Name: LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer de LERLIC-MS/MS-methode voor gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine- en asparagine-deamidatie in shotgun-proteomics. Deze techniek scheidt isomeren effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Singapore ministerie van Onderwijs (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council van Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) en NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). We willen graag onze dankbaarheid en meest oprechte dank aan Dr. Andrew Alpert en PolyLC team uit te drukken voor vriendelijk voorzag ons van het verpakkingsmateriaal dat mogelijk deze studie gemaakt.

1. Verpakking de lange lengte Anion exchange (LAX) Capillaire kolom (Noot: Hoewel de LAX kolom kan in-huis verpakt als we in dit protocol beschrijven LOS kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar, zie tabel van Materialen en Reagentia voor verdere details). <ol><li> Suspendeer 50 mg zwakke anionenuitwisselende pakkingsmateriaal in 3,5 ml verpakking buffer (tabel 1) aan de slurrie te bereiden. </li><li> Monteer het uiteinde van de capillaire kolom (50 cm lengte - 200 urn inwendige diameter (ID) slang) met een vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling, een plak en een moer. Plaats een scherm 1/16&quot; OD van 1 micron poriegrootte in het vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling (NB:. Het scherm hier gebruikt moet kleiner poriëngrootte dan de deeltjesgrootte van het verpakkingsmateriaal om lekkage van het materiaal te voorkomen hebben de kolom). </li><li> Verpak de capillair met een slurrie onder een druk pomp bedreven bij 4.500 psi. (Let op: Verpak de Column totdat het verpakkingsmateriaal zichtbaar aan de ingang van de kolom). </li><li> Monteer het andere uiteinde van de capillaire kolom zoals beschreven in punt 1.2. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding Dit protocol beschrijft de toepassing van LERLIC-MS / MS menselijke hersenweefsels als model proteoom analyse. (Opmerking: Als ander weefsel of proteomische samples, dient de monsterbereidingsprocedures worden aangepast.) <ol><li> Weefsel homogenisatie: een. Wassen hersenweefsels (50-100 mg) met 1x fosfaatbufferoplossing gedurende vijf minuten driemaal. b. Homogeniseren het weefsel 1: 1: 2,5 tissue / metallic kralen / SDC homogenisatiebuffer (Tabel 2) verhouding (w / w / v) gedurende 5 min bij 4 ° C in veiligheidskapjes buizen bij maximale intensiteit met een tissue homogenisator. (Noot: SDC homogenisatiebuffer kan proteaseremmers omvatten zoals hiervoor in 3 aangegeven) c. Centrifugeer de weefselhomogenaat, fro verkregenm de vorige stap, bij 10.000 x g, 4 ° C gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis. d. Herhaal stap bc voor de resterende pellets en combineer de supernatanten zo vaak als nodig totdat er geen korrel wordt waargenomen. (Let op: Als u de stappen bc meer dan twee keer te herhalen, beweegt het monster en de kralen aan een nieuwe safe-lock buis om het verlies van het monster tijdens de centrifugatiestap te voorkomen). e. Kwantificeren van de eiwitconcentratie van de verkregen homogenaten door bicinchoninezuurbepaling (BCA) 12. </li><li> Natrium