Name: Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële biopsie van lever en mesenteriale lymfeklieren bij makaken. Deze methode verbetert dierenwelzijn en ondersteunt HIV-onderzoek naar microbiële translocatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie ​​nummer P51OD010425.

<html> De dieren werden gehuisvest en verzorgd in Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALACi) erkende voorzieningen, en alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Washington en goedgekeurd Washington National Primate Research Center. 1. Chirurgische Voorbereiding, anesthesie en analgesie <ol><li> Sedatie en inductie <ol><li> Sedate van makaak met een intramusculaire injectie van 10 mg / kg ketamine en 0,015 mg / kg dexmedetomidine (gecombineerd in een spuit). Waarborgen zonder terugtrekking reflexen voorafgaand aan verwijdering uit de kooi. </li><li> Intuberen het dier en het dier in een vlak van algemene anesthesie via isofluraan (1,0-2,5%) en 100% zuurstof. Zie referenties voor meer informatie over intubatie en algemene anesthesie bij makaken 17,ref &quot;&gt; 18, 19. </li></ol></li><li> Anesthesie Ondersteuning en Monitoring <ol><li> Plaats een perifeer veneuze katheter en bieden isotone intraveneuze vloeistoffen (zoals lactaat Ringers oplossing) met een snelheid van 5 ml / kg / uur gedurende anesthesie en chirurgie. Breng een steriel oog smeermiddel aan het hoornvlies uitdroging te voorkomen. </li><li> Analgesie verschaffen, zoals een vertraagde afgifte van buprenorfine (0,2 mg / kg, subcutaan). Opmerking: Een NSAID (zoals meloxicam of ketoprofen) kan ook worden verschaft tijdens anesthesie herstel, mits het experimentele protocol maakt NSAID toediening en dier normotensieve en goed gehydrateerd tijdens anesthesie. </li><li> Monitoren anesthesie diepte (bijv kaak toon), hartslag, ademhalingssnelheid, ECG, bloeddruk, hartslag oxygenatie, eindtidale CO2 en lichaamstemperatuur gedurende anesthesie en chirurgie. OPMERKING: Wanneer de buik wordt ingeblazen, mag het dier hypoventilate.Bieden mechanische ventilatie wanneer ademhaling afneemt, of eindtidale CO2 niveaus boven 45 mmHg. </li><li> Na de operatie toedienen atipamezol (0,15 mg / kg, intramusculair) voor dexmedetomidine omkering. </li></ol></li><li> chirurgische Voorbereiding <ol><li> Voeren meerdere warm water klysma&#39;s om het volume van de ontlasting te verminderen in de colon te visualiseren en intestinale manipulatie steun 20 tijdens de procedure. </li><li> Gebruik tondeuse met een nummer 40 blad om haar van het chirurgische veld te verwijderen. Scheren van de ribben nok aan het schaambeen en van links naar rechts flank. </li><li> Aseptisch bereiden het operatiegebied met behulp van geschikte antiseptica, zoals afwisselende chloorhexidine-alcohol of povidon-jodium-alcohol scrubs. </li><li> Positioneer het dier op de operatietafel op zijn dorsum, onder een hoek halverwege tussen rug- en rechter laterale decubitus. Bind de armen en benen met touw in een uitgestrekte positie. Zorg voor een laatste chlorhexieten en alcohol prep wanneer het dier beweegt naar de operatiekamer en gepositioneerd voor chirurgie. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgie Opmerking: Voor nadere informatie laparoscopie kleine dieren, zie referentie 21. <ol><li> Laparoscopische instrument Bereiding <ol><li> Draperen het dier met een steriele doek met opening. </li><li> Met de hulp van een niet-steriele assistent, wikkel de digitale camera met de steriele camera laken en sluit de kabel aan op de toren. Bevestig de stijve ruimte om de camerakop. </li><li> Bevestig de steriele lichtkabel de stijve reikwijdte en sluit de kabel aan de lichtbron. Witbalans van de camera volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Bevestig de steriele insufflator slang aan op de insufflator. </li></ol></li><li> laparoscopische Entry <ol><li> Met behulp van een # 15 scalpel, maak een ~ 5 mm incisie door de huid om de diepte van de buikspieren, approximately 1-2 cm links van de navel. </li><li> Met behulp van de niet-dominante hand, til de buikwand craniaal van de plaats van de incisie. De dominante hand, plaats het uiteinde van de Veress naald door de incisie en de hoek de punt craniaal. OPMERKING: De penetratiehoek van de Veress naald is afhankelijk van de conditiescore van het dier. Bijvoorbeeld in een dikke dier, de Veress naald moet nagenoeg loodrecht op de buikwand te voegen. In een dunne, dient de toepassing Veress naald craniaal worden gedraaid om het risico van contact brengen van de ingewanden te verminderen. <ol><li> Die de as (niet de naaf) van de Veress naald, duw de naald door de buikwand dringen in de buikholte. Een duidelijke &quot;klik&quot; en een afname van de weerstand wordt gevoeld als de scherpe punt penetreert het peritoneum en de stompe punt van de Veress naaldveren voren in de buikholte. LET OP: Als de naald passeert op de juiste wijze in de te buikholte, zal er weinig weerstand wanneer deze wordt voortbewogen en teruggetrokken 1-2 cm. </li></ol></li><li> Sluit de CO2 insufflator slang aan de naald en open de kraan. Breng het abdomen tot niet meer dan 10-12 mmHg om een ​​pneumoperitoneum te creëren. LET OP: De buik is ideaal inblazen bereikt als het symmetrisch is uitgebreid en er is een verlies van de normale scherpe contouren van de ribben marges. De druk moet voldoende ruimte voor het insteken van de canule / trocar verschaffen zonder risico met de ingewanden. </li></ol></li><li> canule Placement <ol><li> Zodra de buik volledig is opgeblazen, maken ~ 5-7 mm incisie met een # 15 scalpel door de huid van de linker craniale buik om de buikspieren ~ 2-4 cm caudaal van de rib. </li><li> Plaats een 5 mm trocar-canule samenstel door de huid incisie en de hoek het ~ 45-60 graden caudomedially. Doordringen in de buikholte op een diepte van 1-2 cm. screw de schroefdraad canule in de buik door rotatie van de canule (~ 0,5-1 cm verder) tot een diepte van 1,5-3 cm, en verwijder de trocar. </li><li> Verwijder het insufflator slang van de Veress naald, zet de kraan en verwijder de naald. Sluit de insufflator slang aan op de canule en open de kraan naar een pneumoperitoneum te handhaven op niet meer dan 10 - 12 mmHg. </li><li> Steek de stijve toepassingsgebied door de canule en in de buikholte. </li><li> Onder camera visualisatie, blijft een kleine incisie met een # 15 scalpel door de buikspieren en peritoneum bij het vorige huidincisie voor Veress naaldinbrenging. De camera wordt gebruikt om de buikzijde van de incisie visualiseren vaten vermijden en bloeden minimaliseren. OPMERKING: Controleer de incisie door de spier en peritoneum groot opneming van de sonde en uittreding van het mesenterium (-0,5 cm) te vergemakkelijken. Een grotere incisie vereist om mesent exterioriserenery bij dieren met overmatige mesenteriale vet. </li><li> Leg het dier in de Trendelenburg 21 aan de voeten verhoogd ongeveer 15-30 graden boven het hoofd. Dit is optioneel, maar kan gemakkelijker toegang tot mesenteriale lymfeklieren van de dikke darm, zoals de kleine darmkanaal toelaten zal verhuizen naar een meer craniale positie. </li></ol></li><li> Mesenteriale lymfklierbiopsie <ol><li> Onder visualisatie camera, steekt een vaste sonde door de abdominale incisie in stap 2.3.5. </li><li> Plaats de probe tussen de omentum en darmen en gebruik een vegende beweging zachtjes vegen het omentum van de darm visualisatie van de onderliggende mesenterium mogelijk. Doorgaan met de zwaaiende beweging gebruiken uit de caudaal van craniale buik. Het omentum kan de juiste craniale abdomen geplaatst zodat het uit het operatiegebied. </li><li> Met de probe met de dalende colon beweegt naar links of rechts buikwand. Dit zal een betere visualisatie van t toestaanhij mesenterium om te helpen bij de zoektocht naar mesenterische lymfeklieren. </li><li> Gebruik de sonde te vegen door het mesenterium naar de mesenterische