Verkrijg een human ethics protocol om bloedmonsters te verzamelen van gezonde donoren. Verkrijg de geïnformeerde schriftelijke toestemmingsformulieren van alle bloeddonors. OPMERKING: hier werden monsters verkregen bij het Victoria General Hospital in Winnipeg (goedgekeurd door de Joint Research Board Ethics Board van de Universiteit van Manit)oba). </li><li> Verzamel het bloedmonster door venipuncture en plaats het monster in een EDTA-beklede buis. Houd de buis voor het experiment in een biosafety-kast. </li></ol></li></ol> 3. All-on-chip Chemotaxis Assay Operatie <ol><li> On-chip celisolatie ( Figuur 1B ). <ol><li> Plaats 10 μL volbloed in een 1,5 ml buis in een biosafety-kast. OPMERKING: Details over het verzamelen van bloedmonsters staan ​​in sectie 2.4. </li><li> Voeg 2 μL antilichaamcocktail (Ab) en 2 μL magnetische deeltjes (MP) van de neutrofiele isolatiekit (zie de tabel van materialen) in de 1,5 ml buis en meng het voorzichtig; Dit zal cellen in het bloed merken behalve de neutrofielen. </li><li> Incubeer het bloed-Ab-MP mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: dit zal de antilichaam gelabelde cellen in bloed magnetisch markeren. </li><li> Bevestig twee kleine magnetische schijven aan de twee zijden van de cel laad pPlaats van het apparaat. Aspireer het medium uit alle poorten van het apparaat. </li><li> Langzaam pipet 2 μL bloed-Ab-MP mengsel in de microfluïdische inrichting uit de cel laadpoort. OPMERKING: De magnetisch gemerkte cellen zijn vastgelegd aan de zijwanden van de cel laadpoort, terwijl neutrofielen in het apparaat stromen en worden vastgeklemd bij de celdockstructuur. </li><li> Wacht even tot er genoeg neutrofielen zijn vastgelopen in de cel-docking area. </li></ol></li><li> Chemotaxis-analyse ( Figuur 1C ). <ol><li> Plaats het microfluïdische apparaat op de temperatuurbeheerde microscoopfase bij 37 ° C. </li><li> Voeg 100 μL chemoattractantoplossing (fMLP of sputumoplossing) en 100 μL migratiemedium toe aan hun aangewezen inlaatreservoirs door gebruik te maken van twee pipettors; Dit zal een chemoattractantgradiënt in het gradiëntkanaal genereren door continu chemische mengen op basis van laminair flow, dat wordt ondersteund door een drukE balanseringsstructuur. OPMERKING: Details van de sputumcollectie van COPD-patiënten staan ​​in sectie 2.3. <ol><li> Voor het medium besturingsexperiment voegt u alleen migratiemedium toe aan beide inlaatreservoirs. </li></ol></li><li> Verkrijg het fluorescentiebeeld van FITC-Dextran in het verloopskanaal. </li><li> Importeer de afbeelding naar ImageJ-software met het commando &quot;Bestand | Open&quot;. </li><li> Meet het fluorescentie-intensiteitsprofiel over het gradiëntkanaal met behulp van het commando &quot;Analyse | Plot Profile&quot;. </li><li> De meetgegevens exporteren naar een spreadsheet voor verder plotten. </li><li> Incubeer het apparaat op de temperatuur gestuurde microscoop stadium of in een conventionele celcultuur incubator gedurende 15 minuten. </li><li> Beeld het verloopkanaal met behulp van een 10X-doelstelling om de eindposities van de cellen vast te stellen voor data-analyse. </li><li> Indien nodig, registreert u de celmigratie in het apparaat door middel van time-lapse microscopie. </li></ol></li></ol> 4. Cell Migration DAta-analyse ( figuur 1C ) <ol><li> Analyseer de chemotaxis assay door de cel migratie afstand van de docking structuur te berekenen zoals hieronder beschreven. Zie figuur 1C . </li><li> Importeer de afbeelding in NIH ImageJ-software (ver 1.45). </li><li> Selecteer het midden van elke cel die in het verloopskanaal is verplaatst. </li><li> Meet de coördinaten van de geselecteerde cellen voor hun eindposities. Meet de coördinaat van een punt aan de rand van de dockingstructuur als de eerste referentiepositie. </li><li> Exporteer de gemeten coördinaatgegevens naar een spreadsheetsoftware ( bijv. Excel). Bereken de migratieafstand van de cellen als het verschil tussen de uiteindelijke positie van een cel en de initiële referentiepositie langs de gradiëntrichting. </li><li> Kalibreren de afstand tot een micrometer. Bereken het gemiddelde en de afwijking van de migratieafstand van alle cellen als een maat voor chemotaxis. </li><li> Vergelijk het meRantsoort in aanwezigheid van een chemoattractantgradiënt aan het mediumcontrole-experiment met gebruikmaking van de student&#39;s t- test. </li><li> Als de tijdverloopbeelden van de celmigratie worden opgenomen, kan de celmigratie en chemotaxis verder worden geanalyseerd door celvolganalyse 15 . OPMERKING: De materialen die nodig zijn om de all-on-chip chemotaxis-analyse op te stellen en uit te voeren, worden gedetailleerd in de materialenlijst weergegeven. </li></ol>