deoxycholaat (SDC) bijgestane in oplossing tryptische digestie 13 van hersenhomogenaten. een. Voeg een eindconcentratie van 10 mM dithiothreïtol (DTT) (met de voorraadoplossing die in oplossing 5 van tabel 3) het verkregen homogenaat aan de vermindering van proteïne disulfidebindingen initiëren. b. Incubeer het homogenaat gedurende 30 min in een badvooraf ingesteld op 60 ° C. c. Toevoegen homogenaat een eindconcentratie van 20 mM joodacetamide (IAA) met de voorraadoplossing die in Oplossing 7 van tabel 4. d. Incubeer het homogenaat met IAA bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min. e. Verdun het hersenhomogenaat twee vouwen behulp verdunningsbuffer (Oplossing 6 van tabel 3). f. Incubeer het monster voor de tweede reductietrap gedurende 30 minuten bij 37 ° C. g. Add sequencing-grade modified trypsin opgelost in Oplossing 2 van tabel 2 aan eiwit tot enzym verhouding van 1:50 (w / w). h. Digereer het homogenaat met trypsine door overnacht incubatie bij 30 ° C. ik. Schrik de enzymatische digestie op de volgende dag door toevoeging van 0,5% eindconcentratie mierenzuur (FA). (NB: Toevoeging van FA wordt precipitatie van de zouten SDC onder zure condities leiden.) j. Voorzichtig vortex de monsters die SDC precipiLIDSTATEN. k. Pellet door het SDC zouten door centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g, 4 ° C gedurende 10 min. l. Verzamel de bovenstaande vloeistof en breng de oplossing op een schone nieuwe buis. (Let op: Zorg ervoor dat tijdens het pipetteren van deze stap om niet opnieuw op te schorten en / of het verzamelen van zouten uit de SDC pellet.) m. Opnieuw oplossen SDC SDC pellet opnieuw oplossende buffer (tabel 5) onder krachtig vortexen gedurende 1 minuut. n. Herhaal stap JL tweemaal neergeslagen peptiden herstellen en combineren de bovenstaande vloeistoffen. (NB:. Zie Serra et al 2016 13 voor meer informatie over de SDC ondersteunde in oplossing tryptische digestie protocol hier aangepast.) </li><li> Ontzouten van tryptische gedigereerde monsters. een. Voeren ontzouten van gedigereerde monsters met behulp van een 1 g C-18 patroon. (Opmerking: het gebruik van een groot volume cassette (5 ml) onafhankelijk van de hoeveelheid eiwit verkregen garanties goede reiniging overgebleven SDC zouten in de monsters voorafgaandeLC-MS / MS injectie). b. Voeren conditionering van de 1g C-18 cassette met 5 ml acetonitril (ACN). c. Passeren 5 ml sanering buffer (Tabel 6) van het geconditioneerde 1g C-18 cartridge om eventueel achtergebleven organisch oplosmiddel te verwijderen. d. Laad het monster op de 1g C-18 patroon. e. Voeren 3-5 sanering stappen om het monster in de 1g C-18 kolom met 5 ml buffer sanering elke stap. f. Elueer het ontzout peptiden uit de 1g C18 cartridge via 5 ml elutiebuffer (Tabel 7). g. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator. c. Reconstitueer het gedroogde monster in een eindvolume van 200 pl elutiebuffer. (NB:. Gebruik krachtige en lange (&gt; 10 min) vortexen, gevolgd door daaropvolgende sonicatie in een bad sonicatie gedurende 30 minuten volledig resuspenderen van de gedroogde peptiden in injectiebuffer) d. Pas het injectievolume van het monster voor LERLIC-MS / MS analyseren tussen 1-3 ug eiwit. </li></ol> 3. Eén-dimensionale LERLIC-MS / MS Scheiding <ol><li> Vloeistofchromatografie voorwaarden: Mobiele fasen: A: 0,1% FA in water (tabel 8). B: 0,1% FA in ACN (tabel 9) Stroomsnelheid: 0,4 pL / min Kolom: LAX capillaire kolom (50 cm lengte - 200 um ID) een. Gebruik de volgende 1.200 min-gradiënt: 95% B gedurende 40 min, 95-85% B gedurende 434 min, 85-70% B gedurende 522 min, 70-35% B gedurende 124 min, 35-3% B gedurende 45 min , isocratisch 3% B gedurende 5 min, 3-95% B in 7 min en bewaard isocratisch bij 95% B gedurende 23 min. b. Voeren scheiding van peptiden via de LAX capillaire zoals in Serra en Gallart-Palau et al. 3 met behulp van ultra-hoge druk vloeistofchromatografie. </li><li> Mass spectrometer configuratie: een. Configureren scan gebeurtenisdetails aan gegevensverwerving alternerende betwe voerenen full Fourier-transformatie-massaspectrometrie (FT-MS) en Fourier transformatie-tandem massaspectrometrie (FT-MS / MS) met de volgende parameters: a.1. Data acquisitie-modus: positief a.2 FT-MS parameters: Massagebied: 350 - 2.000 m / z Resolutie: 60.000 Microscans: 1 per spectrum Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 6 a.3 FT-MS / MS-parameters: Fragmentatie-modus: Hoog-energetische botsingen dissociatie (HCD) a.4 massagebied: 150 - 2.000 m / z A.5 Resolutie: 30.000 a.6 Top N ionen: 10 Microscans: 1 per spectrum Laadtoestand:&gt; 2+ Isolatie breedte: 2 Da A.7 Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 6 b. Uitvoeren van massaspectrometrie detecteren van peptiden zoals aangegeven in 3 via een orbitrap massaspectrometer uitgerust met een nanoelectrospray ionenbron die bij 1,5 kV. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Voer protein databankonderzoek de LERLIC-MS / MS gegevens verkregen met de volgende parameters behulp van een specifiek proteomics software: (Opmerking: Zie 3 voor meer details). een. Ion tolerantie: 10 ppm b. Fragmentionen tolerantie: 0,05 Da c. False Discovery Rate (FDR): 1% d. Database: UniProt menselijke database e. Vaste modificaties: Carbamydomethylation bij Cys f. Variabele modificaties (indien vereist door de software): Oxidatie (Met), Deamidatie (Asn en Gln). </li><li> Zekere karakterisering en kwantificering van gedeamideerd isomere produkten LERLIC-MS / MS gegevens: een. Export databank zoekresultaten van LERLIC-MS / MS om een ​​spreedsheet software voor analyse. b. Zoek en pak de hele lijst van gedeamideerd peptiden en hun niet-deamidated tegenhangers. c. Met de lijst van de verkregen peptiden als referentie, extraheer het ion chromatogrammen (XICs) van deze peptiden via een bestemde software bij 5 dpm massatolerantie. (Notitie:Zie 3 voor meer informatie over de software die wordt gebruikt voor de winning van XICs.) d. Inspecteer de verkregen XICs de gescheiden dubbele piek elutie van de isomere producten te identificeren aangegeven 3. (Opmerking: Isomere producten van die peptiden die bij MS / MS niveau kan gemakkelijk gevonden worden geleid door de aanwezigheid van twee verschillende retentietijden in het zoekresultaatdatabase.) e. Relatieve kwantificatie van de isomere producten uit elke gedeamideerd site / peptide moet worden uitgevoerd op basis van het piekgebied van elk element isomeer verkregen XICs. </li></ol>