lymfeklieren langs de dikke darm en mesenteriale vaten te lokaliseren. LET OP: de dikke darm knooppunten langs de mesenteriale grens van de dikke darm, kan links koliek knooppunten worden gevonden bij de afslag punten van de vaten, en de inferieure mesenteriale knopen zijn te vinden langs de inferieure mesenterische vaten. Mesenterische lymfeknopen zijn goed zichtbaar in magere dieren. Wanneer begraven in mesenteriale vet zullen ze vaak geven een iets verhoogd, glinsterende verschijning aan de bovenliggende mesenterium en kunnen meer een meer grijsachtige bruine kleur dan omliggende mesenteriale vet. Bovendien mesenterische lymfeknopen neiging langs lymfevaten en mesenteriale vasculatuur te liggen. </li><li> Zodra een lymfeknoop geïdentificeerd, verwijder de sonde en steek de ratcheted Maryland pincet in de buikholte. Met de tang om het mesenterium grijpen nabij het doelknooppunt. Trek het mesenterium naar de inciSion, en verwijder de reikwijdte van de canule. </li><li> Schakel de insufflator en laat de canule kraantje open naar de buik drukloos om uittreding van het mesenterium vergemakkelijken. Trek het mesenterium buiten het lichaam via de incisie. Eenmaal buiten gebracht, pakt het mesenterium met gebogen mosquito hemostats of pincet om toegang te krijgen door de incisie te waarborgen. </li><li> Identificeer de lymfklier (en) binnen de geëxterioriseerde mesenterium door palperen van de steviger lymfeknoop en / of directe visualisatie van de grijzere kleur of nodulaire uiterlijk van de lymfeklier. <ol><li> Eenmaal geïdentificeerd, een kleine opening (~ 3-5 mm) in het mesenterium nabij het knooppunt via gebogen hemostats. Gratis bijlagen bij het mesenterium met behulp van stompe dissectie met de gebogen hemostats. Afbinden het vaatstelsel met 4-0 nietabsorbeerbare monofilamenthechtdraad als dat nodig is. Gebruik scherpe dissectie met een scalpel om de lymfeknoop verwijderd. Plaats de knooppunten in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium opijs. </li></ol></li><li> Onderzoek de geëxterioriseerde mesentery voor bloeden. Als bloeden wordt opgemerkt passende hemostase door afsluiten van de vaten met hemostats of ligaturen (4-0 nietabsorbeerbare monofilamenthechtdraad), of door middel van cauterisatie. Laat het mesenterium en insufflate de buik naar 10-12 mmHg om het mesenterium terugkeren naar de buikholte. </li><li> Herhaal de stappen 2.4.1 tot 2.4.8 om extra lymfknoopbiopsies verkrijgen. </li></ol></li><li> leverbiopsie <ol><li> Terug naar de tafel horizontaal. </li><li> Plaats een schroefdraad canule in de buik door de incisie eerder voor lymfklierbiopsie verzameling (incisie gemaakt in stap 2.3.5). Zorgen de insnijding groot genoeg is (~ 5-7 mm) mogelijk te maken canule plaatsing zonder trocar inbrengen. Steek de starre bereik door deze canule naar de schedelholte buikholte en breng de craniale abdomen en de lever. </li><li> Onder camera visualisatie, plaatst de biopsie forceps door de canule eerder geplaatste in de linker craniale abdomen (incisie gemaakt in stap 2.3.1). </li><li> Lever biopsieën, plaatst de biopsietang onder de geselecteerde leverkwab marge met het beweegbare deel van de kaak tegenover de lever, opent de forceps en laat de marge te vallen in de open kaken. Verzekeren dat er geen omentum tussen de lever en de biopsietang. Pas de positie van de tang en sluit het instrument via gewenste monstergebied. <ol><li> Handhaaf druk gedurende ongeveer 20-30 s hemostase te verzekeren. Met de tang gesloten, verwijdert het monster door voorzichtig aan de tang omhoog door de canule. Dit zal voorzichtig scheur de biopsie van de lever. Plaats leverbiopsieën in RPMI 1640 medium op ijs. OPMERKING: De leverbiopsie grootte ongeveer 5 mm x 2 mm x 2 mm met behulp van 5 mm biopsietang. </li></ol></li><li> Onderzoek de biopsie site voor bloeding met behulp van camera visualisatie. Als bloeding wordt waargenomen, plaats een zoutoplossing moistened steriel wattenstaafje door de canule en druk uit op de biopsieplaats. Alternatief pack de biopsieplaatsen met steriele gel foam hemostase bevorderen. </li><li> Herhaal de stappen 2.5.3 tot 2.5.5 om extra lever biopten te verkrijgen. OPMERKING: Hier, 3 biopsies per dier per procedure werden verzameld, wat voldoende is voor alle daaropvolgende analyses. </li></ol></li><li> chirurgische Sluiting <ol><li> Onderzoek de buikholte bloeding. LET OP: Dit is niet gebeurd tot op heden. Indien overmatig bloeden wordt opgemerkt, bepaalt de plaats van bloeding en voldoende hemostase door druk met steriele wattenstaafjes of het gebruik van gel foam. </li><li> Schakel de insufflator en open de canule kranen. Pas lichte druk met de hand op de buik volledig drukloos de buikholte. Verwijder het canules. </li><li> Sluit elk van de buikwand insnijdingen met 1-2 eenvoudige onderbroken hechtingen per site. 4-0 absorbeerbare hechtdraad wordt aanbevolen. </li><li> Voer een splash blok door het plaatsen van 0,1-0,3 cc bupivacaine in elke incisie lokale analgesie vóór wondsluiting. </li><li> Sluit de huid met 1-2 begraven onderbroken hechtingen (4-0 absorbeerbare hechtdraad wordt aanbevolen) per site. Weefsellijm kan worden toegepast. </li></ol></li></ol> 3. Leverbiopsie Verwerking en analyse lymfocyt <ol><li> Slaan verschillende stukken van leverweefsel (ongeveer 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm groot) in cryopreservatie buizen, in een voorkeurs RNA opslagoplossing, en 10% formaline voor latere histologische en moleculaire analyses. <ol><li> Leg de resterende leverbiopsies in 50 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 1 x penicilline / streptomycine, 40 ug / ml van een in de handel verkrijgbaar collagenase oplossing, en 4 ug / ml DNAse in een steriele 250 ml plastic beker met een deksel. Roer krachtig gebruikmaking van een magnetische roerstaaf en roerplaat gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Verdeel het gedigereerde weefsel gieten. Grind het gedigereerde weefsel (uit stap 3.1.1) over twee 70 urn filters passen in twee 50 ml conische buizen in een enkele celsuspensie met het einde van een steriele 5 ml spuit. Breng het volume van beide buizen tot 50 ml in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1 x penicilline / streptomycine (R10). </li><li> Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Decanteren van het supernatans. Concentreer de cellen in een 50 ml conische buis door suspenderen cellen uit beide buizen in 5 ml en R10 samen het volledige 50 ml conische buis. Breng volume op 50 ml met behulp van R10. Aantal cellen met behulp van een hemocytometer om cellulaire opbrengst te bepalen. <ol><li> Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 1 ml R10, gelijkmatig te verdelen in twee 5 ml rondbodem polystyreenbuizen en breng het volume van elke buis 4 mL met R10, targeting voor&gt; 500.000 cellen per buisje. </li></ol></li><li> Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Schenk de supernatant en resuspendeer de celpellet in 4 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer bij 840 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. </li><li> Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul PBS langzaam door vortexen. Voeg 1,5 ul van een opgelapt worden dode cellen vlek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg de volgende onverdund oppervlaktekleuring antilichamen titers aanbevolen door de fabrikant: CD45-PerCP (kloon D058-1283), CD3-PE-CF594 (kloon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (kloon 2H7), CD4-BV605 ( kloon OKT4), CD8-BV570 (kloon RPA-T8), en CD14-BV785 (kloon M5E2). Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 4 ml PBS en centrifugeer bij 840 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in 250 gl 1% paraformaldehyde in PBS. Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Analyseer de celpopulaties met een flow cytometer als beschreven in referentie 22. </li></ol>

