Name: Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer autofagische flux meten door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met multispectrale imaging flow cytometrie in Jurkat-cellen. Deze methode biedt objectieve, kwantitatieve analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ik dank mijn collega&#39;s bij MilliporeSigma, Philip J. Morrissey en Sherree L. Friend, voor hun steun en begeleiding door de jaren heen. Ik wil ook Vidya Venkatachalam en Bryan R. Davidson bedanken voor hun hulp met de BDC3-functie in de IDEAS-software , Ryan P. Jessup, voor het bewerken van dit manuscript, Raymond Kong voor hulp op de dag van schieten en een speciale dank Naar make-up artiest Cynthia Xamonthiene.

<ol><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+should+autophagic+flux+be+assessed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Why should autophagic flux be assessed?</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li>
<li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18425443">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li>
<li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li>
<li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li>
<li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li>
<li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li>
<li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li>
<li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008(2015).</li>
<li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li>
<li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li>
<li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
<li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li>
<li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li>
<li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
<li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagy%3A+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li>
<li>IDEAS. <a target="_blank" href="https://www.amnis.com/images/PN_780-00959-00_RevC_IDEAS_User_Manual.pdf">Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2</a>. , (2015).</li>
</ol>

Ik ben werkzaam bij MilliporeSigma, de maker van het Amnis-merk ImageStream, dat in deze studie werd gebruikt.

Bij het uitvoeren van deze analyse zijn er een paar dingen te overwegen. Het is belangrijk om passende controlemonsters te hebben. Voor dit experiment werden twee verschillende controles gebruikt: Control en Control + Chloorquine. Het controlemonster werd gebruikt om de drempel voor de regio&#39;s in te stellen. Het vertegenwoordigt het basale niveau van autofagie zonder het stoppen van lysosomale afbraak en is de controle voor het Starved-monster. Het controlemonster is echter niet een passende controle om te vergelijken met de resultaten van het Starved + Chloroquine-monster, omdat chloroquine zelf het controlemonster beïnvloedt. Daarom was het nodig om een ​​Control + Chloroquine-monster te hebben. Voorafgaand aan het uitvoeren van een analyse voor autofagie, is het belangrijk om alleen te analyseren / poorten op afzonderlijke cellen die in focus zijn ( dwz gradiënt RMS groter dan 60), aangezien de resultaten kunnen worden beïnvloed als er meer dan één cel of de afbeeldingen zijn onscherp. Het is cruciaal dat de autofagosoomEs en lysosomen zijn in focus voor correcte spottelling en BDC3 analyse. Apoptotische cellen moeten worden verwijderd voor autofagie analyse, omdat ze resultaten kunnen scheiden en niet inbegrepen moeten zijn. Er moet gepast zijn voor alle drie markers ( dwz LC3, p62 en LAMP1). Bijvoorbeeld, alle drie markers zijn intracellulair en moeten een punctaat signaal hebben; Als het signaal niet punctueert of als het op het oppervlak van de cel ligt, zou het vlek niet passend zijn en het experiment / kleuring moet worden hergebruikt. Bovendien, om BDC3 nauwkeurig te zijn, is het essentieel om te poorten op cellen die helder zijn voor alle drie fluorescerende markers van belang. Gating op positieve gebeurtenissen is nodig om de meting van BDC3 op niet-specifieke binding, beeldende artefacten en / of geluid te voorkomen. Dit is van cruciaal belang, aangezien BDC3 potentieel kan versterken