De DNA-kleurstof geactiveerde zijbevolkingsfenotype gebruiken om de kankerstamcellen van biologische monsters te detecteren en te zuiveren

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van vermeende kankerstamcelpopulaties in biologische monsters op basis van het vermogen van side population-cellen om kleurstof uit te stoten. Deze methode beantwoordt een kernvraag in het onderzoek naar kankerstamcellen met betrekking tot betrouwbare middelen voor de detectie en zuivering van kankerstamcellen uit biologische monsters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van functionele markers, wat een betere resolutie biedt.

Daarnaast is de expressie van deze ABC-geneesmiddeltransporteurs sterk geconserveerd tussen kankerstamcellen, waardoor we deze techniek voor veel verschillende soorten kanker kunnen gebruiken. De implicaties van deze techniek reiken tot de ontdekking van therapeutica tegen kankerstamcellen, omdat het downstream-analyses zoals genexpressieprofilering en targetvalidatie in sterk gezuiverde kankercellen vergemakkelijkt. Deze methode kan dus inzicht bieden in de kenmerken van kankerstamcellen.

We kunnen deze methode ook gebruiken om systemen te karakteriseren die populaties bevatten die ABC-drugtransporters tot expressie brengen, zoals het beenmerg. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elisabeth Hoflehner, een technicus uit mijn laboratorium. Begin met het kweken van de gewenste humane kankercellijn bij 37 °C in 10 tot 30 ml RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en antibiotica.

Wanneer de cellen een confluentie van ongeveer 70 tot 90% bereiken, wordt het medium verwijderd en worden twee milliliter 0,05%trypsin-EDTA toegevoegd om de cellen van het oppervlak van de kweekschaal los te maken. Was de cellen vervolgens met 10 milliliter kweekmedium, breng de suspensie over naar een schone 15 milliliter buis en centrifugeer deze bij 250 ×g bij vier graden celsius gedurende vijf minuten. Zodra de cellen zijn gepelletteerd, wordt het supernatant weggegooid en wordt het pellet geresuspendeerd in één milliliter kweekmedium.

Meng een kleine aliquot van de celsuspensie met trypaanblauw-oplossing en tel de cellen met een hemocytometer. Om testmonsters voor te bereiden, worden de cellen gesuspendeerd in vers kweekmedium om een celsuspensie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter te verkrijgen. Na het aanpassen van de celdichtheid worden drie milliliter van het monster overgebracht naar een ronde bodembuis van 15 milliliter met het label test.

Voeg vervolgens 10 micromolar violette kleurstof toe aan het monster en vortex de suspensie voorzichtig. Bereid daarna remmingscontroles voor door 500 microliter van de cel-suspensie met kleurstof over te brengen naar twee flowcytometrie-buisjes die als controle zijn gelabeld. Voeg 50 micromolar Verapamil toe aan de eerste.

Voeg 20 µM Fumitremorgin C toe aan de tweede buis. Meng de oplossingen door voorzichtig te pipetteren. Sluit alle buizen met dopjes en incubeer deze gedurende 90 minuten bij 37 °C in het donker.

Schud de monsters voorzichtig elke 15 minuten. Zodra de kleuring is voltooid, worden de inhibitiecontroles gewassen in drie tot vier milliliter ijskoud PBS. Bereid vervolgens aliquoten van het testmonster voor voor de daaropvolgende co-kleuring met antilichamen.

Was ook deze aliquots en filter alle monsters door zeefjes met een maaswijdte van 70 micron om potentiële celaggregaten te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de suspensies bij 250 ×g bij 4 °C gedurende vijf minuten. Nadat de resulterende pellet is geresuspendeerd in 100 µL PBS, worden de cellen op ijs en beschermd tegen licht bewaard.

Voeg vervolgens een passend panel van met fluorochromen geconjugeerde antilichamen toe aan de cellen die vooraf met violette kleurstof zijn gekleurd. Vortex de suspensies en incubeer deze gedurende 20 tot 30 minuten in het donker bij vier graden celsius. Was de cellen na incubatie in drie tot vier milliliters ijskoud PBS en filtreer het monster indien gewenst.

Centrifugeer vervolgens bij 250 ×g bij vier °C gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepellette cellen in 100 µL PBS. Voeg tot slot 7-AAD toe aan de cellen die vooraf zijn gekleurd met violette kleurstof.

Incubeer de monsters vervolgens vijf tot 10 minuten in het donker. Om de cellen met de flowcytometer te analyseren, wordt een passende celpopulatie geselecteerd (gate) op een FSC SSC dot plot. Sluit vervolgens, aan de hand van verschillende FSC-signalen, alle celaggregaten uit de geselecteerde populatie uit.

Sluit cellen uit die een positieve 7-AAD-kleuring vertonen om de populatie levensvatbare cellen te verkrijgen. Om een dot plot te maken voor de emissie van de blauwe en rode kleurstof, wordt het blauwe fluorescentiekanaal op de y-as weergegeven en het rode fluorescentiekanaal op de x-as. Schakel beide kanalen over naar de lineaire modus en pas de detectorspanning dienovereenkomstig aan, zodat de side population zich in het linkerondergedeelte van de plot bevindt.

Gate vervolgens de zijpopulatie. Stop daarna de acquisitie. Laad vervolgens de inhibitiecontroles en verzamel de gegevens.

Maak ten slotte een dot plot waarin de rode fluorescentie van de violette kleurstof op de x-as wordt weergegeven en een passend fluorescentiekanaal op de y-as wordt uitgezet in logaritmische modus. Laad het monster, pas vervolgens de detectorspanningen dienovereenkomstig aan en identificeer de fractie van de side population-cellen die het onderzochte oppervlak tot expressie brengen. Registreer daarna de gegevens.

Hier worden representatieve resultaten gepresenteerd van de side population-analyse uitgevoerd in menselijke eierstokkankercellen. De side population, onderscheiden door de analyse van blauwe en rood-violette emissie, werd geïdentificeerd in het linkeronderkwadrant van de dot plot en vormde 0,70% van de gehele geanalyseerde populatie. Het daaropvolgende gebruik van effluxremmers leidde tot het verdwijnen van het fluorescentiesignaal dat werd waargenomen bij de eerder geïdentificeerde cellen, wat hun side population-fenotype bevestigt.

Ten slotte werden de menselijke eierstokcellen ook gekarakteriseerd op basis van ABCG2-expressie. ABCG2-positieve kleuring werd waargenomen in 0,67% van de cellen, wat overeenkomt met de geïdentificeerde side population. Zodra men hierin vaardig is, kan deze procedure in ongeveer twee tot drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het side population-fenotype strikt afhankelijk is van een optimale verhouding tussen kleurstofconcentratie en celdichtheid. Validatie van beide variabelen wordt daarom sterk aanbevolen voorafgaand aan het experiment. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals gene expression profiling, worden uitgevoerd om side population-cellen verder te karakteriseren en zo nieuwe, kankerstamcel-specifieke targets te identificeren voor toekomstige geneesmiddelenontwikkeling.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van stamcelbiologie om de kenmerken van weefselstamcellen en kankerstamcellen te onderzoeken, zowel bij muizen als bij mensen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een violette kleurstof-getriggerde side population SA uitvoert en hoe u vermoedelijke kankerstamcellen in biologische monsters in uw eigen laboratorium kunt detecteren. Vergeet niet dat het werken met biologische monsters uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van PBM en biologische veiligheidskasten, moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.