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>Jacobs, J. P., Braun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+genetic+gardening+of+the+intestinal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome.</a> FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).</li>
<li>Macpherson, A. J., Smith, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+lymph+nodes+at+the+center+of+immune+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy.</a> J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).</li>
<li>Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26835593">Microbiota, immunity and the liver.</a> Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).</li>
<li>Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell-host-microbe/abstract/S1931-3128(16)30442-5">The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions.</a> Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).</li>
<li>Shuai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity in the liver.</a> Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+HIV+in+gut-associated+lymphoid+tissue+despite+long-term+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy.</a> J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).</li>
<li>Horiike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+nodes+harbor+viral+reservoirs+that+cause+rebound+of+plasma+viremia+in+SIV-infected+macaques+upon+cessation+of+combined+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy.</a> Virology. 423 (2), 107-118 (2012).</li>
<li>North, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+sanctuaries+during+highly+active+antiretroviral+therapy+in+a+nonhuman+primate+model+for+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS.</a> J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).</li>
<li>Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+down-regulation+and+functional+impairment+of+SIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+lymphoid+and+mucosal+tissues+during+SIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection.</a> J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Liver+Is+a+Major+Organ+for+Clearing+Simian+Immunodeficiency+Virus+in+Rhesus+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys.</a> Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).</li>
<li>Dillon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+altered+intestinal+mucosal+microbiome+in+HIV-1+infection+is+associated+with+mucosal+and+systemic+immune+activation+and+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia.</a> Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).</li>
<li>Sandler, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+soluble+CD14+independently+predict+mortality+in+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection.</a> J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).</li>
<li>Klase, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiotic+bacteria+translocate+in+progressive+SIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).</li>
<li>Evans, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIV-induced+Translocation+of+Bacterial+Products+in+the+Liver+Mobilizes+Myeloid+Dendritic+and+Natural+Killer+Cells+Associated+With+Liver+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage.</a> J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).</li>
<li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFish%2C+R+%22Anesthesia+and+Analgesia+in+Laboratory+Animals.+2+edn%22">Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn</a>. , Elsevier. (2011).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780123693761">Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn</a>. , Academic Press. (2009).</li>
<li>Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTranquilli%2C+WJ+%22Lumb+and+Jones%27+Veterinary+Anesthesia+and+Analgesia%22">Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia</a>. , Blackwell Publishing. (2007).</li>
<li>Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. <a target="_blank" href="https://elsevier.ca/product.jsp?isbn=9781437707984">Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn</a>. , Elsevier. (2012).</li>
<li>Fransson, B. A., Mayhew, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransson%2C+BA+%22Small+Animal+Laparoscopy+and+Thoracoscopy%22">Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy</a>. , Wiley Blackwell. (2015).</li>
<li>Hensley-McBain, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Fecal+Microbial+Transplantation+on+Microbiome+and+Immunity+in+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).</li>
<li>Smedley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laparoscopic+Technique+for+Serial+Collection+of+Para-Colonic%2C+Left+Colic%2C+and+Inferior+Mesenteric+Lymph+Nodes+in+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques.</a> PLoS One. 11 (6), 0157535(2016).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+induce+both+effector+and+regulatory+T+cells+by+suppression+of+histone+deacetylases+and+regulation+of+the+mTOR-S6K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway.</a> Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%3A+cell+surface+receptor+and+differentiation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">CD14: cell surface receptor and differentiation marker.</a> Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier tonen we een minimaal invasieve techniek voor seriële collectie van MLN en leverbiopten dat een 100% succes in deze en andere dieren die niet in deze studie beschreven gehad. Verder gebruik van deze techniek bij dezelfde dieren in de tijd niet geassocieerd met enige bijwerkingen. Inderdaad zijn er geen complicaties als gevolg van het gebruik van deze techniek in andere cohorten van dieren die waren geïnfecteerd met SIV, simian / human immunodeficiency virus (SHIV) of Zika virus (ongepubliceerde gegevens) geweest. Evenzo is deze operatie succesvol gebleken, zelfs bij dieren die eerder een grote buikoperatie hadden ondergaan, en in trombocytopenische dieren (niet-gepubliceerde gegevens). We hebben aangetoond dat deze monsters kunnen worden verzameld via dezelfde twee havens door het omkeren van de camera locatie bij het overschakelen van MLN aan de lever vermijden van de behoefte aan extra incisies. Factoren die van invloed de collectie van MLN zijn eerder gerapporteerd 13. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tot vier collecties van 3 MLN en 3 leverbiopten elk zijn uitgevoerd in de tijd op de individuele dieren zonder complicaties, veranderingen in de slagingspercentages, of wijzigingen in de gegevens die zijn verzameld. Bovendien is deze laparoscopische MLN / leververzamelingskast techniek is succesvol gecombineerd met andere werkwijzen zoals het verzamelen van perifere LN, endoscopische bovenste en onderste MD biopsieën, beenmergaspiratie, cerebrospinale vloeistof verzamelen en venapunctie bij dezelfde narcose gebeurtenis waardoor uitgebreide evaluatie van virologische en immunologische responsen op seriële wijze (ongepubliceerde gegevens). De gehele procedure duurt gewoonlijk 30-45 minuten in beslag en wordt bereikt door twee -0,5 cm incisies. Bij obese dieren, kan het nodig zijn om een ​​grotere incisie (~ 1-1,5 cm) te halen MLN door en kan extra tijd in beslag nodig. Dieren met uitgebreide mesenteriale vet vereisen vaak aanzienlijke ervaring op differentiate MLN uit de omliggende vet. MLN zijn vaak te vinden langs de mesenteriale vaatstelsel en lijken vaker in de buurt van tak punten in de vaten te zijn. Een kritisch aspect van deze techniek is dat het geselecteerde MLN voldoende mobiliteit in het mesenterium wordt naar buiten gebracht door de abdominale incisie. Dientengevolge kan deze techniek niet worden gebruikt om MLN dichtbij de wortel van het mesenterium verzamelen. Als gevolg van de vergroting, is het soms makkelijker om MLN identificeren met de camera, en grijpen in de nabijheid van de MLN kan helpen bij het opsporen en identificeren van het knooppunt zodra deze is naar buiten genomen. Gebruik van de Trendelenburg positie niet altijd vereist voor MLN verzamelen, en als MLN eenvoudig terug te vinden zonder het gebruik van Trendelenburg positie kan het leverbiopten makkelijker het zal voorkomen dat de organen verschuiven craniaal te maken. Soms, na plaatsing in Trendelenburg, de lever verschoven tegen het membraan en most<html> worden voorzichtig terug op zijn plaats voorafgaand aan biopsie collectie gemanipuleerd. Als poort plaatsing voor het verzamelen MLN naar links worden leverbiopten kenmerkend uit de linker laterale en mediale linker leverlobben aangezien zij dichter bij de canule. MLN verzameld en leverbiopten voorwaarde dat voldoende celopbrengsten voor verschillende stroomafwaartse analyses en vertoonden hoge levensvatbaarheid van de verzamelde cellen. Hier werden de cellen gekleurd voor flowcytometrische analyse van leukocyten en lymfocyten populaties en belangrijkste verschillen tussen deze twee belangrijke immuunorganen opgehelderd. Zo werden de MLN sterk verrijkt op CD4 + T-cellen vergeleken met de lever, gezien het belang van de MLN als centrale punten voor het verzamelen en verspreiden van adaptieve immuunreacties, alsmede het belang van CD4 + T voor het beheren inflammatoire en tolerogene respons op het milieu antigenen afgeleid van inname en GI-resident microorganismens = &quot;xref&quot;&gt; 24. Nochtans, werd de lever aanzienlijk verrijkt op CD14 + leukocyten in vergelijking met de MLN. CD14 wordt voornamelijk tot expressie gebracht op monocyten en macrofagen en is een belangrijk onderdeel van het receptorcomplex voor bacterieel lipopolysaccharide (LPS) 25. Inderdaad, verhoogde plasmaconcentraties van oplosbaar CD14 worden geassocieerd met microbiële translocatie en immuun activatie van HIV en SIV pathogene infecties 26. Aldus hogere frequenties van CD14 + leukocyten in de lever waarschijnlijk resulteren uit een grotere bacteriële belasting in dit orgaan in vergelijking met de MLN. Hier tonen we een snelle en minimaal invasieve chirurgische techniek voor seriële collectie van MLN en de lever biopten met behulp van slechts twee kleine incisies voor laparoscopische vermelding die niet heeft geleid tot negatieve resultaten. Deze monsters een bruikbare route om belangrijke immunologische, virologische en microbiologische processen die pla nemen evaluerence in de MLN en lever, die afzonderlijke en unieke aan systemische immuniteit. Ook lever biopten zijn van cruciaal belang voor de evaluatie van de gevolgen van HIV / SIV, drug therapieën, en translocatie microben, die vaak worden gecombineerd om aanzienlijke schade aan de lever 16 induceren op lange termijn. Verder, omdat de MLN en de lever zijn immuunorganen blootgesteld aan GI microbiota, de mogelijkheid om immuniteit in deze organen in de tijd te evalueren biedt een uitstekend platform voor het begrijpen van de rol die de microbiome speelt bij het handhaven van gastheer immuun homeostase. Bij elkaar genomen, de evaluatie van de lever en MLN is van groot belang in het kader van het vaccin en therapeutische werkzaamheden, SIV virale reservoir ontruiming, en algemene mucosale immuniteit. De mogelijkheid om deze monsters te verzamelen door middel van een minimaal invasieve benadering houdt in dat er minder risico van ontsteking in verband met de procedure dan bestaat met de huidige gepubliceerde technieken en minder impact op de fysiologie van de dieren. In de futuur, zullen we het potentieel evalueren om het verzamelen van MLN en de lever met de inning van de milt combineren door middel van dezelfde twee poort locaties mogelijk te maken voor de bemonstering van een ander belangrijk en onderscheiden deel van het immuunsysteem dat is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen in een aantal ziektemodellen.