<ol><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+trafficking+in+tissue+development%2C+growth%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Kruger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+between+host+defence%2C+immune+modulation%2C+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury.</a> PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).</li>
<li>Mócsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li>
<li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).</li>
<li>Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+tumour+angiogenesis%3A+subversion+of+immune+responses+to+promote+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth.</a> Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Wu, J., Wu, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidics-based+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies.</a> Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li>
<li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li>
<li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509(2014).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921(2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523(2015).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24962731">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li>
<li>Sackmann, E. K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547816500035">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten om bekend te maken.

In dit document is een gedetailleerd protocol beschreven om neutrofielen direct uit het bloed te isoleren, gevolgd door de chemotaxis test, alles op een enkele microfluïdische chip. Deze methode biedt handige functies in zijn gemakkelijke werking, negatieve selectie van neutrofielen met hoge zuiverheid, snelle test van chemotaxis, resultaatvermindering, verminderde reagentia en steekproefverbruik en nauwkeurige analyse van de celmigratie. Als een ruwe schatting heeft tenminste 25% van de neutrofielen van het input-gehel...

Chemotaxis, een proces van gerichte celmigratie naar oplosbaar chemisch concentratiegradiënt, is kritisch betrokken bij vele biologische processen, waaronder immuunrespons 1 , 2 , 3 , weefselontwikkeling 4 en kankermetastase 5 . Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcel subset en spelen cruciale rollen om het lichaam de aangeboren gastheerverdedigingfuncties mogelijk te maken, evenals bij het bemiddelen van adaptieve immuunresponsen 6 , 7 . Neutrofielen zijn uitgerust met sterk gereguleerde chemotactische machines waardoor deze motiele immuuncellen kunnen reageren op zowel pathogeen afgeleide chemoattractanten ( bv. FMLP) en gastheer-afgeleide chemoattractanten ( bijv . Interleukine-8) throughchemotaxis 8 . Neutrofiele migratie en chemotaxis mediëren verschillende fysiologische problemenEn ziekten zoals ontsteking en kanker 1 , 9 . Zo geeft de nauwkeurige beoordeling van neutrofiele chemotaxis een belangrijke functionele uitlezing voor het bestuderen van de neutrofiele biologie en de bijbehorende ziekten. In vergelijking met de veelgebruikte conventionele chemotaxis assays ( bijv. Transwell assay 10 ) tonen de microfluïdische inrichtingen een grote belofte voor kwantitatieve evaluatie van celmigratie en chemotaxis door de nauwkeurig gecontroleerde chemische gradiëntgeneratie en miniaturisatie 11 , 12 , 13 . In de afgelopen twee decennia of zo zijn diverse microfluïdische apparaten ontwikkeld om de chemotaxis van verschillende biologische celsoorten, vooral neutrofielen 11 , te bestuderen. Er was aanzienlijke inspanning gewijd aan het karakteriseren van neutrofiele migratie in spatiotemporally complex che<html> Mische gradiënten die werden geconfigureerd in de microfluïdische inrichtingen 14 , 15 . Interessante strategieën werden ook ontwikkeld om directionele besluitvorming door neutrofielen te bepalen door gebruik te maken van de microfluïdische inrichtingen 16. Naast biologisch georiënteerd onderzoek zijn de toepassingen van microfluïdische apparaten uitgebreid naar testklinische monsters voor ziekte-evaluatie 17 , 18 , 19 . Het gebruik van veel microfluïdische apparaten is echter beperkt tot gespecialiseerde onderzoekslaboratoria en vereist langdurige neutrofiele isolatie van groot volume