LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics
April 9th, 2017
Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.
Het algemene doel van deze procedure is om shotgun-proteomics te gebruiken om endogene glutamine- en asparagine-deamidatieproducten in complexe proteomen te karakteriseren en kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biochemie, zoals de invloed van een spontaan en antimatische proces op het isometrische product gluteo van glutamine- en asparagime-deaminering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat glutamine-deamineringsisomeren worden gescheiden op een capillaire kolom met ionische verandering van lange lengte, waardoor de mogelijkheid om peptiden te scheiden door de isometrische punten wordt gemaximaliseerd.
Om met de kolomconstructie te beginnen, schors 50 milligram zwak anionenuitwisselingsvulmateriaal in 3,5 milliliter 90% isopropanol in water. Bevestig een vrouwelijke aansluiting op vrouwelijk, een microferal en een vrouwelijke moer aan één uiteinde van een 50 centimeter lange piekbuis met een binnendiameter van 200 micrometer. Plaats een 1/16e inch scherm met één micrometer poriën aan het uiteinde van de buis in de microferal.
Gebruik een drukpompen ingesteld op 4.500 psi om het anionenuitwisselingsmateriaal in de capillair te verpakken totdat het materiaal aan de bovenkant zichtbaar is. Bevestig een andere vrouwelijk-op-vrouwelijk aansluiting, microferal en vrouwelijke moer aan de bovenkant van de verpakte capillair aan het tegenovergestelde uiteinde om de kolom te voltooien. Was 50 tot 100 milligram weefsel gedurende vijf minuten met fosfaatgebufferde zoutoplossing.
Herhaal deze wasbeurt twee keer en plaats vervolgens het gewassen weefsel in buizen met veiligheidsdoppen. Voeg aan elke buis één gewichtsequivalent van roestvrijstalen bolletjes toe en 2,5 equivalenten per volume van een waterige 100 millimolaire oplossing van ammoniumacetaat met 1% natriumdeoxycholaat. Homogeniseer het weefsel met maximale intensiteit gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Centrifugeer vervolgens het homogenaat gedurende tien minuten bij 10.000 x g en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een buis van 1,5 milliliter. Ga door met het homogeniseren en centrifugeren van het weefselpelletje en combineer de supernatanten elke keer totdat er geen pellet meer wordt waargenomen.
Kwantificeer de eiwitconcentratie in de gecombineerde supernatanten met een bicinchoninezuurtest. Voeg vervolgens aan het homogenaat een 1-molare oplossing van dithiothreitol toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een concentratie van tien millimolair dithiothreitol in het monster te bereiken. Incubeer het homogenaat in een waterbad gedurende dertig minuten bij 60 graden Celsius.
Voeg aan het homogenaat een 1-molare oplossing van iodoacetamide toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een concentratie van 20 millimolair iodoacetamide in het monster te bereiken. Incubeer het homogenaat bij kamertemperatuur in afwezigheid van licht gedurende 45 minuten. Verdun vervolgens het homogenaat met twee volume-equivalenten van een tien millimolaire oplossing van dithiothreitol in 100 millimolair ammoniumacetaat.
Incubeer het homogenaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg aan het homogenaat een voldoende volume sequencing grade gemodificeerd trypsine toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een eiwit-enzymverhouding van gewicht 1 tot 50 in het monster te bereiken. Incubeer het monster gedurende de nacht bij 30 graden Celsius om het homogenaat te verteren.
Demp de vertering met 0,5% van het monstergewicht aan zoutzuur, waardoor de natriumdeoxycholaatzouten worden geprecipiteerd. Vorm de monsters die SDC-zouten bevatten voorzichtig en centrifugeer de monsters gedurende tien minuten bij 12.000 x g en vier graden Celsius. Decanteer het supernatant in een nieuwe buis, zorg ervoor dat de pellet van SDC-zouten niet wordt verstoord.
Los de zouten opnieuw op in een 0,5% op volume waterige oplossing van ammoniumhydroxide, en vorm krachtig. Conditioneer een C-18-sorbenscartridge van één gram met 5 milliliter acetonitril, gevolgd door vijf milliliter van 0,1% trifluorazijnzuur in water. Laad vervolgens het verteerde monster op de cartridge.
Was de monsters drie tot vijf keer met vijf milliliter porties van 0,1% TFA. Verdun vervolgens de peptiden met vijf milliliter van een waterige oplossing van 75% acetonitril en 0,1% mierzuur. Droog de vloeistof in een vacuümconcentrator.
Voeg 200 microliter van 75% acetonitril toe, met 0,1% mierzuur aan het residu. Vorm het mengsel gedurende ten minste tien minuten, en vorm het mengsel vervolgens gedurende ten minste 30 minuten om de droge peptiden te reconstitutioneren. Verdun het monster indien nodig, zodat het geïnjecteerde monster een tot drie microgram eiwit bevat.
Verbind de LAX capillaire kolom met een ultra-hogedrukvloeistofchromatografie-instrument. Bereid 0,1% mierzuur-oplossingen in water en acetonitril voor. Stel de stroomsnelheid in op 0,4 microliter per minuut en stel een 1.200 minuten durende gradiëntrun in.
Configureer de massaspectrometer-scan-gebeurtenissen om gegevensverwerving af te wisselen tussen volledige Fourier-transformatie-massaspectrometrie en Fourier-transformatie-tandem-massaspectrometrie. Voer LERLIC MS/MS uit om de peptiden te scheiden en te karakteriseren. Gebruik de resulterende gegevens en proteomics-software om een eiwitdatabasezoekopdracht uit te voeren.