Het gastro-intestinale (GI) kanaal is het lichaam grootste mucosale oppervlak wordt blootgesteld aan een groot aantal antigenen afkomstig uit voedsel, ziekteverwekkers en endosymbiontische bacteriële gewoonlijk aangeduid als microbiome 1, 2. Mesenterische lymfeknopen (MLN) lijn het maagdarmkanaal en zijn voornaamste plaats van immuunfunctie te bevorderen ontstekings- of tolerogene reacties bij deze verschillende antigenen. De fysieke ordening van de MLN creëert een in compartimenten systeem dat kan reageren op antigenen lokaal opwekken zonder systemische responsen 3. Ook het bloed uit het spijsverteringskanaal afvoeren naar de lever via de poortader alvorens terug te keren om de bloedsomloop, en is dus blootgesteld aan microben en microbiële producten die uit het spijsverteringskanaal hebben translocatie in de lamina propria en ging de bloedbaan 4. De lever functioneert ook als secundaire lymfe-organen eennd heeft een groot aantal immuuncellen, waaronder gespecialiseerde macrofagen, om translocatie microben 5, 6 te verwijderen. Dus de MLN en de lever het primaire immuunorganen blootgesteld aan commensale en pathogene bacteriën van het maagdarmkanaal, en het milieu van antigenen uit andere bronnen, waardoor ze uniek en belangrijk vanuit een immunologisch perspectief. De MLN zijn kritisch plaatsen voor de evaluatie van de virologische en immunologische effecten van menselijke immunodeficiency virus (HIV) of pathogene simian immunodeficiency virus (SIV) infectie, en zijn waarschijnlijk betrokken in de vroege verspreiding van SIV na intrarectale uitdaging. -Darm-geassocieerd lymfeweefsel is bekend als een belangrijke plaats van persistent HIV replicatie ondanks effectieve controle van viremie moderne antiretrovirale therapie (ART) 7. SIV infectie modellen hebben aangetoond dat MLN belangrijke reservoirs van latent virus en kande primaire reservoir 8, 9. De lever is ook belangrijk lentivirale infectie bewezen door de accumulatie van SIV specifieke CD8 + T cellen in de levers van makaken tijdens acute SIV-infectie 10. Verder is het de belangrijkste orgaan verantwoordelijk voor het opruimen van het virus uit de omloop 11. HIV en SIV-infectie zijn geassocieerd met veranderde GI microbiota, verstoord GI epitheel integriteit en verhoogde translocatie van microben en microbiële producten van de dikke darm in de perifere circulatie en 12, 13. Deze processen zijn geassocieerd met de lokale en systemische immunologische activering en verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij HIV geïnfecteerde individuen 14. SIV-infectie, zijn translocatie bacteriën waargenomen in de MLN 15, terwijl de accumulatie van micRobial producten in de lever is aangetoond dat het resulteert in ontsteking en beschadiging van het orgaan 16. Dus in de context van HIV en SIV infecties, de MLN en lever kan zeer informatief zijn voor het begrijpen van de ontstekingsprocessen aangedreven door GI-resident bacteriën. Hier presenteren we een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de MLN en lever bij niet-humane primaten (NHP&#39;s). We demonstreren succesvolle uitvoering van deze techniek op twee gezonde vrouwelijke rhesus makaken (RMS), het bemonsteren van elk dier twee keer, met 160 dagen tussen elke operatie. We gaan op deze monsters te gebruiken om zeer consistente gegevens tussen de twee tijdstippen evalueren en vergelijken sleutel leukocyten en lymfocyten populaties in elk orgaan met behulp van flowcytometrie, en demonstreren.

