Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken
2 mei 2017
We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de lever en mesenteriale lymfeknopen (MLN) bij makaken waarmee verhoogde bemonsteringsfrequentie, en vermindert de kans op operatieve complicaties in vergelijking met het uitvoeren van een laparotomie.
Het algemene doel van deze minimaal invasieve laparoscopische procedure is om de beoordeling van de effecten van microbiële translocatie uit het maagdarmkanaal te verbeteren door het verzamelen van mesenteriale lymfeklieren en leverbiopsieën op meerdere tijdstippen, terwijl het welzijn van dieren wordt verbeterd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van HIV-biologie over de immunologische gevolgen van infectie en microbiële translocatie op de mesenteriale lymfeklieren en de lever, en de pathologie van deze weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om op meerdere tijdstippen in een onderzoek te bemonsteren met minimale invloed op het dier of op de parameters die worden geëvalueerd.
Deze methode kan monsters leveren die essentieel zijn om ons begrip van HIV te bevorderen. Het kan ook worden toegepast op andere modellen waarbij GI-ontsteking en microbiële translocatie belangrijk zijn. De procedure zal worden uitgevoerd door Dr.Jeremy Smedley en Dr.Cassie Moats, veterinaire chirurgen bij het Washington National Primate Research Center.
Nadat een makaak is voorbereid voor de operatie zoals aangegeven in het tekstprotocol, bedek deze met een steriele geperforeerde doek. Bedek vervolgens met een steriele cameradoek de digitale camera stevig en sluit deze aan op de toren. Verbind de starre scope met de camerakop.
Bevestig vervolgens een steriele lichtkabel aan de starre scope en sluit deze aan op de lichtbron. Monteer ten slotte een steriele insufflatiebuis op de insufflatieapparaat. Om de laparoscopie te beginnen, plaats een 15 scalpelblad ongeveer één tot twee centimeter links van de navel en maak een ongeveer 5 millimeter lange snede in de huid die de buikspieren bereikt.
Til met de niet-dominante hand de buikwand op de craniale kant van de snede op. Gebruik vervolgens de andere hand om door de incisie de punt van een varusnaald naar de kop van het dier te richten. Houd de varusnaald bij de schacht vast en duw deze stevig totdat deze door de buikwand klikt en de weerstand tegen de naald in de buikholte afneemt.
Bevestig vervolgens de buis van de CO2-insufflatieapparaat aan de naald en open de stopkraan om het gas in de buikholte vrij te geven. Creëer een pneumoperitoneum door de druk op te bouwen tot 10 tot 12 millimeter kwik. Nu de buik volledig is opgeblazen, plaats de 15 scalpelblad over de linker craniale buik, ongeveer twee tot vier centimeter caudaal van de laatste rib, en maak een ongeveer vijf tot zeven millimeter lange huidsnede.
Breng vervolgens door de snede een vijf millimeter trocar canuleassemblage in. Breng de assemblage naar een diepte van één tot twee centimeter, gericht op ongeveer 45 tot 60 graden caudomediaal. Schuif vervolgens met een roterende beweging de canule naar voren tot een diepte van 1,5 tot drie centimeter om de canule in de buik te schroeven.
Verwijder vervolgens de trocar. Koppel de insufflatiebuis van de varusnaald en draai daarna de stopkraan uit. Verbind de buis met de canule en open de stopkraan om het pneumoperitoneum te behouden.
Zodra is geverifieerd dat de druk succesvol wordt gehandhaafd, verwijder de varusnaald. Breng vervolgens door de canule de starre scope in de buikholte. Onder controle van de camera verdiept u de huidsnede die overblijft na verwijdering van de varusnaald, door de buikspieren en het buikvlies te snijden.
Positioneer ten slotte het dier met de voeten verhoogd op ongeveer 15 tot 30 graden boven het hoofd. Om een biopsie van de mesenteriale lymfeklier te verzamelen, introduceert u een solide sonde in de buikholte via de voorbereide incisie. Plaats de sonde tussen het omentum en het darm en maakt met een zachte zwaaiende beweging het darm zichtbaar van het omentum om de mezenterie te visualiseren die daaronder verborgen is.
Blijf de sonde van caudaal naar craniaal bewegen om het omentum weg te duwen van het operatieveld. Gebruik vervolgens de sonde om de aflopende dikke darm naar de buikwand te bewegen. Onderzoek de mezenterie met de sonde om mesenteriale lymfeklieren te lokaliseren die langs de dikke darm en mesenteriale vaten zijn gepositioneerd.
