Beoordelende primaire Blast effecten In Vitro

Het algemene doel van deze methode is om representatieve schokgolven te genereren die kunnen optreden tijdens explosieven en om de impact van deze mechanische schok op de levensvatbaarheid van primaire cellen in cultuur te evalueren. Deze methode kan ons helpen sleutelvragen te beantwoorden over de reactie van individuele celtypen op hoogenergetische gebeurtenissen zoals blootstelling aan een schokgolf. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het ons in staat stelt om verschillende celreacties op een enkele schokgolf te evalueren in tegenstelling tot reacties op weefsel- of orgaanniveau.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het identificeren van de cellulaire mechanismen die veranderd zijn als gevolg van primaire explosieverwondingen, die worden veroorzaakt door blootstelling aan een schokgolf. Hoewel deze methode wordt gedemonstreerd met een specifiek celtype van belang, kunnen alle cellen worden gekweekt en in de testopstelling worden geplaatst om celspecifieke reacties op een schokgolf te beoordelen. Om te beginnen, kweek de cellijn van belang bij standaardkweek tot ze 80% confluency bereiken.

Aspeer vervolgens het medium. Was de cellen twee keer met PBS en voeg twee milliliter Trypsin-EDTA toe. Incubeer ze gedurende vijf minuten onder standaard kweekomstandigheden.

Controleer kort of de cellen succesvol zijn gedissocieerd van de flacon. Voeg vervolgens vier milliliter FBS-bevattend kweekmedium toe aan de flacon om de Trypsin te neutraliseren en breng de cellen over naar een 15-milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 200 keer g om de cellen te pellen.

Zuig vervolgens langzaam het supernatant af, zorg ervoor dat de pellet niet wordt losgemaakt. En resuspendeer de pellet in vijf milliliter medium. Plaats drie gelabelde 35-milliliter schalen in een 90-milliliter schaal.

Voeg vervolgens twee milliliter medium toe aan elke schaal en zaai ze elk met 70 duizend cellen. Incubeer de cellen een nacht lang om voldoende celhechting mogelijk te maken voordat ze worden blootgesteld aan de schokgolf. Voordat u begint met het assembleren van de schokbuis, trekt u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aan, inclusief stalen werkschoenen en een laboratoriumjas.

Begin door twee uitlijningsstaven door de boutgaten in het horizontale vlak van de uitlaatsleuf te steken. Plaats vervolgens een nitrilrubberen afdichtblad over het uiteinde van de uitlijningsstaven zodat het tussen de uitlaatsleuf en de ex vivo orgaankweekopstelling zit. Bevestig de EVOC-opstelling aan de uitlaatsleuf van de schokbuis door de bevestiging over de uitlijningsstaven te schuiven.

Zorg ervoor dat deze correct is georiënteerd zodat het gedeelte dat de petrischaal vasthoudt zich aan de basis bevindt. Plaats vervolgens vier M24-bouten en ringen in de resterende gaten en bevestig de moeren en bouten achtereenvolgens diagonaal symmetrisch vast, terwijl u visueel controleert of de EVOC-opstelling en de schokbuis succesvol zijn uitgelijnd. Bevestig vervolgens een druktransducer aan de EVOC-opstelling en verbind deze met de stroombron met behulp van een sensorkabel.

Gebruik bovendien een BNC-kabel om de stroombron te verbinden met de oscilloscoop. Zorg ervoor dat alle afsluitkleppen en stroomregelaars op de schokbuis gesloten zijn. Open vervolgens de ingebouwde externe persluchtleiding en draai de drukregelaar handmatig met de klok mee om de solenoïde op 2,5 bar op te laden.

Open de persluchtcilinder en draai vervolgens langzaam de drukregelaar met de klok mee om de druk op ongeveer 15 bar te verhogen. Bereid vervolgens diafragma's voor door een 0,125-milliliter dik plastic vel in 10 centimeter bij 10 centimeter vierkanten te snijden. Maak handvatten van plakband en bevestig ze aan de boven- en onderkant van het diafragma.

Gebruik deze om het diafragma voorzichtig naast de kleine voorflens bij de kruitkamer te plaatsen. Zorg ervoor dat het diafragma recht en correct is gepositioneerd voordat u de kruitkamer sluit. En bevestig het vervolgens op zijn plaats met behulp van vier M24-bouten en moeren.

Binnen de steriele kap, bereid gasdoorlatende lijmen voor zodat deze groot genoeg zijn om de bovenkant van één 35-milliliter petrischaal te bedekken. Breng vervolgens een 90-milliliter petrischaal met drie experimentele monsters over naar de kap. Aspeer het medium van een van de schalen en bedek het met twee membraansecties, waarbij u ervoor zorgt dat er een strakke afdichting tussen het membraan en de rand van de schaal is.

Breng het monster over naar de EVOC-opstelling en bevestig het aan de basis van de bevestiging zodat de bovenkant van de schaal is uitgelijnd met de binnenkant van de schokbuis. Plaats op dit punt oordopjes, oogbescherming, veiligheidsschoenen en een laboratoriumjas. Druk de schokbuis aan door de stroomregelknop op de regelaar met de klok mee te draaien.

Selecteer aan de onderkant van het bedieningspaneel de dubbele kruitkamerinlaat voor een schokgolf van korte duur, of de aandrijfbuisinlaat voor een verhoogde golfduur. Schakel vervolgens de DC-voedingsbron en de oscilloscoop in om de golfvormgegevens te vereisen. Schakel vervolgens de veiligheidslichten in met behulp van de schakelaar aan de muur tegenover het bedieningspaneel om andere onderzoekers te waarschuwen om de kamer niet binnen te gaan wanneer de schokbuis wordt opgeladen.

Druk op de schakelaar op de solenoïdcontrolekast om de solenoïde te sluiten. Open vervolgens op het bedieningspaneel langzaam de stroomregeling door de knop tegen de klok in te draaien om de druk in de compressiekamer geleidelijk te verhogen. Wanneer de druk waarbij het diafragma barst, wordt bereikt, zal het diafragma scheuren en zal een klap worden gehoord.

Zodra dit geluid wordt gehoord, sluit u snel de stroomregeling. Open vervolgens de solenoïde door de schakelaar op de solenoïdcontrolekast uit te schakelen en schakel de veiligheidslicht uit. Breng het celmonster over naar de steriele kap.

Verwijder daar het