bloedmonsters. Daarom is er een groeiende trend geweest voor het ontwikkelen van geïntegreerde microfluïdische apparaten voor snelle neutrofiele chemotaxis-analyse direct vanuit een druppel bloed in het bloed 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Naar deze richting werd een all-on-chip methode ontwikkeld die de magnetische negatieve neutrofielzuivering en de daaropvolgende chemotaxis-analyse op een enkele microfluidische inrichting 25 integreert. Deze all-on-chip methode heeft de volgende nieuwe kenmerken: 1) in tegenstelling tot eerdere on-chip strategieën die neutrofielen van het bloed isoleren door middel van adhesie-gebaseerde celopname of op celgrootte gebaseerde filtering 20 , 22 , maakt deze nieuwe methode hoge Zuiverheid, on-chip magnetische scheiding van de neutrofielen uit kleine volumes van volledig bloed, evenals chemotaxis meting bij chemoattractant stimulatie; 2) de celdockstructuur helpt de initiële posities van de neutrofielen dicht bij het chemische gradiëntkanaal af te stemmen en maakt een eenvoudige chemotaxisanalyse mogelijk zonder enkelvoudige cellen te volgen; 3) de integratie van de neutrofiele isolatie en chemotAs assay op een enkel microfluïdisch apparaat maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle analyse van de chemotaxis op de proef te krijgen, wanneer er geen onderbreking is tussen de experimentele stappen. Dit papier bevat een gedetailleerd protocol voor de constructie, werking en data analyse methode van deze all-on-chip chemotaxis assay. Het papier toont het effectieve gebruik van de ontwikkelde methode voor het uitvoeren van neutrofiele chemotaxis door een bekende recombinant chemoattractant en complexe chemotactische monsters van patiënten te testen, gevolgd door een discussie over probleemoplossingsstrategieën, beperkingen en toekomstige richtingen.

<table><tbody><tr><td>Apparaatfabricage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Digitale schaal</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 verdunner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 ontwikkelaar</td><td>Microchem</td><td>SU-8 ontwikkelaar</td><td></td></tr><tr><td>Si-wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilaan</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Glaze platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Snijpads</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Punkers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bron</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>On-chip celisolatie en chemotaxis-assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Magneetschijfjes</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm in diameter, 1 mm dik</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa-kleuringsoplossing</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U omgekeerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop-omgevingskamer.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrofiele migratie en chemotaxis zijn cruciaal voor het immuunsysteem van ons lichaam. Microfluidische apparaten worden steeds meer gebruikt om neutrofiele migratie en chemotaxis te onderzoeken vanwege hun voordelen in real-time visualisatie, nauwkeurige controle van de chemische concentratiegradiëntgeneratie en verminderde reagentia en het gebruik van monsters. Onlangs is door de microfluidische onderzoekers een groeiende inspanning gedaan voor het ontwikkelen van geïntegreerde en gemakkelijk geëxploiteerde microfluïdische chemotaxis-analysesystemen, direct uit het gehele bloed. In deze richting werd de eerste all-on-chip methode ontwikkeld voor het integreren van de magnetische negatieve zuivering van neutrofielen en de chemotaxis assay uit kleine bloedvolume monsters. Deze nieuwe methode maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle neutrofiele chemotaxis-test te testen. In dit document bieden we gedetailleerde constructie, werking en data analyse methode voor deze all-on-chip chemotaxis assay met een discussie over probleemoplossing strategieën, limiTations en toekomstige richtingen. Representatieve resultaten van de neutrofiele chemotaxis-test die een gedefinieerde chemoattractant, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) en sputum van een patiënt met chronische obstructieve longziekte (COPD) testen met behulp van deze all-on-chip methode, worden getest. Deze methode is van toepassing op veel cel migratie gerelateerde onderzoeken en klinische toepassingen.