artefacten die geen echte signalen zijn. Aangezien BDC3 alleen kan worden uitgevoerd op lichte positieve gebeurtenissen, kunnen veel cellen niet in de uiteindelijke analyse worden opgenomen; Dit is vooralInderdaad waar voor controlecellen die geen accumulatie hebben van LC3, p62 en / of LAMP1. Dus, een beperking van deze analyse is dat BDC3 alleen cellen die positief zijn voor alle drie markers, die niet geschikt zijn voor alle autofagie-experimenten, onderzoekt. Zoals BDS, die eerder 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 is gemeld, houdt BDC3 alleen geen rekening met het aantal autofagieorganellen die co-lokaliseren, wat in grote mate resulteert Van variabiliteit in het aantal autofagosomen. Daarom wordt de bivariate aanpak die door Rajan et al. Was in dienst. Kijkend naar de bivariate percelen, kan men vragen ofDe cellen moeten positief zijn voor LC3, p62 en LAMP1; Waarom zijn er zo veel cellen die 0 plekken hebben? Dit komt doordat het LC3-signaal helder genoeg kan zijn voor co-lokalisatie, maar het kan wellicht niet voldoen aan de drempel die door het piekmasker is ingesteld (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) nodig om te worden beschouwd als een plek. Het hier beschreven protocol gebruikte MIFC om LC3 puncta te tellen en de co-lokalisatie van drie autofagie markers om autofagische flux te meten. Onder basale condities (Control sample) was het aantal autofagosomen laag, en er werden weinig cellen gevonden met &quot;High Spots.&quot; Met de toevoeging van chloroquine, die autofagosoom / lysosoomfusie remt, is er een toename van het aantal LC3 spots. Aangezien het lysosoom de autofagosoom en de p62, die zich in het autofagosoom bevindt, niet kan afbreken, leidt dit tot een toename van de co-lokalisatie van de accumulatie van LC3-, p62- en LAMP1-autolysosomen. Dit effect werd versterkt onder voedingssterkteIon, die autofagie induceert. Echter, zonder de toevoeging van chloroquine, was er geen significante toename van het aantal autofagosomen, waarschijnlijk door een toename van de snelheid van autofagische omzet. Wanneer cellen in de aanwezigheid van chloroquine werden uitgehongerd, was er een toename van de co-lokalisatie en het aantal autofagosomen, die de conclusie bevestigt dat hongersnood autofagische flux toeneemt. EBSS is bekend als een krachtige inductor van autofagie. Daarom wordt verwacht dat de toename groot zou zijn. Als een andere werkwijze, zoals medicijninductie, wordt gebruikt om autofagie te veroorzaken, kan het verschil tussen de controle en de behandelde monsters subtieler zijn. Dit specifieke protocol was ontworpen om autofagie in menselijke cellijnen te meten, maar de analyse zou kunnen worden aangepast aan andere soorten door over te schakelen naar antilichamen voor die bepaalde soort. Bovendien kan de analysemethode gebruikt worden voor elke intracellulaire applicatie die co-lokalisatie vereistVan drie probes / markers.

Macroautophagy, hierna aangeduid als autofagie, is een catabolische weg waarin beschadigde of disfunctionele componenten, langlevende eiwitten en organellen worden afgebroken via het lysosoom en worden gerecycleerd 1 . Autofagy is een dynamisch, veelzijdig proces dat de vorming van een autofagosoom omvat; De fusie van het autofagosoom met het lysosoom, het vormen van het autolysosoom; En de afbraak van de inhoud van het autolysosoom 2 . De cruciale biologische marker die gebruikt wordt om autofagie bij zoogdierstelsels te identificeren is de microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-lichte keten 3 (LC3), die het autofagosomale membraan vormt. Tijdens autofagie wordt cytosolische LC3-1 geconjugeerd aan fosfatidylethanolamine om LC3-II te vormen; LC3-II wordt dan opgenomen in het autophagosomale membraan 3 . Een andere veel gebruikte marker voor autofagische flux is de autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) die fysiek liNx autofagische lading naar het autofagische membraan 4 , 5 . Methoden die traditioneel zijn gebruikt om autofagie te meten zijn Western blots en fluorescentiemicroscopie 7 . Echter, geen van deze methoden worden beschouwd als de &quot;gouden standaard&quot;, 2 , 6 aangezien