Beoordelende primaire Blast effecten In Vitro
September 18th, 2017
Begrijpen hoe cellen gemoduleerd worden door blootstelling aan schokgolven kunt achterhalen de mechanismen achter verwondingen uit blast gebeurtenissen geactiveerd. Dit protocol maakt gebruik van op maat gemaakte schok buis apparatuur te passen schokgolven op allerlei druk op monolayers van de cel en de latere effecten op de levensvatbaarheid van de cellen te kunnen identificeren.
Het algemene doel van deze methode is om representatieve schokgolven te genereren die kunnen optreden tijdens explosieven en om de impact van deze mechanische schok op de levensvatbaarheid van primaire cellen in cultuur te evalueren. Deze methode kan ons helpen sleutelvragen te beantwoorden over de reactie van individuele celtypen op hoogenergetische gebeurtenissen zoals blootstelling aan een schokgolf. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het ons in staat stelt om verschillende celreacties op een enkele schokgolf te evalueren in tegenstelling tot reacties op weefsel- of orgaanniveau.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het identificeren van de cellulaire mechanismen die veranderd zijn als gevolg van primaire explosieverwondingen, die worden veroorzaakt door blootstelling aan een schokgolf. Hoewel deze methode wordt gedemonstreerd met een specifiek celtype van belang, kunnen alle cellen worden gekweekt en in de testopstelling worden geplaatst om celspecifieke reacties op een schokgolf te beoordelen. Om te beginnen, kweek de cellijn van belang bij standaardkweek tot ze 80% confluency bereiken.
Aspeer vervolgens het medium. Was de cellen twee keer met PBS en voeg twee milliliter Trypsin-EDTA toe. Incubeer ze gedurende vijf minuten onder standaard kweekomstandigheden.
Controleer kort of de cellen succesvol zijn gedissocieerd van de flacon. Voeg vervolgens vier milliliter FBS-bevattend kweekmedium toe aan de flacon om de Trypsin te neutraliseren en breng de cellen over naar een 15-milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 200 keer g om de cellen te pellen.
Zuig vervolgens langzaam het supernatant af, zorg ervoor dat de pellet niet wordt losgemaakt. En resuspendeer de pellet in vijf milliliter medium. Plaats drie gelabelde 35-milliliter schalen in een 90-milliliter schaal.
Voeg vervolgens twee milliliter medium toe aan elke schaal en zaai ze elk met 70 duizend cellen. Incubeer de cellen een nacht lang om voldoende celhechting mogelijk te maken voordat ze worden blootgesteld aan de schokgolf. Voordat u begint met het assembleren van de schokbuis, trekt u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aan, inclusief stalen werkschoenen en een laboratoriumjas.
Begin door twee uitlijningsstaven door de boutgaten in het horizontale vlak van de uitlaatsleuf te steken. Plaats vervolgens een nitrilrubberen afdichtblad over het uiteinde van de uitlijningsstaven zodat het tussen de uitlaatsleuf en de ex vivo orgaankweekopstelling zit. Bevestig de EVOC-opstelling aan de uitlaatsleuf van de schokbuis door de bevestiging over de uitlijningsstaven te schuiven.
Zorg ervoor dat deze correct is georiënteerd zodat het gedeelte dat de petrischaal vasthoudt zich aan de basis bevindt. Plaats vervolgens vier M24-bouten en ringen in de resterende gaten en bevestig de moeren en bouten achtereenvolgens diagonaal symmetrisch vast, terwijl u visueel controleert of de EVOC-opstelling en de schokbuis succesvol zijn uitgelijnd. Bevestig vervolgens een druktransducer aan de EVOC-opstelling en verbind deze met de stroombron met behulp van een sensorkabel.
Gebruik bovendien een BNC-kabel om de stroombron te verbinden met de oscilloscoop. Zorg ervoor dat alle afsluitkleppen en stroomregelaars op de schokbuis gesloten zijn. Open vervolgens de ingebouwde externe persluchtleiding en draai de drukregelaar handmatig met de klok mee om de solenoïde op 2,5 bar op te laden.
Open de persluchtcilinder en draai vervolgens langzaam de drukregelaar met de klok mee om de druk op ongeveer 15 bar te verhogen. Bereid vervolgens diafragma's voor door een 0,125-milliliter dik plastic vel in 10 centimeter bij 10 centimeter vierkanten te snijden. Maak handvatten van plakband en bevestig ze aan de boven- en onderkant van het diafragma.
Gebruik deze om het diafragma voorzichtig naast de kleine voorflens bij de kruitkamer te plaatsen. Zorg ervoor dat het diafragma recht en correct is gepositioneerd voordat u de kruitkamer sluit. En bevestig het vervolgens op zijn plaats met behulp van vier M24-bouten en moeren.
Binnen de steriele kap, bereid gasdoorlatende lijmen voor zodat deze groot genoeg zijn om de bovenkant van één 35-milliliter petrischaal te bedekken. Breng vervolgens een 90-milliliter petrischaal met drie experimentele monsters over naar de kap. Aspeer het medium van een van de schalen en bedek het met twee membraansecties, waarbij u ervoor zorgt dat er een strakke afdichting tussen het membraan en de rand van de schaal is.
Breng het monster over naar de EVOC-opstelling en bevestig het aan de basis van de bevestiging zodat de bovenkant van de schaal is uitgelijnd met de binnenkant van de schokbuis. Plaats op dit punt oordopjes, oogbescherming, veiligheidsschoenen en een laboratoriumjas. Druk de schokbuis aan door de stroomregelknop op de regelaar met de klok mee te draaien.