<table><tbody><tr><td>Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>97-890-8152</td><td></td></tr><tr><td>Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-842-6153</td><td></td></tr><tr><td>Vedco Alcohol, Isopropyl 70%</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6434</td><td></td></tr><tr><td>Vedco Vetadine Scrub</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6772</td><td></td></tr><tr><td>Hospira Lactated Ringer's 250 mL</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-800-9325</td><td></td></tr><tr><td>Adolescent Laparotomy Surgical Drape</td><td>Medline</td><td>DYNJP3004</td><td></td></tr><tr><td>Access 40 L Insufflator</td><td>Dyonics</td><td>7205832</td><td></td></tr><tr><td>300XL Xenon Light Source</td><td>Dyonics</td><td>7206084</td><td></td></tr><tr><td>460P 3 &ndash; CCD Digital Camera with Head</td><td>Dyonics</td><td>72200086</td><td></td></tr><tr><td>Universal Camera Drape, 7&rdquo; x 96&rdquo;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>ESS-6920</td><td></td></tr><tr><td>Universal Light Guide, 7.5 Ft</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>US.OU225</td><td></td></tr><tr><td>Insufflator Tubing</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>TM-102</td><td></td></tr><tr><td>Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B30-0007-00</td><td></td></tr><tr><td>Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B10-0025-00</td><td></td></tr><tr><td>Rigid scope, 5 mm x 300 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B30-0071-00</td><td></td></tr><tr><td>Veress Needle, 2 mm x 80 mm&nbsp;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8302.08</td><td></td></tr><tr><td>Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8383.661</td><td></td></tr><tr><td>Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm&nbsp;&nbsp;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8390.2054</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm</td><td>R. Wolf</td><td>8391.4063</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.072</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8919.333</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Tip Trocar</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.101</td><td></td></tr><tr><td>Pyramidal Tip Trocar</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.121</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USPE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30027FS</td><td>with L-Glutamine</td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>Commercially available colleganse solution</td></tr><tr><td>Dnase I from bovine pancrease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m cell strainers</td><td>Morganville Scientific</td><td>CSS0200</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round-Bottom polystyrene tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td>Amine dead cell stain</td></tr><tr><td>CD45-PerCP (clone D058-1283)</td><td>BD Biosciences</td><td>558411</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2)</td><td>BD Biosciences</td><td>562406</td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4)</td><td>Biolegend</td><td>317438</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1)</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7)</td><td>BD Biosciences</td><td>555624</td><td></td></tr><tr><td>BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td></td></tr><tr><td>16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>LSR II Flow Cytometer</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

laparoscopische techniek voor seriële verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