Neutrofielen worden negatief gekozen uit een druppel volbloed direct in het microfluïdische apparaat. De zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen werd geverifieerd door on-chip Giemsa-kleuring en de resultaten lieten de typische ringvormige en lobe-vormige kernen van neutrofielen zien ( Figuur 2A ) 25 . Dit duidt op een effectieve on-chip neutrofiele isolatie met een hoge zuiverheid uit een klein volume volbloed. Bovendien kan de do...

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te demonstreren om neutrofielen te scheiden van een druppel volbloed en vervolgens een chemotaxistest uit te voeren met behulp van een enkele microfluïdische inrichting. Deze methode biedt onze code om een neutrofiele chemotaxistest uit te voeren met behulp van een kleine hoeveelheid volbloed. En kan eenvoudig worden toegepast door onderzoekers om biologische vragen te beantwoorden die betrekking hebben op immuuncellmigratie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de integratie van onze chemotaxistest op een enkele microfluïdische inrichting. Dit maakt assemblage en analyse mogelijk binnen 25 minuten. Om te beginnen, bereidt u de master maldus voor zoals beschreven in het begeleidende tekstprotocol.Vervolgens silaniseert u het oppervlak van de SU8-mal om de afgifte van PDMS van de mal te vergemakkelijken. Meng vervolgens 40 gram PDMS-basis en vier gram draaggemaak in een plastic beker. Plaats de voorbereide SU8-mastermal in een petrischaal en giet de gemengde PDMS-oplossing voorzichtig op de mal.Plaats de petrischaal in een desiccator en breng een vacuüm aan om de PDMS-oplossing gedurende 20 minuten te ontgassen. Plaats vervolgens de petrischaal in een oven en laat de PDMS gedurende twee uur bij 80 graden Celsius uitharden. Na het bakken, snijdt en verwijdert u voorzichtig de PDMS-plaat uit de SU8-mal.Snijd de PDMS-plaat om deze in afzonderlijke inrichtingen te scheiden. Trim de PDMS-inrichting om twee wanden rond de cel-laadpoort te maken voor het vasthouden van de magneten. Boor vervolgens de cel-laadpoort uit met behulp van een pons met een diameter van drie millimeter.Wissel vervolgens naar een pons van zes millimeter en verwijder de chemische inlaat reservoirs in de afvaluitlaat. Verwijder het stof op het oppervlak van de PDMS-plaat met behulp van een stuk plakband. Plaats de schone plaat in een schone glazen plaat in de plasmamachine.Breng het vacuüm gedurende drie minuten aan. Schakel vervolgens de plasmavoeding in en stel het niveau op hoog. Pas voorzichtig de luchtklep aan en behandel de PDMS en de glazen plaat gedurende drie minuten met plasma.Wanneer u klaar bent, schakel de plasmavoeding uit en laat het vacuüm los. Haal voorzichtig de PDMS-plaat in de glazen plaat met behulp van een pincet, plaats de PDMS-plaat onmiddellijk bovenop de glazen plaat, met de kanaalstructuren naar beneden en druk de PDMS-plaat voorzichtig aan om deze aan het glas te hechten en vul vervolgens onmiddellijk het microfluïdische kanaal met gedeïoniseerd water. De PDMS werd over het algemeen op het glazen substraat gedrukt om in de put in het barrièrekanaal te voorkomen.Verwijder het gedeïoniseerd water uit de inrichting en voeg 100 microliters Fribronectin-oplossing toe vanaf de uitlaat. Wacht drie minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen gevuld zijn met fibronectine-oplossing. Bewaar vervolgens de inrichting in een afgedekte petrischaal gedurende een uur bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de fibronectin-oplossing uit de inrichting en voeg 100 microliters migratiemedium toe vanaf de