Exporteer de databasezoekresultaten naar spreadsheetsoftware. Identificeer en extraheer de lijst van deamineerde peptiden en de overeenkomstige niet-deamineerde peptiden. Extraheer de ionenchromatogrammen van elk van deze peptiden met vijf delen per miljoen massatolerantie.
Inspecteer de geëxtraheerde ionenchromatogrammen op gescheiden dubbele piekillusie van isomere producten. Met behulp van LERLIC MS/MS werden deamineerde isomeren van glutamine en asparagine gescheiden en geïdentificeerd uit een eiwitmonster bij twee verschillende retentietijden. Enzymatisch gemodificeerde intermediaire glutamineresiduen van transamidering die een omgekeerd gamma-alfa-glutamil-verhouding vertoonden, werden geïdentificeerd.
Het succ
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methodologie genaamd long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS). Deze methode maakt de kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamineringsisomeren mogelijk met behulp van shotgun proteomics.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomics
- Mass Spectrometrie
Achtergrond
- Endogene glutamine en asparagine deamineringsproducten zijn belangrijk in verschillende biochemische processen.
- Het karakteriseren van deze producten kan inzicht geven in hun rollen in complexe proteomen.
- Traditionele methoden kunnen deamineringsisomeren mogelijk niet effectief scheiden.
- Shotgun proteomics is een krachtige techniek voor het analyseren van complexe mengsels.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren en karakteriseren van deamineringsisomeren.
- Om de scheiding van glutamine deamineringsisomeren te verbeteren.
- Om sleutelvragen in de biochemie over deamineringsprocessen aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Constructie van een lang ionische veranderings capillaire kolom.
- Suspensie van zwak anionenuitwisselingsvulmiddel in isopropanol en water.
- Gebruik van shotgun proteomics voor analyse.
- Scheiding van peptiden op basis van isometrische punten.
Belangrijkste resultaten
- De LERLIC-MS/MS methode kwantificeert deamineringsisomeren met succes.
- Verbeterde scheiding van glutamine en asparagine deamineringsproducten werd bereikt.
- Deze methodologie biedt nieuwe inzichten in biochemische processen waarbij deze aminozuren betrokken zijn.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van complexe proteomen werden geïdentificeerd.
Conclusies
- LERLIC-MS/MS is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van deamineringsisomeren.
- De methode verbetert het begrip van de rollen van glutamine en asparagine in de biochemie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodologie om andere biochemische vragen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Characterizing glutamine and asparagine deamidation is critical for understanding protein stability and function in disease contexts, yet current methods lack the resolution to separate and quantify these isoforms in complex proteomes. The LERLIC-MS/MS method addresses this gap by enabling isoform-specific detection, supporting mechanistic de-risking in target validation and improving predictive confidence in preclinical models. This capability enhances translational continuity by linking molecular PTM patterns to functional outcomes across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glutamine and asparagine deamidation as potential regulators of protein function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides isoform-resolved data that clarifies whether observed PTMs are enzymatically driven or spontaneous, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing functional deamidation events from background noise in complex biological samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, retention-time-resolved readouts for deamidated peptides, enabling reliable detection in screening campaigns.
- Operational Value: Delivers reproducible separation of isobaric isoforms, improving assay precision and reducing false positives in PTM-focused screens.
- Scalability: Compatible with shotgun proteomics workflows, allowing application to complex biological matrices without prior enrichment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates identification of deamidation patterns that correlate with disease states or therapeutic response in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Stabilizes and detects the succinimide intermediate, enabling direct observation of deamidation reaction pathways for kinetic and mechanistic studies.
- Preclinical Model Relevance: Supports disease-relevant systems by characterizing PTM landscapes in tissues or cells under pathophysiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The LERLIC-MS/MS method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly where PTM heterogeneity impacts target function or biomarker reliability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining whether specific glutamine or asparagine sites undergo deamidation in disease vs. control conditions.
- Screening: Enables assay-ready detection of deamidation isoforms with chromatographic separation, improving selectivity in complex lysates.
- Analytics: Provides extracted ion chromatograms and retention time shifts that allow quantitative comparison of deamidation levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects PTM detection to functional outcomes by linking deamidation events to changes in protein activity or stability in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proteomics platform applicable across multiple targets, disease areas, and sample types without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in PTM analysis by resolving isobaric glutamine and asparagine deamidation products that conventional methods cannot distinguish.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized column chemistry and sample processing that stabilizes labile intermediates like succinimide.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into PTM-driven target instability or loss of function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on deamidation susceptibility and functional consequence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics sample preparation, chromatographic method development, and mass spectrometry data interpretation.
- Dependent on ultra-high pressure liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry instrumentation capable of long-gradient separations.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling to prevent artifactual deamidation during preparation.
- Adaptation to different model systems may require optimization of lysis and digestion conditions to preserve endogenous PTM states.
- Practical limitations include longer run times (up to 1,200 minutes) and the need for specialized column packing expertise, which may affect throughput in high-volume settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Long-length Anion-exchange (LAX) Capillary Column Packing
1:43
Tissue Sample Preparation
5:33
One-dimension Long-length Electrostatic Repulsion-hydrophilic Interaction Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) Separation and Data Analysis
6:48
Results: Separation of Deamidation Isoforms of Glutamine and Asparagine by LERLIC-MS/MS
7:34
Conclusion