De mesenteriale lymfeknopen (MLN) en de lever worden blootgesteld aan microben en microbiële producten uit de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor ze immunologisch uniek. Het maagdarmkanaal en bijbehorende MLN zijn sites vroege virale replicatie in humane immunodeficiëntie virus (HIV) en het MLN waarschijnlijk belangrijk reservoir sites die latent geïnfecteerde cellen zelfs na langdurige antiretrovirale therapie (ART) haven. De lever is aangetoond dat het een belangrijke rol bij immuun responsen op lentivirussen en blijkt een belangrijke rol spelen in de klaring van het virus uit de bloedsomloop. Niet-menselijke primaten (NHP) modellen voor HIV en Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) lijken sterk op deze aspecten van HIV-infectie en periodieke longitudinale bemonstering van primaire gebieden van virale replicatie en de bijbehorende immuunresponsen bij dit model zal helpen om kritieke gebeurtenissen in infectie helderen pathogenese en de impact van verschillende interventiestrategieën op deze gebeurtenissen. Current gepubliceerde technieken lever bemonsteren en MLN samen omvatten een grote operatie en / of necropsie, die het vermogen om deze belangrijke plaatsen op seriële wijze onderzocht bij hetzelfde dier beperkt. We hebben eerder beschreven een laparoscopische techniek voor het verzamelen van MLN. We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële longitudinale bemonstering van lever en MLN door dezelfde twee poortlocaties vereist voor het verzamelen van MLN. Het gebruik van dezelfde twee poorten minimaliseert de impact op de dieren geen extra incisies nodig. Deze techniek kan worden gebruikt met een verhoogde bemonsteringsfrequentie vergeleken met een grote buikoperatie en vermindert de kans op operatieve complicaties en bijbehorende lokale en systemische ontstekingsreacties die de interpretatie van de resultaten zou kunnen bemoeilijken. Deze procedure heeft potentieel om studies met NHP modellen terwijl het verbeteren van het welzijn van dieren te bevorderen.

Methoden voor het verwerken van verzamelde laparoscopisch MLN, alsmede cellulaire opbrengst en leukocyten frequenties in deze organen zijn eerder beschreven 13. Figuur 1 toont cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid vergelijken van de MLN en leverbiopsieën verzameld op twee tijdstippen 160 dagen behalve twee gezonde vrouwelijke RM&#39;s met deze laparoscopische techniek. We vonden dat cellulaire opbrengst uit de MLN was significant hoger dan bij de lever (P = 0,0021), met een gemiddelde van 33,5 x 10 6 en 6,74 x 10 6 cellen verkregen resp. Dode cel kleuring en analyse met flowcytometrie bleek dat&gt; 90% van de cellen geïsoleerd uit beide organen levensvatbaar. cytometrie met behulp van stroom, we geëvalueerd en vergeleken de overvloed van leukocyten en lymfocyten in de MLN en de lever. Een representatieve gating schema voor de lever in <strong&gt; Figuur 2, waar we eerst gated op enkelvoudige cellen tot aggregaten uit te sluiten, gevolgd door selectie van alleen levensvatbare cellen, vervolgens selectie van CD45 + cellen, en ten slotte CD3 + cellen. Vanaf het CD3 + bevolking, evalueerden we abundanties van CD4 + en CD8 + T-cellen, terwijl we geëvalueerd dichtheden van CD14 + en CD20 + cellen van de CD3- populaties. Representatieve doorstroomcytometrie grafieken die CD45 + en CD3 + populaties van de MLN en lever van zowel dieren op dag 0 en dag 160 worden getoond in figuur 3, terwijl figuur 4 toont leukocyten en lymfocyten abundanties van beide bemonsteringen van beide dieren. De MLN toonde significant hogere dichtheden van CD45 + cellen dan wel de lever (gemiddeld 76,9% en 7,66% van de levensvatbare cellen, respectievelijk p = 0,0002). Niet verrassend, de MLN toonde significant hogere verhoudingen van CD3 + T-cellen (P0; 0,0001) en CD4 + -T-cellen (P = 0,0004). Omgekeerd werd de lever aanzienlijk verrijkt op CD14 + leukocyten vergelijking met MLN (P = 0,0036). De MLN vertoonde een hogere gemiddelde van CD8 + T-cellen, maar dit was niet significant. Verrassenderwijs deze twee dieren beide organen toonde vergelijkbare dichtheden van CD20 + B-cellen. De cellulaire opbrengsten en dichtheden van verschillende leukocyten en lymfocyten subsets van de MLN in dit onderzoek eerder bevestigd gerapporteerde waarden 23. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig1.jpg" /> Figuur 1. Het totale cellulaire opbrengst (boven) en levensvatbaarheid van de cellen (onderste) vanaf Serieel Collected MLN en leverbiopten. De MLN toonde significant hogere cel opbrengsten dan deed de lever. Echter, beide soorten monsters verschaft voldoende cellen voor downstream analyses. Cellevensvatbaarheid gemeten door flow cytometrically behulp van een fixeerbaar dode cellen amine kleuring toonde dat beide soorten monsters leverde kenmerkend&gt; 90% levensvatbaarheid van de cellen na dissociatie weefsel. Foutbalken standaardafwijking tussen monsters. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger van flowcytometrie Gating Strategy. Eerst werden geaggregeerde cellen uitgesloten, gevolgd door selectie van alleen levensvatbare cellen na kleuring met behulp van een opgelapt worden dode cel amine vlek. Vervolgens werden CD45 + leukocyten geselecteerd, gevolgd door selectie van CD3 + T-cellen. Van de CD3 + populatie, werden CD4 + en CD8 + T-cellen geanalyseerd. Vanaf het CD3 - bevolking, CD14 + en CD20 + cellen werden geanalyseerd. Thi<html> s gating strategie werd ook gebruikt voor de MLN. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig3.jpg" /> Figuur 3. Flowcytometrie Plots van MLN en lever van Twee dieren langsrichting. MLN en levermonsters werden 160 dagen na elkaar verzameld voor zowel dieren. (A). MLN CD45 + cellen (leukocyten); (B) lever CD45 + cellen (leukocyten); (C) MLN + CD3 + cellen (T-cellen); (D) Lever CD3 + cellen (T-cellen). Voor beide dieren, de MLN vertoonde grotere hoeveelheden CD45 + en CD3 + cellen vergeleken met de lever. In de tijd, de frequenties van deze populaties waren gelijk voor beide dieren.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig4.jpg" /> Figuur 4. Frequenties van CD45 + cellen (links) en diverse leukocyten en lymfocyten subpopulaties (rechts) over 23 individuele Samplings. De MLNs weergegeven aanzienlijk groter frequenties van CD45 +, CD3 + en CD4 + cellen, terwijl de lever toonde significant grotere frequentie van de CD14 + leukocyten, het aantonen van de unieke functies van elk orgaan. Foutbalken standaardafwijking tussen monsters. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de lever en mesenteriale lymfeknopen (MLN) bij makaken waarmee verhoogde bemonsteringsfrequentie, en vermindert de kans op operatieve complicaties in vergelijking met het uitvoeren van een laparotomie.

Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Het algemene doel van deze minimaal invasieve laparoscopische procedure is om de beoordeling van de effecten van microbiële translocatie vanuit het maag-darmkanaal te verbeteren door het verzamelen van mesenteriale lymfeklieren en leverbiopten op meerdere tijdstippen, terwijl het dierenwelzijn wordt bevorderd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de HIV-biologie over de immunologische gevolgen van infectie en microbiële translocatie in de mesenteriale lymfeklieren en de lever, en de pathologie van deze weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het bemonstering op meerdere tijdstippen binnen een studie mogelijk maakt met minimale impact op het dier of op de parameters die worden geëvalueerd.Deze methode kan monsters leveren die essentieel zijn voor het verdiepen van ons begrip van HIV. Het kan ook worden toegepast op andere modellen waarbij ontsteking van het maagdarmkanaal en microbiële translocatie van belang zijn. De procedure wordt uitgevoerd door Dr. Jeremy Smedley en Dr. Cassie Moats, dierenartsen aan het Washington National Primate Research Center.Nadat de makaak voor de operatie is voorbereid zoals aangegeven in het tekstprotocol, wordt het dier afgedekt met een steriel geperforeerd laken. Bedek vervolgens de digitale camera strak met een steriele camerahoes en sluit deze aan op de tower. Verbind het rigide endoscoop met de camerakop.Bevestig vervolgens een steriele lichtgeleider aan het starre endoscoop en verbind deze met de lichtbron. Plaats tot slot een steriele insufflatietube op de insufflator. Om met de laparoscopie te beginnen, positioneert u een scalpelmes van 15 ongeveer één tot twee centimeter links van de navel en maakt u een stabincisie van ongeveer 5 millimeter in de huid die tot aan de buikspieren reikt.Til met de niet-dominante hand de buikwand op aan de craniale zijde van de incisie. Voer vervolgens met de andere hand de punt van een varusnaald via de incisie in, waarbij de naald in de richting van de kop van het dier is gericht. Houd de varusnaald bij de schacht vast en duw deze stevig door tot er een klik hoorbaar is bij het doorsteken van de buikwand en de weerstand tegen de naald in de buikholte afneemt.Bevestig vervolgens de slang van de CO2-insufflator aan de naald en open de stopkraan om het gas in de buikholte te laten stromen. Creëer een pneumoperitoneum door een druk van maximaal 10 tot 12 millimeter kwik te bereiken. Nu de buikholte volledig is geïnsuffleerd, plaatst u het scalpelblad 15 over de linker kraniale buikwand, ongeveer twee tot vier centimeter caudaal van de laatste rib, en maakt u een huidincisie van ongeveer vijf tot zeven millimeter.Voer vervolgens via de incisie een trocart-cannule-set van vijf millimeter in. Breng de set tot een diepte van één tot twee centimeter in, gericht in een hoek van ongeveer 45 tot 60 graden caudomediaal. Schuif de cannule vervolgens met een draaibeweging naar voren tot een diepte van 1,5 tot drie centimeter om de cannule in de buikholte vast te schroeven.Verwijder daarna de trocart. Koppel de slang van de insufflator los van de varusnaald en draai vervolgens de stopkraan dicht. Verbind de slang met de canule en open de stopkraan om het pneumoperitoneum in stand te houden.Zodra is bevestigd dat de druk succesvol wordt gehandhaafd, wordt de varusnaald verwijderd. Voer vervolgens via de canule het rigide scope in de buikholte in. Verdiep onder controle van de camera de huidincisie die na het verwijderen van de varusnaald is overgebleven, doorheen de buikspieren en het peritoneum te snijden.Plaats tot slot het dier zodanig dat de voeten ongeveer 15 tot 30 graden boven het hoofd zijn verheven. Om een biopsie van de mesenteriale lymfeknoop te verkrijgen, wordt er via de voorbereide incisie een vaste sonde in de buikholte ingebracht. Positioneer de sonde tussen het omentum en de darmen en leg, met een zachte veegbeweging, de darmen bloot door het omentum weg te schuiven om het daaronder verborgen mesenterium zichtbaar te maken.Beweeg de probe verder in caudale naar craniale richting om het omentum uit het operatieveld te duwen. Verplaats vervolgens met de probe het colon descendens naar de buikwand. Onderzoek het mesenterium met de probe om de mesenteriële lymfeklieren te lokaliseren die langs het colon en de mesenteriële vaten liggen.Zodra de lymfeknoop is geïdentificeerd, vervangt u de probe in de buikholte door een Maryland-gekartelde pincet en pakt u het mesenterium naast de knoop vast. Trek het mesenterium richting de incisie en verwijder de scope uit de canule. Zet vervolgens de insufflator uit en laat de stopkraan van de canule openstaan om gas uit de buikholte te laten ontsnappen, wat de exteriorisatie van het mesenterium zal vergemakkelijken.Trek vervolgens het mesenterium door de incisie. Pak het geëxternaliseerde mesenterium vast met een pincet om toegang via de incisie te waarborgen. Palpeer of observeer het mesenterium om de lymfeknoop te identificeren, die zich zal presenteren als een stevigere knop of een grijzer gebied.Maak vervolgens met gebogen hemostaten een opening van drie tot vijf millimeter in het mesenterium naast de lymfeknoop en ontleed voorzichtig alle aanhechtingen aan het weefsel. Indien nodig wordt de vasculatuur afgebonden met een 4-0 niet-absorbeerbare monofilamenthechtdraad, waarna de lymfeknoop met het scalpel wordt vrijgelegd. Plaats de biopsie vervolgens in RPMI 1640-medium op ijs.Laat ten slotte het mesenterium los en insuffleer het abdomen nogmaals om het weefsel terug in de buikholte te kunnen trekken. Breng de tafel terug in een horizontale positie. Om een leverbiopsie te verkrijgen, steekt u een geschroefde canule via de incisie die voor de lymfekliervaring is gebruikt in de buikholte.Schuif vervolgens met behulp van de canule de starre endoscoop in de richting van de craniale buikholte om de lever in beeld te brengen. Voer onder cameracontrole biopsietang door de canule die eerder werd gebruikt om de buikholte op te blazen. Positioneer de tang onder de rand van de aangewezen leverkwab zodanig dat de kaken naar het weefsel zijn gericht, en open de tang zodat de rand in de kaken valt.Sluit na het aanpassen van de positie de tang en houd de druk gedurende ongeveer 20 tot 30 seconden vast. Verwijder vervolgens het monster door de tang voorzichtig door de canule te trekken. Plaats het biopsaat in RPMI-medium op ijs.Controleer tenslotte of er geen bloedingen zichtbaar zijn op de biopsieplaats en sluit de incisies. Hier worden de cellulaire opbrengsten gepresenteerd die zijn verkregen uit mesenteriële lymfekliermonsters en leverbiopsieën, verzameld van twee gezonde vrouwelijke makaakapen op twee verschillende tijdstippen. Zoals verwacht leverden de lymfeklieerbiopsieën een significant hoger aantal geïsoleerde cellen op in vergelijking met de leverbiopsieën.Ongeacht het bronweefsel was meer dan 85% van de geïsoleerde cellen levensvatbaar. Vervolgens werden de geïsoleerde celmonsters geanalyseerd op CD45+ leukocyten en CD45+CD3+ lymfocytpopulaties. Mesenteriële lymfeklieren vertoonden hogere frequenties van CD45+ leukocyten en CD3+ lymfocyten in vergelijking met cellen afkomstig uit de lever.Gedetailleerde karakterisering van de geïsoleerde populaties toonde aan dat mesenteriële lymfeklieren significant hogere proporties CD3+T-cellen en CD4+T-cellen bevatten, evenals een verhoogd aantal CD8+T-cellen. Omgekeerd was de lever significant verrijkt met CD14+leukocyten. Beide organen vertoonden vergelijkbare hoeveelheden CD20+B-cellen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 30 tot 40 minuten worden uitgevoerd. Dieren herstellen doorgaans snel van de anesthesie en zijn binnen enkele uren weer actief en aan het eten; de incisies zijn zo klein dat ze bij controle in de kooi nauwelijks zichtbaar zijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dieren in een lichaamsconditie te houden die het succes van de ingreep bevordert.Een aanzienlijke hoeveelheid mesenteriaal vet kan een uitdagend obstakel vormen, aangezien het klieren maskeert en de fragiliteit en bloedingsneiging verhoogt. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flebotomie, biopsie van perifere lymfeklieren, endoscopie van het boven- en onderste maag-darmstelsel en rectale biopsie worden uitgevoerd om systemische en mucosale immuunreacties, de status van microben en epitheliale barrières, alsook virale ladingen te evalueren. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers in ons lab microbiële populaties bij ontsteking longitudinaal onderzoeken in weefsels van makaakapen, die voorheen alleen via necropsie beschikbaar waren.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie voor hiv, aangezien microbiële translocatie een belangrijke oorzaak is van de ontsteking die de pathogenese van hiv aanstuurt. Evaluatie hiervan in een seriële reeks kan potentiële doelwitten opleveren en toelaten tot evaluatie van therapeutische interventies. Vergeet niet dat het werken met virusgeïnfecteerde makaakapen uiterst gevaarlijk kan zijn.Voorzorgsmaatregelen, zoals een adequate training voor biologische risico's waaronder macaque herpesvirus 1, passende persoonlijke beschermingsmiddelen, sets voor beet- en kraswonden en een juiste medische follow-up, dienen beschikbaar te zijn.