er uitdagingen zijn die samenhangen met beide van deze technieken. Westerse blots geven alleen een gemiddelde omdat ze een homogenaatmonster gebruiken, dus waarnemers kunnen niet zien wat er gebeurt in individuele cellen. Aan de andere kant geeft de fluorescentiemicroscopie een waarnemerinformatie op het single-celniveau, maar ontbreekt de doorvoermogelijkheden waardoor het moeilijk om objectieve en statistisch nauwkeurige evaluaties te verkrijgen. In de afgelopen jaren is de meting van LC3 en p62 door multispectrale beeldvormende flowcytometrie (MIFC, zie de Tabel van Materialen ) populair gewordenZeldzaamheid als gevolg van zijn kwantitatieve kracht, hoge capaciteit voor capaciteit, multiplexpotentieel en het vermogen om elke cel te maken. Een van de meest gebruikte methoden om autofagie te meten met behulp van MIFC, samen met zijn metgezelanalysesoftware (zie de Tabel van Materialen ), is door middel van de spottelling van LC3 puncta of autofagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Een toename van autofagosomen betekent echter niet dat er een toename van autofagie is, aangezien het ook een blokkade in het proces zou kunnen vormen 2 . LC3-II omzet is een nuttige parameter om autofagische flux te meten door cellen in aanwezigheid en analyse te analyserenAfwezigheid van een lysosomale afbraakremmer, zoals chloroquine. Chloorquine remt de fusie van het autofagosoom tegen het lysosoom, waardoor de kwantificering van de autofagosoomvorming als een maat van de mate van autofagie wordt toegestaan ​​door autofagische flux te stoppen voordat de lysosomale afbraak kan optreden 18 . Bovendien wordt p62 hoofdzakelijk door autofagie afgebroken en als de lysosomale afbraak van het autofagosoom en de inhoud daarvan geblokkeerd wordt, wordt een accumulatie van p62 17 , 19 verwacht. Autophagy is een multistep proces, en de meting van LC3 of P62 alleen geeft geen volledige beeld van wat er in de cellen gebeurt. Recente publicaties hebben de nadruk gelegd op de noodzaak om de gelijktijdige vorming van de autolysosomen 2 , 17 , 20 , 21 te onderzoeken . MIFC isander in staat de vorming van de autolysosome meten door beeldvorming van de co-lokalisatie van de autophagosome het lysosoom 15-17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Daarnaast is de co-lokalisatie van p62 en LC3 met behulp van MIFC ook onderzocht om autofagische flux 5 te meten. In de verwijzende analysesoftware wordt de &#39;functie&#39; die co-lokalisatie meet, &#39;Bright Detail Similarity R3&#39; genoemd (BDS) en werd specifiek ontworpen om de kleine, heldere beelddetails van twee beelden te vergelijken. BDS is de log-getransformeerde Pearson&#39;s correlatiecoëfficiënt van de gelokaliseerde heldere plekken met een straal van 3 pixels of minder; Met andere woorden, BDS berekent de mate van oVerlapping pixels uit twee verschillende fluorescerende kanalen. De heldere plekken zijn ofwel gecorreleerd ( dwz dezelfde ruimtelijke locatie) of ongecorreleerde ( dwz verschillende ruimtelijke locaties). Daarom varieert de correlatiecoëfficiënt tussen 0 (uncorrelated) en 1 (perfecte correlatie). De coëfficiënt is log-getransformeerd om het bereik te verhogen tot tussen nul en oneindigheid 26 , 27 . BDS alleen kan niet voldoende zijn; Rajan et al. Bleek dat het gebruik van alleen BDS kan leiden tot false-positieve of false-negative results 21 . BDS evalueert de co-lokalisatie van twee markers van autofagie, maar beschouwt niet het aantal autofagosomen. Om rekening te houden met het aantal autofagosomen, Rajan et al. Inbegrepen spot-counting van de LC3 puncta 21 . Rajan et al. Voorgesteld met behulp van een bivariate scatter plot van LC3 spot count versus BDS. Met behulp van deze bivariate plot, werkten twee populatiesE eerst geïdentificeerd: een met cellen met een hoog niveau van LC3 plekken en een met cellen met een laag niveau van LC3 plekken. De hoge LC3-spotbevolking werd verder ingedeeld in twee populaties: cellen met lage co-lokalisatie (dat wil zeggen accumulatie van autofagosomen) en cellen met hoge co-lokalisatie (dat wil zeggen accumulatie van autolysosomen). Deze bivariate plot maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen cellen met zeer weinig autofagosomen en cellen met een accumulatie van autofagosomen en / of autolysosomen 21 . Tot nu toe was de gelijktijdige co-lokalisatie van LC3, p62 en LAMP1 (lysosomale marker) niet mogelijk met behulp van een enkele &quot;Feature Type&quot; in de MIFC Companion Analysis Software (zie de Tabel van Materialen ). Echter, een nieuwe functie, die onlangs in versie 6.1 is geïntroduceerd, heet Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergelijkt de heldere detailafbeeldingen van elk van de drie afbeeldingen (in dit geval LC3, p62 en LAMP1) en kwantificeert de co-lokalisatie van de drie probes ( dwz LC3, p62 en LAMP1). De BDC3-functie berekent de correlatiecoëfficiënt van Pearson die is aangepast om uit te breiden naar drie afbeeldingen. Aangezien de felpunten in de drie afbeeldingen gecorreleerd of ongecorreleerd zijn, varieert de correlatiecoëfficiënt tussen 0 (uncorrelated) en 1 (perfecte correlatie). De coëfficiënt is log-getransformeerd om het dynamische bereik tussen 0 en oneindigheid te verhogen. Door de BDS functie uit te schakelen met de BDC3 functie, de analysemethode gepresenteerd door Rajan et al. Kan nu de drie meest gebruikte markers opnemen om autofagie in één systeem tegelijk te meten. De mogelijkheid om deze drie markers van autofagie in een enkele analyse te co-lokaliseren kan leiden tot nieuwe inzichten in de inductie en regulering van autofagie. Het volgende protocol geeft een overzicht van de stappen om autofagie in Jurkat-cellen te veroorzaken; Label de cellen met LC3, p62 en LAMP1 antilichamen; Gegevens verwerven op een multispEctrale beeldvormende flow cytometer; En analyseer de gegevens om autofagische flux te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentration 400 &micro;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45- PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-human CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&nbsp; Concentration 2 mg/mL.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&nbsp; Concentration 0.5 mg/mL.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp;Ca++Mg++ Free&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&nbsp; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&nbsp; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&nbsp; Potential cancer hazard.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>You can use any ultrapure water or deionized water.&nbsp; Fill container with 900 mL of Rinse.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sheath - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X&nbsp; Ca++MG++ free.&nbsp; Fill container with 900 mL of Sheath.</td></tr><tr><td>Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran

autofagische flux beoordelen door lc3-, p62- en lamp1-co-lokalisatie met behulp van multispectrale imaging flow cytometry

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autofagie is een catabolische weg waarin normale of disfunctionele cellulaire componenten die tijdens groei en differentiatie accumuleren, worden afgebroken via het lysosoom en worden gerecycled. Tijdens autofagie wordt cytoplasmatisch LC3-eiwit gelipideerd en gewerkt aan de autofagosomale membranen. De autofagosoom versmelt dan met het lysosoom om het autolysosoom te vormen, waar de afbraak van de autofagosoom vesikel en de inhoud ervan voorkomt. Het ubiquitine-geassocieerde eiwit p62, dat bindt aan LC3, wordt ook gebruikt om autofagische flux te controleren. Cellen die autofagie ondergaan, dienen de co-lokalisatie van p62-, LC3- en lysosomale markers aan te tonen. Immunofluorescentiemicroscopie is gebruikt om visueel LC3 puncta, p62 en / of lysosomen op basis van per cel te identificeren. Een objectieve en statistisch strenge beoordeling kan echter moeilijk worden verkregen. Om deze problemen te overwinnen werd multispectrale beeldvormende flowcytometrie gebruikt, samen met een analytische functie die de heldereStaart beelden van drie autofagie markers (LC3, p62 en lysosomale LAMP1) en kwantificeert hun co-lokalisatie, in combinatie met LC3 spot counting om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Deze analysemethode maakt gebruik van meerdere