Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2

Het algemene doel van dit onderzoek is om microfabricage-apparaten te bevolken met hartspiercellen en om de biochemische en biomechanische eigenschappen van de cellen op deze apparaten te karakteriseren, evenals hun prestaties in de loop van de tijd. De hier beschreven materie kan gemakkelijk worden aangepast voor andere experimenten die hoge dichtheid celtoevoeging op microfabricage-apparaten vereisen. Het belangrijkste voordeel van de bio-actuator die in deze video wordt ontwikkeld, is dat deze gemakkelijk kan worden aangepast om celcontractiekrachten van elk ander celtype te kwantificeren.

Het kan ook worden gebruikt om de veranderingen in de biomechanische kenmerken van stamcellen te bestuderen terwijl ze differentiatie ondergaan. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de celzaaisetaps moeilijk te leren zijn met beschrijvingen uit teksten. Ze moeten correct worden uitgevoerd om confluente celhechting op de cantileverarmen te garanderen, wat essentieel is voor een goede biologische functie.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Neerajha Nagarajan van mijn laboratorium. Begin met de biorobot in de T25-kolf. Gebruik een magneet om deze op zijn plaats te houden op de bodem van de kolf.

De magneet is niet nodig voor de biologische actuatoren, aangezien ze niet zullen bewegen vanwege het gewicht van de glazen kraal in de basis. Rol een klein vierkant plastic blad om als trechter te gebruiken en plaats de steriele trechter over de actuatoren in de biorobots. Pas de diameter aan de bredere kant aan om deze op het apparaat te laten passen en de hoogte zodat deze goed past wanneer de bovenkant van de kolf wordt vastgedraaid.

Gebruik een aparte kolf om de pasvorm van de trechter te testen en aan te passen. Goede pasvorm van de trechter zorgt ervoor dat er geen lekkage van de cellen plaatsvindt zoals vermeld in de rest van de media. Dit is essentieel voor het bieden van confluente dekking van de cantileverarm.

Met de trechter op zijn plaats, resuspendeer cardiomyocyten in compleet DMEM bij een dichtheid van 16 miljoen cellen per milliliter en laat langzaam 400 microliters van de suspensie druppelen op de apparaten door elke trechter. Beweeg vervolgens langzaam de kolven terug in de incubator zonder de apparaten of de trechters binnenin te verstoren. Laat de cellen 24 uur hechten bij 37 graden Celsius.

Na de incubatieperiode, verwijder langzaam de trechter. Was de monsters voorzichtig met PBS en vul elke kolf bij met 10 milliliter vers compleet DMEM. Verwijder vervolgens de magneet van de biorobot zodat ze blijven drijven en plaats de kolven terug in de incubator.

Monteer een camera uitgerust met een zoomlens in de incubator om de apparaten in cultuur te visualiseren. Voeg vervolgens een LED-lichtstrip toe om als lichtbron te dienen. Verbind vervolgens de camera met een computer en open het beeldvormingsprogramma.

Eenmaal in het programma, klik op het camerabeeld in het tabblad Bestand om alle camera-opties te openen en kies de aangesloten camera. Kies uit de lijst met tabbladen Live en breng het beeld handmatig scherp door de lensknop aan te passen. Selecteer vervolgens het bijsnijden van het gedeelte van belang vanaf het bovenste paneel.

Teken vervolgens handmatig een rechthoek in het videoframe om het biologische actuatorapparaat en de cantileverarmen om te omlijnen en markeer het gebied van belang. In het geval van biorobots, leg het hele scherm vast om de zwembeweging van het apparaat te registreren. Selecteer vervolgens Camera-instellingen en stel de framesnelheid in door de belichting en pixelverhouding van het live-beeld aan te passen.

Stel de framesnelheid in op ongeveer 30 frames per seconde. Klik ten slotte op de opnameknop om de video's te starten. Open de programmeersoftware door op het pictogram te klikken.

Eenmaal geladen, klik op Bestand, Openen en selecteer het m scriptbestand voor het uitvoeren van beeldafbeeldanalyse. Zorg ervoor dat de opgenomen TIF-afbeeldingen en hun AVI-versies zich in dezelfde map bevinden als het m-bestand en klik vervolgens op Uitvoeren om het script uit te voeren. Druk op Afspelen om het werkelijke programma te starten.

Eenmaal draaiend, klik op de Open-knop en zoek het TIF- of AVI-bestand dat wordt geanalyseerd. Klik vervolgens op de basisknop. Selecteer het punt waar de cantilever aan de basis bovenaan is bevestigd en druk op Enter.

Dit zal een vierkant markeringsteken op het beeld plaatsen voor elke frame om de locatie van de cantileverbasis aan te geven. Klik vervolgens op de schaalknop en klik vervolgens handmatig op een rand van de glazen kraal. Breng de muispointer naar de tegenoverliggende kant van de glazen kraal en druk op Enter.

Dit zal een lijn trekken die de diameter van de glazen kraal meet en zal de diameter relateren aan de pixels die worden weergegeven. Klik op de analyseknop. Klik vervolgens langs de cantilever op een korte afstand van het eerste vierkante markeringsteken dat de cantileverbasis vertegenwoordigt.

Ga door met klikken langs de cantilever inclusief de punt en druk op Enter wanneer u klaar bent. Dit zal een X plaatsen op elk punt dat op de cantilever wordt geklikt. Controleer ten slotte of de gesuperponeerde cirkel het cantileverprofiel correct volgt.

Indien correct, klik op de volgende frameknop. Dit zal schakelen naar het volgende frame in het TIF-bestand. Herhaal dit proces voor alle frames.

Zodra alle frames zijn verwerkt, klik op de Export-knop. Begin met het openen van de beeldanalysesoftware en het laden van het zwemmende biorobotvideobestand. Open vervolgens de spreadsheetsoftware.

In de geladen biorobotvideo, lokaliseer een groottereferentie zoals de glazen kraal. Gebruik de rechte lijntool om een lijn te tekenen over de glazen kraal. Klik vervolgens op Analyseren en selecteer Schaal instellen.

Stel het bekende afstandsveld in op 3.000 micrometer en klik op OK. Kies een punt op een apparaat dat niet wiebelt tussen frames om als marker te dienen en noteer de X- en Y-coördinaten van dit punt in de spreadsheet. Schakel terug naar het venster van de beeldanalysesoftware en druk op de rechterpijltoets om naar het volgende frame te gaan. Wijs opnieuw naar de marker en noteer de nieuwe X- en Y-coördinaten in de spreadsheet.

Herhaal dit proces voor alle frames en gebruik de gegevens om de beweging van de biorobot te analyseren zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De statische en