Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2

Het algemene doel van deze studie is om microgefabriceerde apparaten te bevolken met hartspiercellen en om de biochemische en biomechanische eigenschappen van de cellen op deze apparaten, evenals hun prestaties over tijd, te karakteriseren. De hier beschreven methode kan eenvoudig worden aangepast voor andere experimenten waarbij een hoge dichtheid van cellen op microgefabriceerde apparaten vereist is. Het belangrijkste voordeel van de bioactuator die in deze video is ontwikkeld, is dat deze gemakkelijk kan worden aangepast om de contractiekrachten van elk ander celtype te kwantificeren.

Het kan ook worden gebruikt om de veranderingen in de biomechanische eigenschappen van stamcellen te bestuderen terwijl ze differentiëren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het zaaien van cellen moeilijk aan te leren zijn aan de hand van tekstuele beschrijvingen. Deze moeten correct worden uitgevoerd om een confluente celhechting op de cantilever-armen te garanderen, wat noodzakelijk is voor een juiste biologische functie.

Neerajha Nagarajan uit mijn laboratorium zal de procedure demonstreren. Begin met de biorobot in de T25-fles. Gebruik een magneet om deze op de bodem van de fles op zijn plaats te houden.

De magneet is niet nodig voor de biologische actuatoren, aangezien deze niet zullen bewegen door het gewicht van de glazen kraal in de basis. Rol een klein vierkant plastic vel op om als trechter te gebruiken en plaats de steriele trechter over de actuatoren in de biorobots. Pas de diameter aan het bredere uiteinde aan zodat deze in het apparaat past, en stel de hoogte zo in dat deze nauw aansluit wanneer de bovenkant van de kolf wordt vastgedraaid.

Gebruik een aparte kolf om de pasvorm van de trechter te testen en aan te passen. Een nauwe aansluiting van de trechter voorkomt dat cellen, zoals eerder vermeld, in de rest van het medium lekken. Dit is essentieel om een convergente bedekking van de cantilever-arm te verkrijgen.

Resuspendeer de cardiomyocyten met de trechter op hun plaats in compleet DMEM bij een dichtheid van 16 miljoen cellen per milliliter en laat langzaam 400 µL van de suspensie via elke trechter op de apparaten druppelen. Plaats de flessen vervolgens langzaam terug in de incubator zonder de apparaten of de trechters daarin te verstoren. Laat de cellen 24 uur lang hechten bij 37 °C.

Verwijder na de incubatieperiode langzaam de trechter. Was de monsters voorzichtig met PBS en vul elke kolf opnieuw bij met 10 milliliters vers compleet DMEM. Verwijder vervolgens de magneet uit de biorobot zodat ze drijven en plaats de kolven terug in de incubator.

Plaats een camera die is uitgerust met een zoomlens in de incubator om de apparaten in cultuur te visualiseren. Voeg vervolgens een LED-lichtstrip toe om als lichtbron te gebruiken. Verbind daarna de camera met een computer en open het beeldverwerkingsprogramma.

Zodra u in het programma bent, klikt u op de camera-afbeelding in het tabblad Bestand om alle camera-opties te openen en selecteert u de aangesloten camera. Kies uit de lijst met tabbladen Live en breng het beeld handmatig in focus door de lensring aan te passen. Selecteer vervolgens in het bovenste paneel de uitsnede van het gebied van interesse.

Teken vervolgens handmatig een rechthoek in het videokader rond de biologische actuator en de cantilever-armen om het interessegebied te markeren. In het geval van biorobots wordt het hele scherm vastgelegd om de zwembeweging van het apparaat op te nemen. Selecteer daarna Camera Settings en stel de framerate in door de belichting en de pixelverhouding van het live-beeld aan te passen.

Stel de beeldvoorkeur in op ongeveer 30 frames per seconde. Klik ten slotte op de opnameknop om de video's te beginnen opnemen. Open de programmeersoftware door op het icoon te klikken.

Zodra het is geladen, klikt u op File, Open, en selecteert u het m-scriptbestand voor het uitvoeren van de beeldanalyse. Zorg ervoor dat de opgenomen TIF-afbeeldingen en hun AVI-versies zich in dezelfde map als het m-bestand bevinden en klik vervolgens op Run om het script uit te voeren. Druk op Play om het eigenlijke programma te starten.

