Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie en productie van genen en eiwitmarkers te analyseren, respectievelijk, van neurale differentiatie van embryonale muisstamcellen. Deze methode kan helpen om het mechanisme te bepalen dat verantwoordelijk is voor de remming van neurale differentiatie door de rauwe leeftijd van DPAs, en leiden tot betere protocollen om stamcellen te differentiëren in neuronen voor therapeutische doeleinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het volgen van het proces van neurale differentiatie op het emerin- en eiwitniveau vergemakkelijkt, inclusief door optische microscopie.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Junning Yang, een onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium. Begin met de vorming van embryoïde lichamen door embryonale stamcellen te oogsten met 0,25% Trypsin-EDTA gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Voeg vers Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium, of IMDM, met 15% FBS toe aan de aflossende cellen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 160 x G op kamertemperatuur. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer en bereid een suspensie van vijf x 10 tot de vijfde cellen per milliliter in IMDM met 0,5 micromolair retinoïnezuur. Gebruik vervolgens een achtkanaals pipette en 200-microliter tips om druppels van 120 microliter per 100 millimeter petrischaal te plaatsen.

Keer de schaal om en vul het omgekeerde deksel met PBS om te voorkomen dat hangende druppels uitdrogen. Kweek bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende drie tot vier dagen. Gebruik 200-microliter pipette tips om hangende druppel embryoïde lichamen die drie dagen zijn gekweekt, te oogsten.

Raak een embryoïd lichaam aan met een pipette tip en breng het over naar een fibronectine-gecoate dekglas in een 24-well plaat. Ververs het medium op de culturen om de twee tot drie dagen. Bij het verversen van het medium, verzamel het gebruikte medium voor eiwitsecretie-analyse indien nodig.

Om uitgescheiden eiwitten in het medium te detecteren, breng 500 microliter embryoïd lichaam medium over naar centrifugale filters met een afsnijding van 10 kilodalton en centrifugeer bij 20.000 x G bij vier graden Celsius. Onderzoek het medium dat in de centrifugale filters achterblijft elke 15 tot 20 minuten om overmatige verrijking te voorkomen. Stop de centrifugering wanneer het volume van het overgebleven medium is gedaald tot 25 microliter.

Keer de filter om en centrifugeer bij 160 x G bij vier graden Celsius, verzamel vervolgens het overgebleven geconcentreerde medium door de instructies van de fabrikant te volgen. Voor een 3D-kweek, oogst embryoïde lichamen die vier dagen zijn gekweekt als hangende druppels met 200-microliter pipette tips, zoals eerder. Breng 30 embryoïde lichamen over naar een centrifugeerbuis van 1,5 milliliter en bereid vervolgens collageengeloplossing door geschikte volumes collageenoplossing en 5X DMEM te verdunnen, de neutralisatieoplossing toe te voegen en onmiddellijk goed te mengen.

Plaats de collageengel op ijs. Pipetteer vervolgens een geschikt volume gekoelde collageenoplossing in de buis met de embryoïde lichamen en pipet vervolgens de embryoïd lichaamssuspensie voorzichtig in de putjes van een zes-wel plaat zonder luchtbellen te creëren. Breng de plaat onmiddellijk over naar 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende 60 minuten om collageenpolymerisatie te initiëren.

Na de 60 minuten, bedek de plaat met embryoïde lichamen met IMDM. Voor embryoïd lichaamsdissociatie, verzamel opnieuw de embryoïd lichamen van vier dagen als hangende druppels met 200-microliter pipette tips. Breng ze deze keer over naar een niet-adhesieve bacteriologische petrischaal met IMDM met 15%FBS en kweek gedurende nog eens vier dagen bij 37 graden Celsius, 5%koolstofdioxide.

Controleer de embryoïde lichamen twee keer per dag om ervoor te zorgen dat ze zich niet aan de bodem hechten. Schud voorzichtig de schaal om aanhechting van embryoïde lichamen te voorkomen. Na vier dagen, breng de embryoïde lichamen over naar een centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 185 x G op kamertemperatuur.

Na centrifugatie, verwijder het supernatant. Het paletvolume mag niet groter zijn dan 100 microliter. Pipetteer vervolgens één milliliter 0,25% type I collageenase, aangevuld met 20% FBS in PBS in de buis met embryoïde lichamen.

Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Pipetteer de suspensie voorzichtig elke 20 minuten met behulp van een een-milliliter pipette tip. Na de incubatie, was de cellen drie keer voorzichtig met PBS.

Als er celaggregaten aanwezig zijn, gebruik een celzeef met een 100-micron gaas om ze te verwijderen. Plateer de cellen op gelatine-gecoate dekglazen in IMDM en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Was de 2D of gedissocieerde 3D embryoïde lichamen met PBS.

Fixeer vervolgens met vier procent paraformaldehyde en PBS gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Na het wassen van de gefixeerde cellen drie keer met PBS om drijvende celdeeltjes te verwijderen, voeg 1% Triton X-100 in PBS toe om de cellen 20 minuten op kamertemperatuur te permeabiliseren. Na het wassen zoals eerder, verwijder de laatste was en blokkeer met 5% BSA in PBS gedurende 30 minuten.

Tegen het einde van de incubatie, bereid een primaire antilichaamverdunning in 1% BSA in PBS aangevuld met 0,03% Triton X-100. Wanneer de 30 minuten zijn verstreken, vervang de blokkeringsoplossing door de primaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende drie uur op kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius.

Na het wassen, breng een secundair antilichaam in PBS aan en incubeer gedurende één uur op kamertemperatuur. Monteer tenslotte de dekglazen op glazen plaatjes met een anti-vervagingsmedium voor optische microscopie. Deze afbeelding