Cardiac Spier-Cell Based Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - DEEL 1

Het algemene doel van deze video is om te beschrijven hoe een biologische actuator kan worden ontwikkeld en gekarakteriseerd met behulp van flexibele PDMS-cantilevers in cardiomyocyten. Deze actuatoren worden vervolgens geïntegreerd met een aangepaste basis om een zelfstabiliserende zwemmende biorobot te vormen. De hier beschreven verificatiemethode is uniek, waarbij de mechanische basisstructuur wordt aangepast om een zelfstabiliserende zwemmende biorobot te vormen waarvan de positie tevens extern met magneten kan worden bepaald.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de basiseigenschappen eenvoudig kunnen worden aangepast om het drijfvermogen van het apparaat af te stemmen en voor zelfstabilisatie. De methode kan worden toegepast voor de ontwikkeling van andere innovatieve apparaten die zelfstabilisatie en drijfvermogen vereisen. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat het mechanisch vervormen van de cantilevers uitdagend is.

Vanwege hun geringe dikte kunnen ze gemakkelijk scheuren of in vreemde vormen vast komen te zitten. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen en de assemblage moeilijk te leren zijn zonder visuele ondersteuning. Begin met het plaatsen van een siliciumwafer op een photoresist-spinner.

Breng een dunne laag fotoresist aan op de wafer en spin-coat deze bij 2,000 RPM gedurende 20 seconden om een doeldikte van 1.2 micrometers te verkrijgen. Gebruik vervolgens een waferpincet om de gecoate wafer over te brengen naar een warmteplaat die is voorverwarmd tot 120 degrees Celsius. Dek de wafer af met een ondiepe Petrischaal en bak deze gedurende 10 minuten.

Weeg zes gram van een PDMS-basis af en meng dit met 0,6 gram van een PDMS-uithardingsmiddel. Meng de PDMS-componenten grondig gedurende vijf minuten. Plaats het PDMS-mengsel in een vacuümkamer en trek een vacuüm van 100 millibar gedurende 30 minuten.

Wanneer dit is voltooid, verbreek het vacuüm en verwijder de container. Houd de container afgedekt totdat de PDMS nodig is. Zodra de wafer is afgekoeld, plaatst u deze terug op de photoresist-spinner.

Giet het volledige ontgaste PDMS-mengsel langzaam op de wafer, zodat er geen nieuwe bellen ontstaan. Spin-coat de wafer vervolgens gedurende vijf minuten bij 1.200 RPM. Verwijder de wafer met een wafer-pincet uit de spin-coater en plaats deze in een voorverwarmde oven.

Bak de wafer een nacht en laat de wafer vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Bereid daarna een lasersnijmachine voor om de dunne PDMS-filmlaag te patroneren. Begin met het inschakelen van de lasersnijmachine en het bijbehorende afzuigsysteem.

Zet vervolgens de computer aan die is aangesloten op de lasergraveermachine en open de software van de lasergraveermachine. Open onder Bestand het ontwerpbestand van de biologische actuator. Druk op de knop Instellingen, klik op Blauw en wijzig de vermogensinstelling naar 3% en de snelheid naar 4%. Klik op Instellen, klik op Rood en wijzig de modus naar Overslaan.

Klik vervolgens op Set. Doe hetzelfde voor Black. Druk op de knop Apply om de instellingen te voltooien.

Selecteer vervolgens Activeer Graveermachine. Druk daarna op Herpositioneer om het ontwerp naar het midden van het scherm te verplaatsen. Druk vervolgens op de knop Focusweergave en klik op de rand van het ontwerp om de geleidende laserpunt naar het betreffende punt te verplaatsen.

Lijn de wafer zorgvuldig uit met de geleidingslaserpunt met behulp van handschoenen. Zodra de uitlijning is voltooid, selecteer Start Engraving the Prior Job om het graveerproces te starten. Om de basis van de biologische actuator te vervaardigen, is een bakcontainer nodig.

Plaats eerst de container op een weegschaal en zet de weegschaal op nul. Giet vervolgens het vooraf gemengde PDMS in en plaats gereinigde glazen kralen met een diameter van 3 millimeter met regelmatige tussenpozen op het PDMS-mengsel. Laat rond elke kraal ten minste 5 millimeter ruimte over voor de basis van de biologische actuator.

Plaats de houder in een vacuümkamer, verlaag het vacuüm tot 100 millibar en schakel de vacuümpomp uit. Verbreek na 30 minuten het vacuüm en verwijder de houder. Houd de houder afgedekt tot deze nodig is.

Verwarm vervolgens een warmteplaat tot 40 °C en plaats de container met PDMS en de glasparels voorzichtig op de warmteplaat. Dek de container af en laat deze een nacht bakken. Gebruik na het afkoelen een scheermesje om kubussen van 5 mm uit het bulk-PDMS te snijden, zodanig dat elke kubus één glasparel in het centrum bevat.

Doop vervolgens de punt van een naald in vers bereid vloeibaar PDMS en plaats een druppel van het PDMS op het gegraveerde basisgedeelte van de wafer. Versmeer de druppel zodat deze het basisgedeelte van 5 millimeter bij 5 millimeter volledig bedekt. Gebruik tot slot een pincet om de kubus met het glazen kraaltje op het met vloeibaar PDMS bedekte basisgedeelte te plaatsen.