Zodra het programma is gestart, klikt u op de knop Open en zoekt u het TIF- of AVI-bestand dat geanalyseerd moet worden. Klik vervolgens op de knop base. Selecteer het punt waar de cantilever aan de bovenkant aan de basis is bevestigd en druk op Enter.

Hiermee wordt voor elk frame een vierkante markering op de afbeelding geplaatst om de locatie van de basis van de cantilever aan te geven. Klik vervolgens op de schaalknop en klik daarna handmatig op een rand van de glazen kraal. Beweeg de muisaanwijzer naar de tegenovergestelde zijde van de glazen kraal en druk op Enter.

Hiermee wordt een lijn getrokken die de diameter van de glazen kraal meet en de diameter relateert aan de weergegeven pixels. Klik op de knop Analyse. Klik vervolgens langs de cantilever op een korte afstand van de eerste vierkante markering die de basis van de cantilever voorstelt.

Klik doorlopend langs de cantilever, inclusief de punt, en druk op Enter wanneer u klaar bent. Hierdoor wordt op elk aangeklikte punt op de cantilever een X geplaatst. Controleer ten slotte of de overgelegde cirkel het profiel van de cantilever correct volgt.

Klik bij een correct resultaat op de knop voor het volgende frame. Hiermee wordt gewisseld naar het volgende frame in het TIF-bestand. Herhaal dit proces voor alle frames.

Zodra alle frames zijn verwerkt, klikt u op de knop Export. Begin met het openen van de software voor beeldanalyse en het laden van het videobestand van de zwemmende biorobot. Open vervolgens de software voor spreadsheetbeheer.

Zoek in de video van de geladen biorobot naar een grootte-referentie, zoals de glazen kraal. Gebruik de tool 'Straight' om een lijn over de glazen kraal te trekken. Klik vervolgens op 'Analyze' en selecteer 'Set Scale'.

Stel het veld Known distance in op 3 000 micrometers en klik op OK. Kies een punt op een apparaat dat niet wiebelt tussen de frames om als markering te dienen en noteer de X- en Y-coördinaten van dit punt in de spreadsheet. Keer terug naar het venster van de software voor beeldanalyse en druk op de rechterpijltoets om naar het volgende frame te gaan. Wijs opnieuw naar de markering en noteer de nieuwe X- en Y-coördinaten in de spreadsheet.

Herhaal dit proces voor alle frames en gebruik de gegevens om de beweging van de biorobot te analyseren zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De statische en dynamische spanningen van de actuator werden dagelijks uit de oppervlaktespanning geëxtraheerd. Statische spanning is de contractiespanning die de cellen op het oppervlak vertonen in rusttoestand en dynamische spanning is de spanning die door de cellen wordt gegenereerd bij maximale contractie.

Naarmate de cellen in cultuur rijpden, werd na verloop van tijd een geleidelijke toename van statische en dynamische spanningen waargenomen. Ze vertoonden op dag zes een maximale cel tractiekracht van 50 millinewtons per meter en een maximale contractiekracht van ongeveer 165 millinewtons per meter. Parallel aan de statische en dynamische spanningen namen ook markers voor cardiomyocyt-rijping, groei en spreiding, en celinterconnectiviteit toe tot dag zes.

Op basis van de videoanalyse wordt hier de vergelijking getoond van de gemiddelde zwemsnelheid, slagfrequentie en afgelegde afstand per slag voor drie biorobots met verschillende zwemprofielen. Hoewel de verticale biorobots de laagste slagfrequentie hebben, vertoonden zij de hoogste zwemsnelheid en afgelegde afstand. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe hartspiercellen gezaaid kunnen worden op microgefabriceerde apparaten die kunnen functioneren als biologische actuatoren en biorobots.

Het proces van beeldverwerving en de daaropvolgende data-analyse die in deze video worden beschreven, demonstreert een handige manier om zowel het celgedrag als de prestaties van het apparaat te karakteriseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de levensduur van de cardiomyocyten beperkt is en dat de activiteit van de cellen op de zesde dag piekt. Daarna neemt deze activiteit in de loop van de tijd af.