functies om autofagische flux te bepalen. Om de definitieve bivariate plot volledig te begrijpen, moeten de individuele analyse-eigenschappen eerst worden onderzocht. Het tellen van autofagosomen is een logische manier om autofagie te meten. De grootte / vorm / helderheid van LC3 puncta kan echter drastisch variëren tussen cellen. Variatie kan het moeilijk maken om autofagosomen handmatig te tellen of met behulp van een spot-count functie in de analysesoftware. Daarom zal geen spot-count functie perfect zijn door deze grote variabiliteit in autofagosomen. Echter, een goede spot-count functie zal werken op de meeste cellen 26 . Figuur 3 toont voorbeelden van spotmaskeren van LC3 puncta in Jurkat-cellen met behulp van verschillende spotmaskers. De spot-count-functie die voor deze dataset is geselecteerd, is Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 4) _4, wat betekent dat de spot-count-functie de punten heeft geteld die de peAK masker geïdentificeerd in het standaard kanaal 11 masker (M11) op kanaal 11 (Ch11-LC3-AF647) met een achtergrondverhouding van 4 (Bright, 4). Figuur 4 toont spot-count histogrammen en representatieve afbeeldingen voor de gemiddelde spottelling voor de Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen gemarkeerd met anti-LC3-AF647. De Control en Starved gemiddelde spot tellingen zijn niet significant verschillend; Met toevoeging van chloroquine is er een groot verschil in het gemiddelde van de Control + Chloroquine vergeleken met de Starved + Chloroquine. De volgende functie om te onderzoeken is BDC3. BDC3 is een meting van de co-lokalisatie van drie markers / probes, in dit geval LC3, P62 en LAMP1. Figuur 5A - 5D toont BDC3 histogrammen voor de Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen gemerkt met anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE en anti-LC3-AF647. Er is een verschuiving tussen de Control-gemiddelde voor de Starved-gemiddelde, evenals de Control + Chloroquine gemeen op de Starved + Chloroquine-gemiddelde. Kijkend naar de beelden van cellen uit de gemiddelde BDC3 scores in Figuur 5E - 5H , is er echter een groter verschil tussen de monsters dan de histogrammen kunnen leiden tot een geloof. Dit komt doordat BDC3 het aantal autofagieorganellen die co-lokaliseren niet in aanmerking neemt, resulterend in een grote mate van variabiliteit in het aantal autofagosomen voor dezelfde BDC3-score. In de meeste gevallen bestaat er een overlap tussen alle drie de probes, omdat zelfs bij basale niveaus p62, LAMP1 en LC3, in zekere mate co-lokaliseren of verblijven in soortgelijke gebieden in de cellen. In contrast, een voorbeeld van drie probes die niet co-lokaliseren, zijn anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 en DAPI nucleaire kleurstof voor het Starved + Chloroquine-monster, weergegeven in Figuur 6. &lt;/ P&gt; Wanneer de spot-count-functie en de BDC3-functie worden gecombineerd, zijn de aanwezigheid van verschillende subpopulaties die het vermogen om onderscheid te maken tussen de verschillende monsters / condities te verbeteren, duidelijk. Figuur 7 toont de bivariate plot van spottelling van LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 voor de vier monsters: Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine. Het Control-monster werd gebruikt om de poortstrategie voor drie populaties vast te stellen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3. De controle monsters aangetoond dat meer dan 98% van de cellen 1 of minder vlekken hadden. De grens tussen de High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3 werd vastgesteld op een BDC3 score van 1 omdat meer dan 91% van het Control-monster een BDC3 score van minder dan 1 had. Een samenvatting van de resultaten voor de bivariate plots Is weergegeven in tabel 1 . leeftijd = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figuur 1: MIFC-instrumentinstelling. Een schermafbeelding van de MIFC-instrumentinstellingen die voor dit experiment worden gebruikt, zoals beschreven in stap 8 van het protocol. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figuur 2: Analyse Software Gating Strategie. Een screenshot van het analyse software gateway schema, beschreven in stap 9 van het protocol. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat-celbeelden en maskers zijn gebruikt om de spot-count functie te creëren. Getoonde zijn BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 5,3,1) en Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 6,2,1). Het masker dat het beste werkte voor alle getoonde cellen was Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figuur 4: LC3 Spot-Count Histogrammen. Met behulp van de spot-count functie Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 en de LC3-AF647 spot-count histogrammen voor Control ( A , lichtblauw), Control + ChloroquinE ( B , blauw), Starved ( C , roze), en Starved + Chloroquine ( D , rood). De gemiddelde puntentellingen voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine zijn respectievelijk 0,07, 1,13, 0,10 en 2,77. BF, LC3-AF647 (rood), DAPI-nucleaire kleurstof (blauw) en een composiet van de LC3-AF647- en DAPI-beelden van representatieve cellen voor de gemiddelde spottelling worden getoond voor Control ( E , 0 spots), Control + Chloorquine F , 1 spot), Starved ( G , 0 spots), en Starved + Chloroquine ( H , 3 spots). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figuur 5: BDC3 Histogrammen van p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogrammen voorControle ( A , lichtblauw), Control + Chloroquine ( B , Blauw), Starved ( C , Roze) en Starved + Chloroquine ( D , rood). De gemiddelde BDC3 score voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine zijn respectievelijk 0,57, 0,82, 0,74 en 0,98. B F; P62-AF488 (groen); LAMP1-PE (geel); LC3-AF647 (rood); En een composiet van de p62-AF488, LAMP1-PE en LC3-AF647 afbeeldingen van representatieve cellen voor de gemiddelde BDC3 worden getoond voor Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) en Starved + Chloorquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figuur 6: BDC3 Histogrammen van p62 / LC3 / DAPI voor de Starved + Chloroquine Sample. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram voor het Starved + Chloroquine monster wordt getoond. De gemiddelde BDC3 score is 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (groen); LC3-AF647 (rood); DAPI (blauw); En een composiet van de p62-AF488-, LC3-AF647- en DAPI-beelden van representatieve cellen voor de gemiddelde BDC3 wordt getoond voor het Starved + Chloroquine-monster. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figuur 7: Bivariate Plots van LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate plots van LC3 spot count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen. ( B ) BF; P62-AF488 (groen); LAMP1-PE (geel); LC3-AF647 (rood); En een compositie van de p62-AF488-, LAMP1-PE- en LC3-AF647-beelden van drie regio&#39;s ( dwz Low Spots, High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3) worden getoond voor het Starved + Chloroquine-monster. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Celtelling </td><td> Heldere Detail Colocalisatie 3 Betekenis </td><td> Spot Count LC3 Mean </td><td> % Lage punt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Controle </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Control + Chloorquine </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Uitgehongerd </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31,0 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Samenvatting van Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Het algemene doel van dit experiment is om de colocalisatie van drie autofagiemarkers te kwantificeren in samenhang met de kwantificering van LC3-puncta, om autofagie op een objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste manier te meten. Deze methode maakt het mogelijk om de colocalisatie van drie autofagiemarkers in één enkele assay te meten, wat potentieel kan leiden tot nieuwe inzichten in de inductie en regulatie van autofagie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat drie autofagiemarkers gelijktijdig kunnen worden gemeten op een objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze.Begin met het toevoegen van twee keer 10⁶ Jurkat-cellen aan individuele centrifugebuisjes van 15 