laparoscopic-technique-for-serial-collection-liver-mesenteric-lymph

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Om de progressie van een immuunrespons na verloop van tijd in dezelfde muis volgen, kunnen de lymfeklieren achter elkaar worden verwijderd door een operatie. Hier wordt beschreven hoe deze techniek kan worden uitgevoerd.

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

This video demonstrates the surgical isolation procedure of the inguinal draining lymph node from a mouse model. Incision of the abdominal region provides access to the inguinal lymph node, which is surgically harvested. The harvested translucent inguinal lymph node can be used for immunological studies.

Harvesting an Inguinal Draining Lymph Node from a Murine Model

This video demonstrates a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats. This method enables direct access to the entire volume of components present in the lymph fluid.

Mesenteric Lymph Duct Cannulation in a Rat Model to Harvest Lymph Fluid

Hier beschrijven we een techniek om de mesenteriale lymfevat te canuleren bij ratten, wat de kwantificering van lipiden- en geneesmiddeltransport via het lymfestelsel mogelijk maakt na intestinale toediening. De techniek kan worden aangepast om mesenteriale lymfeconcentraties en/of transport van vocht, immuuncellen, peptiden, eiwitten en lipofiele moleculen te beoordelen.

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

We presenteren een chirurgische procedure om de intestinale lymfe-lymfeklier bij neonatale varkens te kateteriseren om grote hoeveelheden componenten van het lipidenmetabolisme uit efferente lymfe te verzamelen.

Long-Term catheterisatie van de intestinale Lymfe Stam en verzamelen van lymfe in Neonatale Pigs

Marginerende leverleukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we een methode voor selectieve oogst van deze specifieke levercelpopulatie, door geforceerde perfusie van de lever van ratten of muizen. Marginerende leverleukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de vatbaarheid voor levergerelateerde ziekten en metastasen.

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerd chirurgisch protocol voor het isoleren van stromende darmlymfe als reactie op intraduodenale voedingsinfusies bij muizen. Dit maakt de fysiologische bepaling van de totale intestinale lipideabsorptie en chylomicronsynthese en -secretie mogelijk als reactie op verschillende experimentele voedingsstoffen.

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

Het gebruik van 3D-reconstructie en virtuele simulaties bij preoperatieve planning voor leverresecties vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in de chirurgische oncologie. De 3D-LAST-techniek (driedimensionale locatiebenadering met de zijdedraad) van ons team maakt veilige, efficiënte en nauwkeurige tumorverwijdering mogelijk met praktische intraoperatieve navigatie, wat een brede medische acceptatie belooft.

Driedimensionale locatiebenadering met zijdedraad geleide laparoscopische segmentectomie voor levertumor

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde muismesenteriale lymfadenectomyat van elk van vier stations langs de mesenterische lymfeklierketen. Deze procedure is aanpasbaar om selectieve verstoring van lymfecommunicatie met de distale colon, proximale dikke darm en/of dunne darm mogelijk te maken.

Muismesenteriene lymfadenectomie voor selectieve verstoring van lymfatische communicatie met regio-specifieke darmen

Dit experimentele protocol beschrijft een leverlymfebuis-gecanuleerd rattenmodel dat directe en kwantitatieve beoordeling van leverlymfatische en vaatdrainage mogelijk maakt. Het model maakt gelijktijdige bemonstering van leverlymfe en systemisch bloed mogelijk om levertransport, metabolisme en immuunsignalering te onderzoeken, ter ondersteuning van studies naar geneesmiddelfarmacokinetiek en leverspecifieke biologie.

Een uitgebreid rattenmodel voor het beoordelen van levertransportroutes door gelijktijdige lymfatische en bloedvaatbemonstering

Leer een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële biopsie van lever en mesenteriale lymfeklieren bij makaken. Deze methode verbetert dierenwelzijn en ondersteunt HIV-onderzoek naar microbiële translocatie.

Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

Meer video's verkennen