<ol><li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation%2C+isomerization%2C+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li>
<li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+%28LERLIC-MS%2FMS%29+in+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li>
<li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins%3A+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li>
<li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240939643_First_evidence_of_spontaneous_deamidation_of_glutamine_residue_via_cyclic_imide_to_-_and_-glutamic_residue_under_physiological_conditions">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+with+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li>
<li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11158575">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li>
<li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+deamidation%3A+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li>
<li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106(2016).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005(2016).</li>
<li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration%2Faging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li>
<li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li>
<li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+%28HILIC%29--a+powerful+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li>
<li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides%3A+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li>
<li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20(2016).</li>
<li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li>
<li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798(2016).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li>
<li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis%3A+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS 3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) 27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie 3, maximaliseert het potentieel va...

Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten 1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding 2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Evenzo deamidering van Gln residuen genereert isomere gamma-glutaminezuur (γ-Glu) en alfa-glutaminezuur isovormen (α-Glu) en een verwachte 1: 7 verhouding van 3, 5, doch deze verhouding kan worden geschoven door de werking van de alomtegenwoordige enzym transglutaminase 2 en andere transglutaminasen, zoals transglutaminase 1, enzyme onlangs geïdentificeerd als geassocieerd met extracellulaire blaasjes in de hersenen 6. De oorsprong van deamidatie kan hetzij spontaan of enzymatisch worden, de eerste is vooral gebruikelijk op Gin residuen waarin transglutaminasen en andere enzymen mediëren inter / intramoleculaire verknoping via transamideringsprodukt (zie 3 voor meer details over Gin transamideringsprodukt en de implicaties verschillende chronische en dodelijke ziekten bij de mens). Daarom, deamidering is een doorvoermechanisme die een cruciale weerslag op de structuur en functie van de betrokken moleculen 4, 7, 8 heeft en vereist een uitgebreide chemische karakterisering 3 in het licht van de diverse biochemische gevolgen inbegrip van de service moleculaire klok van veroudering 9 . Hoewel deamidering Asn residuen is<html> relatief goed gekenmerkt door bottom-up shotgun proteomics 1, 10, deamidatie of Gln-residuen nog steeds geen geschikte karakteriseringsmethode buiten de uitdagende analyse van modelverbindingen door elektronen radicaal fragmentatie 11. We hebben onlangs een nieuwe één dimensie shotgun proteomics strategie (LERLIC-MS / MS) 3 die gescheiden Gin en Asn deamidering isovormen uit complexe biologische monsters en modelverbindingen maakt in een enkele analyse. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op de scheiding van de tryptische peptiden gedigesteerd met behulp van een lange lengte (50 cm) ionenuitwisselingskolom (LAX) aan elektrostatische afstoting-hilic (Erlić) stand en gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS / MS). Deze nieuwe analytische strategie is toegepast voor het karakteriseren en kwantificeren betrekkelijk de omvang van elk gedeamideerd residuen in humane hersenweefselsf &quot;&gt; 3. Niettemin zal de hier geschetste protocol videobeelden van LERLIC-MS / MS doel de eigenaardigheden van eiwitdeamiderende bestuderen de biochemische context van belang. ETHISCHE UITSPRAAK Alle procedures van dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanyang Technological University in Singapore en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 &micro;m 100-&Aring; (bulk material)</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 &micro;m ID</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 &micro;m ID x 50 cm length</td><td>SGE Analytical Science onder Trajan Scientific Australia&nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>Female-to-female fitting voor 1/16" OD tubbing</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Female nut voor microferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Microferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Bomb NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence UFLC-systeem</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock buizen</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralen. 0,9 &ndash; 2,0 mm. 1 lb. Niet-steriel.</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel&nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>Standaard digitaal verwarmd circuerend bad, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack c18 ontzoutingscartridge 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum concentrator</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Concentrator Plus System</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite massaspectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray&nbsp;</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>Incubator INCUCELL&nbsp;</td><td>MMM Group</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing-grade gemodificeerd trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Protease-remmercocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing 10x (verdund tot 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Forminezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniakhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril HPLC-kwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol HPLC-kwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>Water HPLC-kwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

lerlic-ms / ms gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine deamidatie in shotgun proteomics

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.

Deamidatie of Gin en Asn residu wordt beschouwd als een degeneratieve eiwitmodificatie (DPM) betrokken bij een aantal chronische en dodelijke ziekten 14. Is aangetoond dat dit PTM de halfwaardetijd en afbrekende toestanden van antilichamen en andere moleculen kunnen voorspellen in het menselijk lichaam en soortgelijke biologische backgrounds 1, 15. De betekenis van eiwitdeamiderende, in feite, gaat verder ...

Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Het algemene doel van deze procedure is om shotgun-proteomics te gebruiken om endogene deamideringsproducten van glutamine en asparagine in complexe proteomen te karakteriseren en te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biochemie, zoals de invloed van spontane en enzymatische processen op de isomere producten van glutamine- en asparagine-deamidering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat glutamine-deamideringsisomeren worden gescheiden op een ionenuitwisselingscapillairkolom met een grote lengte, waardoor het vermogen om peptiden te scheiden op basis van hun isomere eigenschappen wordt gemaximaliseerd.Om te beginnen met de constructie van de kolom, wordt 50 milligram zwak anionenwisselingsvulmateriaal gesuspendeerd in 3,5 milliliter 90% isopropanol in water. Bevestig een female-to-female koppeling, een microferrule en een female moer aan één uiteinde van een 50 centimeter lang stuk Peak-tubing met een binnendiameter van 200 micrometers. Plaats een 1/16 inch filter met poriën van één micrometer aan het uiteinde van de tubing binnen de microferrule.Pak de anionenwisselaar in de capillaire met een drukpomp ingesteld op 4.500 psi, totdat het materiaal aan de bovenkant zichtbaar is. Bevestig een andere female-to-female fitting, microferal en female moer aan de bovenkant van de gepakte capillaire aan de tegenovergestelde zijde om de assemblage van de kolom te voltooien. Was 50 tot 100 milligram weefsel gedurende vijf minuten met fosfaatgebufferde zoutoplossing.Herhaal deze wasbeurt tweemaal en plaats het gewassen weefsel vervolgens in buisjes met veiligheidsdoppen. Voeg aan elk buisje een gewichtsequivalent roestvrijstalen kraaltjes toe en 2,5 volumeequivalenten van een waterige 100 millimolaire oplossing van ammoniumacetaat met 1% natriumdeoxycholaat. Homogeniseer het weefsel gedurende vijf minuten op maximale intensiteit bij vier graden Celsius.Centrifugeer vervolgens het homogenaat tien minuten lang bij 10.000 x g en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een buisje van 1,5 milliliter. Ga door met het homogeniseren en centrifugeren van het weefselpellet en combineer telkens de supernatanten totdat er geen pellet meer wordt waargenomen.Kwantificeer de eiwitconcentratie in de gecombineerde supernatanten met een bicinchonininezuur-assay. Voeg vervolgens aan het homogenaat een 1 M oplossing van dithiothreïtol in 100 mM ammoniumacetaat toe om een concentratie van 10 mM dithiothreïtol in de monster te bereiken. Incubeer het homogenaat in een waterbad bij 60 °C gedurende dertig minuten.Voeg aan het homogenaat een een molaire oplossing van iodoacetamide in 100 millimolair ammoniumacetaat toe om een iodoacetamideconcentratie van 20 millimolair in het monster te verkrijgen. Incubeer het homogenaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verdun vervolgens het homogenaat met twee volume-equivalenten van een tien millimolaire oplossing van dithiothreïtol in 100 millimolair ammoniumacetaat.Incubeer het homogenaat 30 minuten bij 37 °C. Voeg aan het homogenaat een voldoende volume sequencing-grade gemodificeerde trypsine in 100 mM ammoniumacetaat toe om een eiwit-enzymverhouding van 1:50 op basis van gewicht in het monster te bereiken. Incubeer het monster gedurende de nacht bij 30 °C om het homongeen te laten verteren.Stop de digestie met mierenzuur in een hoeveelheid van 0,5% van het monstergewicht, waardoor de natriumdeoxycholaatsalten neerslaan. Vortex de monsters die SDC-salten bevatten voorzichtig en centrifugeer de monsters vervolgens tien minuten lang bij 12 000 x g en vier graden Celsius. Giet het supernatant over in een nieuwe buis, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet van SDC-salten niet wordt verstoord.Los de zouten opnieuw op in een waterige oplossing van ammoniumhydroxide (0,5% volume), terwijl er krachtig wordt gevortext. Conditioneer een C-18 sorbentcartridge van één gram met 5 