Herhaal dit proces voor elk apparaat. Wanneer dit is voltooid, brengt u de wafer over naar een warmteplaat van 40 degree Celsius en bedek deze om deze een nacht te bakken. Gebruik een scherp pincet om de cantilever van de wafer af te pellen en deze aan de zijwand van de basis te bevestigen.

Koppel vervolgens voorzichtig de gehele assemblage los van de wafer door aan de basis te trekken. Om te beginnen, herhaal het fabricatieproces dat is gebruikt voor de biologische actuatoren tot en met de stap van het lasergraveren. Gebruik echter bij de fabricage van biorobots het biorobotontwerp tijdens het lasersnijden.

Bereid vervolgens het micro-ballon PDMS-mengsel en het nikkelpoeder PDMS-mengsel voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Giet de oplossingen zorgvuldig in afzonderlijke containers met behulp van een weegschaal. Plaats beide containers in een vacuümkamer en verlaag de druk tot 100 millibar gedurende 30 minuten.

Plaats de containers na het ontgassen overnacht op een warmteplaat bij 40 °C. Gebruik een scheermesje om de biorobot-bases uit elk van de polymeren te snijden, met afmetingen die overeenkomen met de respectievelijke grootte van elke biorobot, zoals hier getoond. Plaats de nikkel-PDMS-base op een metalen plaat met daartussen een cleanroom-doekje.

Zet vervolgens de corona-ontlader aan en houd de punt van de ontlader 1 centimeter boven de bases. Beweeg de punt 15 seconden lang rond de base om het oppervlak te behandelen. Herhaal dit proces gedurende dezelfde tijd om het oppervlak van de lasergegraveerde bases te behandelen.

Gebruik vervolgens een pincet om de met nikkel PDMS behandelde zijde op de behandelde zijde van de film te plaatsen. Laat het apparaat vijf minuten rusten terwijl de onderdelen aan elkaar hechten. Gebruik daarna een scherp pincet om de cantilever van de biorobot van de wafer af te pellen en deze op de bodem van de nikkel PDMS-basis te plaatsen.

Verwijder vervolgens de gehele assemblage van de wafer. Om de PDMS micro-ballon aan de assemblage te bevestigen, plaatst u eerst een kleine druppel ongeharde PDMS bovenop deze. Gebruik daarna een pincet om de zijde van de nikkel-PDMS met de dunne PDMS-film op de druppel ongeharde PDMS te plaatsen.

Plaats de volledige assemblage in een plastic Petrischaal en zet deze vervolgens op een warmteplaat bij 40 °C om gedurende de nacht te uitharden. Om de apparaten voor te bereiden op het zaaien van cellen, plaatst u eerst 100 µL van een Fibronectine-oplossing in het midden van een aparte T25-kweekfles voor elk apparaat. Plaats vervolgens de biorobot of de biologische actuator met de opening naar beneden over de druppel Fibronectine-oplossing.

Zorg ervoor dat de cantilever is uitgeklapt en ondergedompeld in de druppel, en incubeer de kolf vervolgens 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na de incubatie de Fibronectine-oplossing en was de apparaten twee keer met PBS. Verwijder daarna de PBS en vul de kolf met 10 milliliters DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline.

Incubeer het apparaat gedurende één uur bij 37 °C om het PDMS te ontgassen. Gebruik vervolgens een magneet om de biorobot op de bodem van de kolf vast te houden en plaats de kolf met de monsters gedurende vijf minuten in een ultrasoonbad om eventuele luchtbellen te verwijderen. Om de juiste dikte van elke composietlaag te bepalen, werden verschillende mengverhoudingen van nikkel en microballonnen in PDMS getest.

De nikkel-PDMS-laag maakt magnetische controle en stabiliteit van de robot mogelijk. Daarnaast zorgt de micro-ballon-PDMS-laag ervoor dat de biorobot kan drijven en gestaag kan zwemmen. De combinatie van deze twee lagen vormt het zelfstabiliserende raamwerk van de biorobot.

Met behulp van een computerscript werd de stabiliteit numeriek geanalyseerd en bleek dat deze methode met twee lagen een sterk herstellend moment heeft. Het is belangrijk om te onthouden dat de cantilever gedurende deze procedure schoon moet blijven, en dat de juiste verhouding van het PDMS-mengsel en de dikte van de cantilever gehandhaafd moeten worden. Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe elastomere materialen kunnen worden gevormd tot een dunne cantilever ter ondersteuning van cardiomyocyten en hoe deze kunnen worden aangepast om nieuwe eigenschappen te verkrijgen, zoals drijfvermogen of magnetisme, voor geavanceerde functionaliteiten.

Deze verificatieprocedure kan worden aangepast door andere technieken te integreren, zoals het patroonvormen van uitlijningskubussen, om de celoriëntatie te bevorderen en de vierde generatie te verhogen. Vergeet niet dat werken met lasergraveermachines extreem gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte beschermende kleding en oogbescherming, tijdens het uitvoeren van deze procedure.