Zodra de lymfeklier is geïdentificeerd, vervang de sonde in de buikholte met Maryland-ratelklauwen en pak de mezenterie naast de klier vast. Trek de mezenterie naar de incisie en verwijder de scope uit de canule. Draai vervolgens de insufflatieapparaat uit en laat de stopkraan van de canule open staan om gas uit de buik te laten ontsnappen, wat de buitenkomst van de mezenterie zal vergemakkelijken.
Trek vervolgens de mezenterie door de incisie. Grijp de geëxterioriseerde mezenterie met tang om toegang via de incisie te garanderen. Palpeer of observeer de mezenterie om de lymfeklier te identificeren die zichtbaar zou moeten zijn als een stevigere knobbel of een grijzer gebied.
Maak vervolgens met behulp van gebogen hemostatische klemmen een opening van drie tot vijf millimeter in de mezenterie naast de klier en verwijder op een stompe manier alle aanhechtingen aan het weefsel. Indien nodig, bind het vaatstelsel met een 4-0 niet-absorbeerbare monofilamentdraad af en verwijder de lymfeklier met behulp van het scalpel. Plaats vervolgens de biopsie in RPMI 1640-medium op ijs.
Ten slotte moet worden gecontroleerd of er geen bloeding wordt waargenomen op de plaats van de biopsie en worden de incisies gesloten. Hier worden celopbrengsten weergegeven die zijn verkregen uit mesenteriale lymfeklieren en leverbiopsieën die zijn verzameld van twee gezonde vrouwelijke makaken op twee verschillende tijdstippen. Zoals verwacht, leverden de lymfklierbiopsieën een significant hoger aantal geïsoleerde cellen op in vergelijking met de leverbiopsieën.
Ongeacht de weefselbron was meer dan 85% van de geïsoleerde cellen levensvatbaar. De geïsoleerde celmonsters werden vervolgens geanalyseerd op CD45+ leukocyten en CD45+CD3+ lymfocytcellen. Mesenteriale lymfeklieren hadden grotere frequenties van CD45+ leukocyte
Overzicht
Dit artikel beschrijft een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële bemonstering van lever- en mesenteriale lymfeklieren bij makaken. Deze methode verhoogt de bemonsteringsfrequentie terwijl chirurgische complicaties worden geminimaliseerd in vergelijking met een traditionele laparotomie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microbiële translocatie
- HIV-biologie
Achtergrond
- Microbiële translocatie vanuit het maagdarmkanaal kan invloed hebben op immunologische responsen.
- Inzicht in de effecten op de mesenteriale lymfeklieren en de lever is cruciaal voor HIV-onderzoek.
- Traditionele chirurgische methoden kunnen hogere risico's inhouden voor het dierenwelzijn.
- Deze techniek is erop gericht de frequentie van bemonstering te verhogen met een verminderde impact op de proefpersonen.
Doel van de studie
- Om de beoordeling van de effecten van microbiële translocatie te verbeteren.
- Om het dierenwelzijn tijdens onderzoeksprocedures te verbeteren.
- Om cruciale monsters te verkrijgen voor het begrijpen van de HIV-pathologie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de makaak voor laparoscopische chirurgie.
- Creëren van een pneumoperitoneum voor abdominale toegang.
- Afname van biopten van de mesenteriële lymfeklieren en de lever.
- Toepassing van steriele technieken om het infectierisico te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt meerdere bemonsteringspunten mogelijk met minimale stress voor het dier.
- Succesvolle afname van lymfeklier- en leverbiopten is bereikt.
- Verbeterd inzicht in de immunologische gevolgen van een HIV-infectie.
Conclusies
- Deze laparoscopische methode is effectief voor het bestuderen van microbiële translocatie.
- Het biedt een veiliger alternatief voor traditionele chirurgische methoden.
- De techniek kan worden aangepast voor andere onderzoekmodellen met gastro-intestinale inflammatie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Seriële longitudinale bemonstering van primaire locaties van HIV-replicatie en immuunrespons in niet-menselijke primaatmodellen maakt mechanische risicoreductie mogelijk voor therapeutische interventies die zich richten op virale reservoirs en microbiële translocatie. Deze minimaal invasieve laparoscopische techniek verbetert het voorspellende vertrouwen door herhaalde weefselafname uit de lever en mesenteriale lymfeklieren mogelijk te maken zonder storend chirurgisch trauma of systemische inflammatie. De aanpak ondersteunt de translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door ziekte-relevante systemen te bieden voor het evalueren van de effecten van interventies op immunologische compartimenten die kritiek zijn voor de HIV-pathogenese.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot de vestiging en klaring van virale reservoirs in anatomisch verschillende lymfoïde en hepatische compartimenten.