Selecteer aan de onderkant van het bedieningspaneel de dubbele kruitkamerinlaat voor een schokgolf van korte duur, of de aandrijfbuisinlaat voor een verhoogde golfduur. Schakel vervolgens de DC-voedingsbron en de oscilloscoop in om de golfvormgegevens te vereisen. Schakel vervolgens de veiligheidslichten in met behulp van de schakelaar aan de muur tegenover het bedieningspaneel om andere onderzoekers te waarschuwen om de kamer niet binnen te gaan wanneer de schokbuis wordt opgeladen.
Druk op de schakelaar op de solenoïdcontrolekast om de solenoïde te sluiten. Open vervolgens op het bedieningspaneel langzaam de stroomregeling door de knop tegen de klok in te draaien om de druk in de compressiekamer geleidelijk te verhogen. Wanneer de druk waarbij het diafragma barst, wordt bereikt, zal het diafragma scheuren en zal een klap worden gehoord.
Zodra dit geluid wordt gehoord, sluit u snel de stroomregeling. Open vervolgens de solenoïde door de schakelaar op de solenoïdcontrolekast uit te schakelen en schakel de veiligheidslicht uit. Breng het celmonster over naar de steriele kap.
Verwijder daar het
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de effecten van schokgolven op cellevensvatbaarheid, met als doel de cellulaire reacties op mechanische schok te begrijpen. Door gebruik te maken van op maat gemaakte schokbuisapparatuur, evalueert de studie hoe verschillende drukken celmonolagen beïnvloeden.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Mechanische verwonding
Achtergrond
- Schokgolven kunnen primaire explosieverwondingen in cellen veroorzaken.
- Het begrijpen van cellulaire reacties op schokgolven is cruciaal voor letselmechanismen.
- Deze methode maakt het mogelijk om individuele celtypen te bestuderen in plaats van weefselreacties.
- Er wordt gebruik gemaakt van op maat gemaakte schokbuisapparatuur om gecontroleerde schokgolven te genereren.
Doel van het onderzoek
- Om de impact van mechanische schok op primaire cellen in cultuur te evalueren.
- Om cellulaire mechanismen te identificeren die worden gewijzigd door blootstelling aan schokgolven.
- Om celspecifieke reacties op schokgolven te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Kweek cellen tot 80% confluentie en bereid ze voor op blootstelling aan schokgolven.
- Monteer de schokbuisapparatuur en zorg voor de juiste veiligheidsmaatregelen.
- Genereer schokgolven bij verschillende drukken en stel celmonsters bloot.
- Analyseer cellevensvatbaarheid met behulp van een fluorescentieplatelezer na incubatie.
Belangrijkste resultaten
- Er werden verschillende reacties van celtypen op schokgolven waargenomen.
- Cellevensvatbaarheid werd beoordeeld na blootstelling om effecten te bepalen.
- Gegevens gaven aan dat specifieke cellulaire mechanismen werden beïnvloed door schokblootstelling.
Conclusies
- Deze methode biedt inzichten in cellulaire reacties op mechanische schok.
- De bevindingen kunnen strategieën voor het verminderen van explosieverwondingen informeren.
- Verder onderzoek kan zich uitbreiden naar verschillende celtypen en schokparameters.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model primary blast-induced cellular injury in a controlled in vitro system, supporting mechanistic de-risking of mechanosensitive pathways. By quantifying viability thresholds at defined overpressures, it provides predictive confidence for target validation in trauma and neuroinflammatory indications. The scalable shock wave platform facilitates early discovery screening of compounds that mitigate mechanical stress responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking defined mechanical stress inputs to viability outputs in primary cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through dose-response assessment of shock wave effects on cell survival.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing damage thresholds that inform go/no-go decisions for mechanoprotective candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated monolayer systems for reproducible compound testing under controlled mechanical injury conditions.
- Operational Value: Delivers quantitative redox and live/dead readouts that enable assay standardization and Z'-factor assessment.
- Scalability: Supports medium-throughput workflows at 60 samples per hour, enabling platform reuse across multiple cell types and pressure profiles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining cellular responses that mirror primary blast injury mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Identifies pressure-sensitive pathways that can be targeted to reduce late-stage failure in trauma-related indications.
- Biomarker Alignment: Enables transcriptional and epigenetic profiling post-shock to support translational biomarker discovery.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanobiological readouts that inform early compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mechanical shock as an independent variable to clarify stress-response pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized monolayers with quantitative viability outputs for reliable compound screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based viability measurements and imaging data that enable condition comparison and EC50 estimation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining cellular damage thresholds relevant to blast lung, brain injury, and heterotopic ossification models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular shock wave capability applicable across dermal, neural, and pulmonary cell systems for cross-program mechanobiology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanotransduction mechanism assignment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized shock wave generation and sealed sample presentation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mechanoprotective targets before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative thresholds for blast-induced cellular dysfunction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, shock wave physics, and fluorescence-based viability assays.
- Needs shock tube instrumentation, pressure transducers, oscilloscopes, and sterile workflow infrastructure.
- Demands cross-team standardization between cell biology and biophysics groups for consistent pressure calibration.
- Involves adaptation considerations for suspension vs. adherent cells and tissue explants via rig modifications.
- Limited by the challenge of perfectly replicating in vivo blast dynamics, though useful for defining comparative thresholds and mechanism screening.