milliliters acetonitril, gevolgd door vijf milliliters 0,1%trifluorazijnzuur in water. Laad vervolgens het verteerde monster op de cartridge.Was de monsters drie tot vijf keer met porties van vijf milliliter 0,1% TFA. Verdun vervolgens de peptiden met vijf milliliter van een waterige oplossing van 75% acetonitril en 0,1% mierenzuur. Droog de vloeistof in een vacuümconcentrator.Voeg 200 µL 75% acetonitril met 0,1% mierenzuur toe aan het residu. Vortex het mengsel gedurende ten minste tien minuten en soniceren het mengsel vervolgens ten minste 30 minuten om de droge peptiden opnieuw op te lossen. Verdun het monster naar behoefte, zodat het geïnjecteerde monster één tot drie µg eiwit bevat.Sluit de LAX-capillaire kolom aan op een ultra-hogedruk vloeistofchromatografie-instrument. Bereid 0,1% mierzuuroplossingen in water en acetonitril voor. Stel de stroomsnelheid in op 0,4 µL per minuut en stel een gradiëntrun van 1.200 minuten in.Configureer de scan-events van de massaspectrometer om afwisselend gegevens te verwerven via volledige Fourier-transformatie massaspectrometrie en Fourier-transformatie tandem massaspectrometrie. Voer LERLIC MS/MS uit om de peptiden te scheiden en te karakteriseren. Gebruik de resulterende gegevens en proteomische software om een eiwitdatabankzoekopdracht uit te voeren.Exporteer de resultaten van de databasezoekopdracht naar spreadsheetsoftware. Identificeer en extraheer de lijst met gedeamideerde peptiden en de overeenkomstige niet-gedeamideerde peptiden. Extraheer de ionenchromatogrammen van elk van deze peptiden met een massatolerantie van vijf parts per million.Inspecteer de geëxtraheerde ionchromatogrammen op de illusie van gescheiden dubbele pieken van isomere producten. Met behulp van LERLIC MS/MS werden gedeamideerde isoformen van glutamine en asparagine gescheiden en geïdentificeerd in een eiwitmonster bij twee verschillende retentietijden. Enzymatisch gemodificeerde intermediaire glutamineresidu's van transamidatie, die een omgekeerde gamma-alpha-glutamylratio vertoonden, werden geïdentificeerd.Het succinimide-tussent product in asparagine-residuen werd eveneens met deze methode geïdentificeerd. Aangezien de licht zure condities tijdens de monsterverwerking het succinimide-tussenproduct stabiliseren, suggereert dit dat de LERLIC MS/MS-techniek kan worden toegepast voor proteoombrede studies naar succinimide-tussenproducten.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de biochemie om proteïndeamidering te karakteriseren in contexten variërend van archeologie tot biomedisch onderzoek.

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Source: Wulf, M., et.al. Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the analysis of peptide samples from neuromelanin granules (NMGs) isolated from human postmortem brain tissue. The peptides are first separated using high-performance liquid chromatography (HPLC) and then analyzed by mass spectrometry to determine their mass-to-charge ratios (m/z). Targeted peptides are fragmented...

LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules Isolated from Human Brain Tissue

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd voor het isoleren van neuromelaninekorrels uit menselijk post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel via lasermicrodissectie. Dit herziene en geoptimaliseerde protocol minimaliseert massaal de vereiste tijd voor monsterverzameling, vermindert de vereiste monsterhoeveelheid en verbetert de identificatie en kwantificering van eiwitten door LC-MS / MS-analyse.

Laser Microdissection-Based Protocol voor de LC-MS/MS analyse van het proteomische profiel van Neuromelanine Granules

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Leer de LERLIC-MS/MS-methode voor gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine- en asparagine-deamidatie in shotgun-proteomics. Deze techniek scheidt isomeren effectief.

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Meer video's verkennen