Een multi-hole Cryovial Voorkomt bevriezen Artefacten als spierweefsel direct worden ondergedompeld in vloeibare stikstof

Het algemene doel van deze procedure is om spierweefsels te bevriezen door ze direct in vloeibare stikstof te dompelen, terwijl vriesartefacten worden geëlimineerd. Maozhang He, een student uit mijn laboratorium, zal deze procedure demonstreren samen met Yizhong Huang. Begin met het labelen van de monsteridentiteit op elk cryovial.

Bereid vervolgens de volgende apparatuur voor: een tank met vloeibare stikstof, een veiligheidsbril of een gelaatsscherm, vrieshandschoenen, een pincet van 10 centimeter en een pincet van 25 centimeter. Zorg daarnaast voor een piepschuimkoeler, plastic folie, een scalpel en A4 PVC-bandomslagen. Begin met het vullen van de koeler met vloeibare stikstof om de spierstalen voor te bereiden.

Plaats het monster binnen vijf minuten na verkrijging voorzichtig op een stuk A4 PVC-bindomslag en observeer de richting van de spiervezels. Maak vervolgens met een scalpel twee parallelle incisies door het monster in de richting van de spiervezels, met een lengte van ongeveer 3 centimeter en een onderlinge afstand van 0,6 centimeter. Trim de ingesneden spier tot een rechthoek van ongeveer 0,6 centimeter breed, 0,6 centimeter hoog en 1,5 centimeter lang.

Plaats vervolgens met een pincet van tien centimeter het monster voorzichtig op een stukje plastic folie, waarbij de longitudinale as van de ingesneden spier parallel loopt aan de lange rand van de folie. Plaats het spierweefsel in het onderste midden van een gelabelde cryovial, precies tussen de inlaatopeningen, en sluit de vial stevig af. Om het weefselmonster te bevriezen, gebruikt u een pincet van 25 centimeter om de gehele cryovial snel onder te dompelen in vloeibare stikstof, in de voorgekoelde piepschuimkoeler, en wacht u tot de vloeibare stikstof niet meer kookt.

De vloeibare stikstof moet voldoende zijn om het hele cryovial onder te dompelen, en het cryogene vial moet zich volledig onder het vloeistofniveau bevinden. Verplaats de spiermonsters naar een opslagtank met vloeibare stikstof of een vriezer van 80 °C voor langdurige bewaring. Het is belangrijk om accidenteel contact tussen de bevroren spieren en containers of instrumenten op kamertemperatuur te vermijden.

Om coupes te bereiden, wordt een cryostaat vooraf gekoeld tot een temperatuur tussen 20 °C en 22 °C. Verwijder en gooi het oude microtoommes weg en maak de messenhouder en de anti-rolplaat in de cryostaat schoon. Installeer vervolgens een nieuw microtoommes in de cryostaat en stel de snijdikte in op 8 µm.

Haal de cryovial met het spiermonster uit de vloeibare stikstoftank of uit de vriezer op -80 °C en plaats deze in vloeibare stikstof of op droogijs. Breng het monster vervolgens over naar de cryostaat en wacht 30 minuten zodat het preparaat kan equilibreren met de temperatuur van de cryostaat. Nadat het monster met OCT is ingebed, wordt het monster in de monsterhouder gemonteerd.

Snijd vervolgens coupes van acht micrometer. Monteer de coupes in het midden van een objectglas op kamertemperatuur. Plaats het objectglas onmiddellijk in een objectglasdoos.

Plaats vervolgens de doos met coupes in een vriezer op -80 °C. Laat de coupes niet op kamertemperatuur uitdrogen. Zoals hier te zien is, ontstonden er ijskristallen toen een monster van de musculus longissimus dorsi van varkens direct in een vriezer op -80 °C werd geplaatst, wat leidde tot het bekende "Swiss cheese"-effect in de cryosneden van de spier.

Er ontstonden ook ijskristallen wanneer het spierweefsel direct in vloeibare stikstof werd ondergedompeld. Met een andere methode vormden zich veel naaldvormige ijskristallen in het cytoplasmatische compartiment van de myofibers wanneer het weefsel in de juiste oriëntatie in OCT-montagemedium werd gedoopt en vervolgens snel werd ingevroren in een suspensie van isopentaan. Het invriezen van het weefsel in de cryovial met meerdere openingen zorgt voor een uitstekende integriteit van het specimen, met een duidelijk zichtbaar cytoplasmatisch compartiment en een nauwe aansluiting van de myofibers op het omliggende weefsel.

Met deze methode werd de ATPase-activiteit geanalyseerd in snel samentrekkende en traag samentrekkende spiervezels. Bij gelijke incubatietijden kleuren snel samentrekkende vezels licht, met twee gradaties, terwijl traag samentrekkende vezels zwart kleuren. In de hier getoonde standaardvriesmethode werd het spierweefsel ondergedompeld in een slurry van isopentaan zonder direct contact met het OCT-inbeddingsmedium; een vaste-vloeistof slurry-toestand van isopentaan is echter moeilijk langer dan een uur in stand te houden, en isopentaan is niet altijd beschikbaar.