- Operationele waarde: Biedt biologisch gede-riskte targetvalidatie door middel van herhaalde bemonstering van mesenteriële lymfeklieren en de lever om de immunologische gevolgen van infectie en microbiële translocatie te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het opleveren van longitudinale gegevens over leukocyten-subsets (CD45+, CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD20+) om weefselspecifieke immuundynamiek te correleren met interventieresultaten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor (primaire lymfocyten en leukocyten uit MLN en lever) voor downstream functionele assays en biomarkeranalyse.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gestandaardiseerde weefselverzameling over verschillende tijdspunten mogelijk met behulp van identieke poortlocaties, waardoor procedurele variabiliteit in cellulaire opbrengst en viabiliteitsmetrieken wordt verminderd (>85% viabiliteit over de weefsels).
- Kwantitatieve output: Genereert vergelijkbare cellulaire opbrengsten en subsetfrequenties tussen lymfeklier- en leverbiopten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of interventies mogelijk maakt in preklinische screeningscascades.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Monsters van primaire locaties van vroege hiv-replicatie en immuunrespons (mesenteriële lymfeklieren en lever) om de menselijke immunologische gevolgen van microbiële translocatie te modelleren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door seriële weefselmonsters te leveren die dynamische veranderingen in leukocytpopulaties tijdens infectie en interventie weerspiegelen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Faciliteert go/no-go-beslissingen door weefselspecifieke immunologische readouts (bijv. CD3+ T-celverrijking in MLN, CD14+ leukocytverrijking in de lever) te koppelen aan mechanistische routes die de pathogenese aansturen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De techniek is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, ter ondersteuning van de iteratieve evaluatie van interventies die effect hebben op lymfoïde en hepatische compartimenten geassocieerd met het maag-darmstelsel.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing naar de effecten van microbiële translocatie door seriële collectie van mesenteriale lymfeklieren en lever mogelijk te maken, om zo pathway-activatie en de migratie van immuuncellen te verduidelijken.
- Screening: Levert assay-klare weefselmonsters via reproduceerbare isolatieprocedures, wat zorgt voor een consistente input voor functionele en fenotypische screening van therapeutische kandidaten.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van leukocyten-subsets (CD45+, CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD20+) die vergelijking tussen condities en statistische evaluatie van de impact van interventies mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen uit de discovery-fase met preklinische validatie via longitudinale monsterneming die een spiegel vormt voor klinische monitoring van reservoirdynamiek en immuunreconstitutie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare laparoscopische capaciteit voor seriële weefselmonsterneming over meerdere studiearmen en tijdspunten, waardoor de procedurele belasting per dier wordt verminderd en de schaalbaarheid van het onderzoek wordt vergroot.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe, herhaalde beoordeling van immunologisch verschillende weefsels die betrokken zijn bij de pathogenese van HIV.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gebruik te maken van dezelfde twee poortlocaties voor seriële bemonstering, waardoor inter-sessievariabiliteit en dierspecifieke confounders worden geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie en vermindert biologische risico's in een laat stadium door vroegtijdige detectie van ineffectieve interventies mogelijk te maken via longitudinale weefselgebaseerde biomarkers.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door longitudinale datasets te genereren over weefselspecifieke immuunpopulaties, die beslissingen over verdere ontwikkeling informeren op basis van mechanistische risicoreductie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in laparoscopische chirurgische technieken en veterinaire anesthesie voor niet-menselijke primaatmodellen.
- Afhankelijk van insufflatieapparatuur, rigide scopes, steriele instrumentcannules en biopsietangen voor weefselverzameling.
- Vereist gestandaardiseerde training voor chirurgische en onderzoeksteams om consistente pneumoperitoneumniveaus (10–12 mmHg) en protocollen voor weefselverwerking te handhaven.
- Aanpassingen zijn noodzakelijk voor dieren met aanzienlijk mesenteriaal vet, wat de lymfeklieren kan maskeren en de procedurele complexiteit kan verhogen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van postoperatieve monitoring om de genezing van de incisies en het herstel van het dier te waarborgen, hoewel de incisies minimaal zijn en doorgaans snel genezen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-surgical Preparation
1:49
Laparoscopic Entry and Cannula Placement
4:17
Mesenteric Lymph Node Biopsy
6:38
Liver Biopsy
7:53
Results: Identification of Leukocyte and Lymphocyte Populations in Mesenteric Lymph Node and Liver Biopsies
9:24
Conclusion
