Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd Tribolium castaneum Embryo's

Het algemene doel van dit protocol is om de ontwikkeling van Tribolium castaneum-embryo's non-invasief te observeren over zeer lange periodes. Fluorescentiemicroscopie op basis van lichtbladen helpt om vragen over morfogenese te beantwoorden in het opkomende insectmodel Tribolium castaneum, met betrekking tot celmigratie en proliferatiepatronen van de vroege blastoderm tot het begin van spierbeweging. Het grote voordeel van deze methode is dat kritieke factoren zoals fotobleking en fototoxiciteit tot een minimum worden beperkt, zelfs wanneer de embryo's gedurende meerdere dagen worden waargenomen.

Om een embryo in de monsterkamer te plaatsen met behulp van een agarosekolom, vult u eerst een spuit van een millimeter met gedistilleerd water en gebruikt u een kleine rubberen slang om de spuit op een glas capillair te bevestigen. Vul de capillair tot de helft met gedistilleerd water en gebruik vervolgens een penseel om een embryo over te brengen naar de binnenkant van de opening van het glas capillair, en steek de capillair in de vloeibare agarose terwijl u langzaam een paar microliters van de agarose samen met het embryo in de capillair trekt. Wanneer het embryo op zijn plaats zit, moet er een paar microliters agarose zowel boven als onder het embryo zijn.

Wanneer de agarose is gestold, verkort u de capillair tot een lengte van ongeveer vijf millimeter. Het resterende fragment moet volledig gevuld zijn met agarose en het embryo moet zich in de tweede kwartiel bevinden. Plaats vervolgens de stalen cilinder met de pin in de monsterkamer en bevestig het capillairfragment bovenop de pin. De agarosekolom moet enkele millimeters uitsteken van het gebied van het capillairfragment dat het embryo bevat.

Om het embryo in de monsterkamer te plaatsen met behulp van een agarosehemisfeer, trekt u eerst 200 microliter vloeibare agarose in een spuit van een millimeter en gebruikt u de spuit om de stalen buis met de monsterkamer te vullen met agarose vanaf de bovenkant van de buis totdat een hemisfeer zich vormt bij de onderste opening. Wanneer de agarose is gestold, neemt u een embryo op met de punt van een penseel en herschikt u het embryo zodat de voorkant bereikbaar wordt. Dompel de agarosehemisfeer in vloeibare agarose om de hemisfeer te bedekken met een dunne film en plaats het embryo met zijn voorkant rechtop op de paal van de agarosehemisfeer.

Draai de stalen buis en gebruik de borstel om de positie van het embryo indien nodig te corrigeren. Ideaal is dat minder dan de helft van het oppervlak van het embryo bedekt is met agarose en dat de flanken zo steil mogelijk zijn. Te veel agarose op het oppervlak van het embryo leidt tot een mechanische vernauwing en een verminderde gas- en ionenuitwisseling, wat een dramatisch effect heeft op de overlevingskans van het embryo.

Vervolgens steekt u de stalen buis langzaam in de monsterkamer. Om het embryo in de monsterkamer te plaatsen met behulp van een Cobweb-houder, selecteert u eerst een embryo met het penseel en zet u het penseel opzij. Bedek vervolgens de opening van de Cobweb-houder met vijf tot acht microliter vloeibare agarose en verwijder vervolgens het grootste deel van de agarose totdat er slechts een dunne agarosefilm overblijft.

Plaats het embryo op de agarosefilm en pas de positie zorgvuldig aan door het embryo te verplaatsen naar het centrum van de x-as van de opening en door de langwerpige voor-achterkant van het embryo uit te lijnen met de langwerpige as van de opening. Zorg ervoor dat u het embryo binnen 10-15 seconden na het aanbrengen op de agarosefilm plaatst, dat wil zeggen terwijl de agarose nog vloeibaar is, anders zal het niet goed hechten. Plaats vervolgens langzaam de Cobweb-houder in de monsterkamer en positioneer de houder zodat deze niet interfereert met het excitatie- en emissielicht.

Voor live-imagingassays configureert u eerst de time-lapse, vervolgens positioneert u in de transmissielichtmodus het embryo langs de X- en Y-as in het centrum van het gezichtsveld zonder het embryo bloot te stellen aan de laser. Draai het embryo 360 graden in stappen van 90 graden om het weefsel te onderzoeken op eventuele schade die tijdens het montageproces is opgetreden. In de fluorescentiemodus definieert u de Z-Stack voor elke richting door een ruimtelijke buffer van 25 tot 50 micrometer voor en achter het embryo toe te voegen en definieert u de Z-afstand.

Voor langdurige beeldvorming zorgt u ervoor dat de monsterkamer gevuld is met voldoende beeldvormingsbuffer en bedekt u de opening van de monsterkamer. Start vervolgens het beeldvormingsproces en bewaakt u de correcte acquisitie langs alle richtingen in alle kanalen voor alle embryo's. Aan het einde van de beeldvormingsperiode verwijdert u de monsterhouder uit de monsterkamer en brengt u het embryo over naar een objectplaat.

Als er een agarosekolom is gebruikt, gebruikt u een scherp mes om de embryo's uit de omringende agarose te extraheren. Als er een agarosehemisfeer is gebruikt, brengt u de hemisfeer met een platte kant over naar de objectplaat. Voor de Cobweb-houdermethode gebruikt u een penseel om het embryo voorzichtig van de agarosefilm te verwijderen.

Bewaar vervolgens de objectplaat met het embryo in een kleine glazen schaal in een verzadigde luchtvochtige atmosfeer onder standaardcondities totdat de larven uitkomen. Om de gegevens van het waargenomen embryo te verwerken, opent u de interessante bestanden in de juiste beeldanalysesoftware en roteert u de Z-Stacks zodat de voor-achterkant van het embryo, indien nodig, wordt uitgelijnd met de Y-as. Knip de Z-Stacks langs de X- en Y-as zodat er slechts een minimale achtergrond overblijft en bereken vervolgens de Z Maximum Projection voor elke Z-Stack.

Afhankelijk van de transgene lijn en beeldvormingsmodaliteiten, maakt u vervolgens de juiste dynamische intensiteitsaanpassingen van de tijdstapels om eventuele fotobleking of flora-expressiefluctuaties te corrigeren. Met behulp van een transgene lijn die een Histon 2B M-Emerald-fusie-eiwit tot expressie brengt onder controle van de alpha-tubuline-een-promotor, werden 66 uur embryonale ontwikkeling bij kamertemperatuur opgenomen vanaf de terugtrekking van de kiembaand tot de dorsale sluiting. Deze enhancer trap-lijn kan worden gebruikt om neuronale clusters in de hoofdbijlagen en de dynamica van cirrosa-migratie tijdens dorsale sluiting te visualiseren.

Bij het beeld