In Vitro Groei van de Preantral follikels muis onder gesimuleerde microzwaartekracht

In vitro groei van preantrale muisblaasjes onder gesimuleerde microzwaartekracht. De volledige procedure kan worden onderverdeeld in vier delen. Deel één: het mechanisch isoleren van de follikels uit de eierstokken met behulp van naalden onder een stereomicroscoop.

Deel twee: inkapselen van een enkel follikel door deze met een pipette in het midden van elke alginaatkraal te plaatsen. Deel drie: overbrengen van de alginaatkralen met de enkelvoudige follikels naar de kweekmediumdruppel in het roterende kweeksystem dat gesimuleerde microzwaartekracht genereert. Deel vier: opvangen van de alginaatkralen en decapsuleren van de follikels uit de alginaatkralen door incubatie in medium aangevuld met alginaatlyase gedurende 30 minuten bij 37 °C.

Isolatie en inkapseling van follikels. Verzamel de eierstokken in handlingsmedium en plaats de eierstokken vervolgens in een centraal geplaatste wellplaat. Onder een stereomicroscoop worden de follikels met twee naalden uit de eierstokken geïsoleerd.

Zorg ervoor dat het vasomembraan niet wordt beschadigd. Bereid een schaaltje voor met druppels medium en bedek dit met de olie. Breng de follikels over naar het voorbereide schaaltje.

Was de follikels in het nieuwe medium en breng ze vervolgens over in de druppels medium. Eén druppel medium bevat een enkele follikel. Bereid een gecentreerde cultuurset voor en voeg de inkapselingsoplossing toe aan de buitenste cirkel.

Bereid een flacon van de 0,8% alginaatoplossing voor. Voeg 0,5 µL van de alginaatoplossing toe in het midden van de schaal. Voeg druppels van de alginaatoplossing toe aan de encapsulatieoplossing in de buitenste cirkel van de schaal.

Breng het follikel over naar de alginaatoplossing in het midden van de schaal. Spoel de follikels met de alginaatoplossing. Breng de follikels via het zachte oppervlak van de oplossing over naar het midden van elke alginaatkraal.

Elke alginaatkraal bevat één enkel follikel. Spoel de alginaatkralen met de inkapselingsoplossing om de kralen te laten stollen. Verplaats de alginaatkralen naar een nieuwe schaal met hanteermedium.

In vitro-kweek van ingekapselde follikels onder gesimuleerde microzwaartekrachtbehandeling. Voeg voor de controlegroep 150 milliliter kweekmedium toe aan een nieuwe schaal en bedek deze met olie. Breng drie alginaatbolletjes over naar de druppel medium.

Incubeer de schaal in een dioxide-incubator voor kweek. Bereid voor de behandeling met gesimuleerde microzwaartekracht een schaal met olie voor, verwijder de poortdop en voeg de olie via de open poort toe aan het vat, totdat het vat bijna vol is. Voeg 50 milliter kweekmedium toe aan de olie.

Breng drie alginaatkralen over naar de druppel medium. Plaats de dop van de open poort terug. Luchtbellen in het vat moeten worden verwijderd.

Verwijder de dop van de spuitenpoort. Plaats twee spuiten met olie op de spuitenpoort. Verplaats de luchtbellen onder de spuitenpoort.

Trek de bellen in de spuit en injecteer hetzelfde volume olie vanuit de andere spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het vat zitten. Sluit de kleppen, verwijder de spuiten en plaats de dop van de spuitpoort terug.

We hebben reeds vier vaten met alginaatparels klaargezet. Nu is het tijd om de vaten in de roterende basis te bevestigen. Stel de rotatiesnelheid zo in dat de druppel medium in een staat van evenwicht verkeert.

Plaats zowel de vaten als de basis in een kooldioxide-incubator voor de kweek. Vervang het kweekmedium. Verwijder de dop van de open poort en verzamel de alginaatkralen en de olie in een nieuwe schaal.

Zoek de alginaatkralen en breng deze over naar een schaaltje met het hanteermedium. Stel het vaatkweeksysteem opnieuw in zoals voorheen. Terughalen van de follikels.

Verwijder de dop van de open poort en verzamel de alginaatkralen en de olie in een nieuw schaaltje. Scheid de gedecapsuleerde follikels van de alginaatkralen door deze gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen in handlingsmedium, aangevuld met alginaatlyase.Resultaten. De celviabiliteitsassay toonde aan dat de enkelvoudige follikels die onder normale zwaartekrachtcondities zijn gekweekt, meer levende cellen en minder dode cellen bevatten dan de follikels die onder gesimuleerde microzwaartekrachtcondities zijn gekweekt.

De follicikelgrootte nam onder beide zwaartekrachtcondities significant toe. Conclusie. Onze methode biedt een model om de mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de in vitro ontwikkelingsprocessen van oocyten en granulosa-cellen onder gesimuleerde microzwaartekrachtcondities.