milliliter, gelabeld met de overeenkomstige monsternamen. Voeg vervolgens aan elke buis voldoende wasbuffer toe om het uiteindelijke volume van elk monster aan te vullen tot 15 milliliter en pellet de monsters door centrifugatie. Resuspendeer de pellets in 100 µL 4% formaline en breng de monsters vervolgens over naar gelabelde gesiliconiseerde polypropyleen microcentrifugebuisjes.Was na 10 minuten bij kamertemperatuur de monsters in één milliliter vers wasbuffer. Resuspendeer de pellets in 100 microliters van het eerste antilichaam van belang in permeabilisatiebuffer voor een incubatie van 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht. Was de gelabelde en gepermeabiliseerde cellen in één milliliter verse permeabilisatiebuffer en label ze met het volgende antilichaam van belang, zoals zojuist gedemonstreerd.Nadat alle monsters zijn gelabeld met het laatste antilichaam, worden de pellets opnieuw gesuspendeerd in een 1% formalineoplossing, gevolgd door de toevoeging van 10 µL 10x DAPI-kernkleuring. Meng de cellen door middel van licht vortexen en incubeer de monsters vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Laad na afloop van de incubatie de standaardtemplate in de multispectrale imaging-flowcytometer en selecteer de juiste lasers.Voer het gewenste laservermogen in het venster naast elke laserknop in en klik vervolgens op de laadknop om de buis van 1,5 milliliter in het instrument te laden. Maak een dotplot van area M01 versus aspect ratio M01 voor de gehele populatie en trek een regio rond de cellen. Noem deze regio Cell.Stel de acquisitieparameters in. Geef de bestemmingsmap en bestandsnaam op, wijzig het aantal events naar 5.000, selecteer vervolgens de celpopulatie en klik op 'acquire' om het bestand te verwerven en verwerk de rest van de monsters zoals zojuist gedemonstreerd onder dezelfde laserinstellingen. Klik na het verzamelen van het bestand op 'return' om de monsterbuis terug te halen.Om de multispectrale imaging flowcytometriegegevens te analyseren, klikt u op 'start analysis' om de wizard voor het openen van bestanden in de software voor beeldanalyse uit te voeren, klik vervolgens op het icoon voor de apoptose-wizard en op de knop 'select wizard' om de apoptose-wizard te openen. Nadat alle apoptotische cellen uit de analyse zijn verwijderd, maakt u een regio rond de niet-apoptotische cellen en labelt u deze populatie als 'cells'. Klik vervolgens op het icoon voor de bouwstenen (building blocks).Selecteer fluorescentie-positieven voor één kleur, selecteer de celpopulatie en intensiteit MC-kanaal drie. Label de x-as als intensiteit lamp één en trek een regio die de cellen met intensiteiten groter dan 10.000 omvat. Label deze regio als lamp één positief.Nadat de P62- en LC3-positieve cellen op dezelfde manier zijn gegated, klikt u op het tabblad analysis en selecteert u mask. Klik op new en vervolgens op function. Selecteer onder function de optie peak.Selecteer onder mask M11. Selecteer onder channel kanaal 11. Stel de spot-to-cell background ratio in op vier.Klik vervolgens op oké om het venster van de gedefinieerde maskerfunctie te sluiten en daarna op oké om het masker aan de maskerlijst toe te voegen. Klik op sluiten om de maskermanager te verlaten, klik vervolgens opnieuw op het tabblad analyse en selecteer kenmerken. Klik op nieuw.Selecteer onder feature type de optie spot count en selecteer het peak mask dat zojuist is gemaakt. Voer spot count LC3 in als naam en klik op oké. Klik opnieuw op new.Select onder kenmerktype 'bright detail colocalization three' of BDC3. Selecteer onder masker 'MC'. Selecteer onder afbeelding één kanaal twee voor P62. Selecteer onder afbeelding twee kanaal drie voor lamp één.Select onder afbeelding drie kanaal 11 voor LC3. Voer BDC3p62/LAMP1/LC3 in als naam en klik op oké en sluit om de feature manager te verlaten. Klik op het nieuwe icoon voor de scatterplot en selecteer de LAMP1-positieve, p62-positieve en LC3-positieve populatie.Selecteer BDC3/p62/LAMP1/LC3 voor de X-as en de spot count LC3-feature voor de Y-as en klik op OK. Selecteer onder het bestandmenu de optie 'save data analysis file', en klik op opslaan en ja om de data van de