LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Het algemene doel van deze procedure is om shotgun-proteomics te gebruiken om endogene glutamine- en asparagine-deamidatieproducten in complexe proteomen te karakteriseren en kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biochemie, zoals de invloed van een spontaan en antimatische proces op het isometrische product gluteo van glutamine- en asparagime-deaminering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat glutamine-deamineringsisomeren worden gescheiden op een capillaire kolom met ionische verandering van lange lengte, waardoor de mogelijkheid om peptiden te scheiden door de isometrische punten wordt gemaximaliseerd.

Om met de kolomconstructie te beginnen, schors 50 milligram zwak anionenuitwisselingsvulmateriaal in 3,5 milliliter 90% isopropanol in water. Bevestig een vrouwelijke aansluiting op vrouwelijk, een microferal en een vrouwelijke moer aan één uiteinde van een 50 centimeter lange piekbuis met een binnendiameter van 200 micrometer. Plaats een 1/16e inch scherm met één micrometer poriën aan het uiteinde van de buis in de microferal.

Gebruik een drukpompen ingesteld op 4.500 psi om het anionenuitwisselingsmateriaal in de capillair te verpakken totdat het materiaal aan de bovenkant zichtbaar is. Bevestig een andere vrouwelijk-op-vrouwelijk aansluiting, microferal en vrouwelijke moer aan de bovenkant van de verpakte capillair aan het tegenovergestelde uiteinde om de kolom te voltooien. Was 50 tot 100 milligram weefsel gedurende vijf minuten met fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Herhaal deze wasbeurt twee keer en plaats vervolgens het gewassen weefsel in buizen met veiligheidsdoppen. Voeg aan elke buis één gewichtsequivalent van roestvrijstalen bolletjes toe en 2,5 equivalenten per volume van een waterige 100 millimolaire oplossing van ammoniumacetaat met 1% natriumdeoxycholaat. Homogeniseer het weefsel met maximale intensiteit gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Centrifugeer vervolgens het homogenaat gedurende tien minuten bij 10.000 x g en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een buis van 1,5 milliliter. Ga door met het homogeniseren en centrifugeren van het weefselpelletje en combineer de supernatanten elke keer totdat er geen pellet meer wordt waargenomen.

Kwantificeer de eiwitconcentratie in de gecombineerde supernatanten met een bicinchoninezuurtest. Voeg vervolgens aan het homogenaat een 1-molare oplossing van dithiothreitol toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een concentratie van tien millimolair dithiothreitol in het monster te bereiken. Incubeer het homogenaat in een waterbad gedurende dertig minuten bij 60 graden Celsius.

Voeg aan het homogenaat een 1-molare oplossing van iodoacetamide toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een concentratie van 20 millimolair iodoacetamide in het monster te bereiken. Incubeer het homogenaat bij kamertemperatuur in afwezigheid van licht gedurende 45 minuten. Verdun vervolgens het homogenaat met twee volume-equivalenten van een tien millimolaire oplossing van dithiothreitol in 100 millimolair ammoniumacetaat.

Incubeer het homogenaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg aan het homogenaat een voldoende volume sequencing grade gemodificeerd trypsine toe in 100 millimolair ammoniumacetaat om een eiwit-enzymverhouding van gewicht 1 tot 50 in het monster te bereiken. Incubeer het monster gedurende de nacht bij 30 graden Celsius om het homogenaat te verteren.

Demp de vertering met 0,5% van het monstergewicht aan zoutzuur, waardoor de natriumdeoxycholaatzouten worden geprecipiteerd. Vorm de monsters die SDC-zouten bevatten voorzichtig en centrifugeer de monsters gedurende tien minuten bij 12.000 x g en vier graden Celsius. Decanteer het supernatant in een nieuwe buis, zorg ervoor dat de pellet van SDC-zouten niet wordt verstoord.

Los de zouten opnieuw op in een 0,5% op volume waterige oplossing van ammoniumhydroxide, en vorm krachtig. Conditioneer een C-18-sorbenscartridge van één gram met 5 milliliter acetonitril, gevolgd door vijf milliliter van 0,1% trifluorazijnzuur in water. Laad vervolgens het verteerde monster op de cartridge.

Was de monsters drie tot vijf keer met vijf milliliter porties van 0,1% TFA. Verdun vervolgens de peptiden met vijf milliliter van een waterige oplossing van 75% acetonitril en 0,1% mierzuur. Droog de vloeistof in een vacuümconcentrator.

Voeg 200 microliter van 75% acetonitril toe, met 0,1% mierzuur aan het residu. Vorm het mengsel gedurende ten minste tien minuten, en vorm het mengsel vervolgens gedurende ten minste 30 minuten om de droge peptiden te reconstitutioneren. Verdun het monster indien nodig, zodat het geïnjecteerde monster een tot drie microgram eiwit bevat.

Verbind de LAX capillaire kolom met een ultra-hogedrukvloeistofchromatografie-instrument. Bereid 0,1% mierzuur-oplossingen in water en acetonitril voor. Stel de stroomsnelheid in op 0,4 microliter per minuut en stel een 1.200 minuten durende gradiëntrun in.

Configureer de massaspectrometer-scan-gebeurtenissen om gegevensverwerving af te wisselen tussen volledige Fourier-transformatie-massaspectrometrie en Fourier-transformatie-tandem-massaspectrometrie. Voer LERLIC MS/MS uit om de peptiden te scheiden en te karakteriseren. Gebruik de resulterende gegevens en proteomics-software om een eiwitdatabasezoekopdracht uit te voeren.

Exporteer de databasezoekresultaten naar spreadsheetsoftware. Identificeer en extraheer de lijst van deamineerde peptiden en de overeenkomstige niet-deamineerde peptiden. Extraheer de ionenchromatogrammen van elk van deze peptiden met vijf delen per miljoen massatolerantie.

Inspecteer de geëxtraheerde ionenchromatogrammen op gescheiden dubbele piekillusie van isomere producten. Met behulp van LERLIC MS/MS werden deamineerde isomeren van glutamine en asparagine gescheiden en geïdentificeerd uit een eiwitmonster bij twee verschillende retentietijden. Enzymatisch gemodificeerde intermediaire glutamineresiduen van transamidering die een omgekeerd gamma-alfa-glutamil-verhouding vertoonden, werden geïdentificeerd.

Het succ