uitlaat. Wacht weer drie minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen gevuld zijn met het migratiemedium. Bewaar de inrichting nog een uur bij kamertemperatuur voordat u de inrichting in het chemotaxisexperiment gebruikt.Plaats tien microliters volbloed in een buis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens twee microliters van het antilichaamcocktail toe. En twee microliters magnetische deeltjes uit een neutrofiel isolatiekit en meng de buis voorzichtig om de antilichaam-gelabelde cellen magnetisch te markeren.Bewaar de labelmix gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Bevestig vervolgens twee kleine magnetische schijven aan de twee zijden van de cel-laadpoort van de inrichting. Zuig het medium uit alle poorten van de inrichting op.Pipetteer vervolgens langzaam twee microliters van de gelabelde bloedmix in de microfluïdische inrichting vanaf de cel-laadpoort. Plaats de microfluïdische inrichting op de temperatuur gecontroleerde microscoopstandaard bij 37 graden Celsius. Wacht een paar minuten tot er voldoende neutrofielen vastzitten in het celdockinggebied.Voeg vervolgens 100 microliters van de chemoattractantoplossing en 100 microliters migratiemedium toe aan hun aangewezen inlaat reservoirs met behulp van twee pipetten. Dit zal een chemoattracterende gradiënt genereren door continue laminaire stroming op basis van chemische menging. De chemoattractant kan recombinante eiwitten zoals FMLP zijn of een klinisch monster zoals het supernatant van sputum van patiënten met COPD.Zodra de stroming is gestabiliseerd, verkrijgt u fluorescentiebeelden van de FitZ dextron gradiënt in het kanaal. Bewaar vervolgens de inrichting op de temperatuur gecontroleerde microscoopstandaard of in een conventionele celcultuurincubator gedurende 15 minuten. Na incubatie, beeld het gradiëntkanaal af met behulp van een tienvoudig objectief om de uiteindelijke posities van de cellen te registreren voor data-analyse.Neutrofielen worden negatief geselecteerd uit een druppel volbloed direct in de microfluïdische inrichting met behulp van magnetische deeltjes antilichaammarkering en een paar magneten. Om de zuiverheid van de op chip geïsoleerde neutrofielen te bevestigen, werd Giemsa-kleuring uitgevoerd. De resultaten tonen de typische ringvormige en lobvormige kernen van neutrofielen.Na celbelasting, lijnt de dockingstructuur de cellen effectief uit naast het gradiëntkanaal voordat een chemische gradiënt wordt toegepast. Wanneer blootgesteld aan een chemische gradiënt gedurende 15 minuten vindt chemotaxis plaats. En kan worden gemeten met behulp van beeldvorming.Deze resultaten tonen aan dat na 15 minuten, weinig cellen door het barrièrekanaal in het medium gecontroleerde monster kropen. Daarentegen, bewogen veel neutrofielen snel door het barrièrekanaal en migreerden ze naar een 100 nanomolaire FMLP gradiënt. Eens dit kan mailchemotaxis direct uit onze in 25 minuten.<p

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Hier presenteren we een verbeterd chemotaxis-testprotocol. Het doel van dit protocol is om de stappen en kosten van traditionele bacteriële chemotaxismethoden te verminderen en te dienen als een waardevolle bron voor het begrijpen van plant-microbe interacties.

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Leer een snelle methode voor neutrofiele chemotaxis-analyse met een microfluidische chip direct uit een bloeddruppel. Deze techniek isoleert cellen en voert assays uit in slechts 25 minuten voor immunologisch onderzoek.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Meer video's verkennen