uitgehongerde cellen plus chloroquine op te slaan als een data-analysebestand en om de vorige versie van het bestand te vervangen. Open nu het controlebestand en selecteer de juiste compensatiematrix en het data-analysebestand van de uitgehongerde cellen plus chloroquine als sjabloon.Klik op oké. Om regio's te creëren voor de autofagosoomaccumulatie en de autolysosoomaccumulatie, opent u het controlemonster en tekent u een rechthoekige regio van de 0,1 tot 3 x-as-coördinaten en de 1,5 tot 0,3 y-as-coördinaten. Noem deze regio 'low spots'.Teken vervolgens een gebied van 0,1 tot 1 op de X-as en van 17,5 tot 1,5 op de Y-as en noem dit gebied "high spot low BDC3". Teken daarna een gebied van 1 tot 3 op de X-as en van 17,5 tot 1,5 op de Y-as en noem dit gebied "high spots/high BDC3". Sla het controlebestand op zodat het als sjabloon kan worden gebruikt, en open vervolgens de andere bestanden, inclusief het bestand voor "starved plus chloroquine", waarbij het controlebestand als sjabloon wordt gebruikt zoals eerder gedemonstreerd. De grootte, vorm en helderheid van de LC3-puncta kunnen sterk variëren tussen cellen, zoals waargenomen bij deze spot-maskeringen van LC3-puncta in Jurkat-cellen met behulp van verschillende spot-masks.Het masker dat het beste werkte voor dit experiment was peak, met een spot-tot-celachtergrondverhouding van vier. In deze representatieve spot-tellingen van anti-LC3 gelabelde Jurkat-cellen verschillen de gemiddelde spot-tellingen van de controle- en uithongergroep niet significant. Wanneer chloroquine wordt toegevoegd, is een groot verschil waarneembaar in het gemiddelde van de controle plus chloroquine vergeleken met het gemiddelde van de uithongergroep plus chloroquine.In dit experiment was er een verschuiving tussen het gemeten gemiddelde van de BDC3-colokalisatie van de controlegroep en dat van de uitgehongerde groep, evenals tussen het gemiddelde van de controle plus chloroquine en dat van de uitgehongerde groep plus chloroquine. BDC3 houdt geen rekening met het aantal colokaliserende autofagie-organellen, wat resulteert in een grote mate van variabiliteit in het aantal autofagosomen voor dezelfde BDC3-score. In de meeste gevallen is er inderdaad overlap tussen alle drie de probes, omdat p62, LAMP1 en LC3, zelfs bij de Beyza-niveaus, tot op zekere hoogte in vergelijkbare regio's van de cellen zouden moeten colokaliseren.Ter contrast volgt hier een voorbeeld van de BDC3-functie bij drie probes die niet zouden moeten colocaliseren: P62, LC3 en DAPI. Wanneer het aantal spots en de BDC3-functies worden gecombineerd, wordt de aanwezigheid van de verschillende subpopulaties duidelijk, wat het vermogen om onderscheid te maken tussen de diverse monsters en condities heeft verbeterd.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer acht uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Indien echter een andere functie voor het tellen van spots vereist is, is extra analysetijd nodig. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de juiste controles te gebruiken.Gebruik bijvoorbeeld de controlemonster om de drempelwaarden voor het Beyza-niveau in te stellen en het monster met controle plus chloroquine als controle voor het monster met uithongering plus chloroquine. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor andere intracellulaire toepassingen die de colocalisatie van drie verschillende markers vereisen, door simpelweg over te stappen op de gewenste specifieke antilichamen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u cellen labelt met autofagie-markers, gegevens verzamelt op een multispectrale imaging flowcytometer en de gegevens analyseert om de autofagische flux te beoordelen.Vergeet niet dat het werken met formaline extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.

Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom

Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Leer autofagische flux meten door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met multispectrale imaging flow cytometrie in Jurkat-cellen. Deze methode biedt objectieve, kwantitatieve analyse.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Meer video's verkennen