Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in
25 mei 2017
Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de vasculatuur van Xenopus tropicalis kikkervisjes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de cardiovasculaire biologie, zoals de regulatie van angiogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat bloedvaten in een intact embryo kunnen worden gevisualiseerd door middel van een eenvoudige injectie met een fluorescente kleurstof.
Begin met het vullen van een taps toelopende glazen micropipet met ongeveer 5 µL heldere diI-geacetyleerde LDL-oplossing met behulp van een microlader, waarbij nauwkeurig wordt gelet op het voorkomen van neerslagdeeltjes. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een fijn pincet (nummer 55) om de punt van de pipet af te knippen om het volume van het geladen complex aan te passen en stel het drukgestuurde injectiesysteem zo in dat er ongeveer 5 nL oplossing per injectie wordt uitgestoten. Dompel vervolgens de pipetpunt onder in 0,04% MS-222 in 0,1X gemodificeerde Barth's zoutoplossing of MBS in een op maat gemaakte Sylgard-mal.
Transfer vervolgens het Xenopus tropicalis embryo naar de Sylgard-mal en bevestig de volledige sedatie door het ontbreken van een reactie op stimulatie van de rugvin. Plaats het embryo onder de dissectiemicroscoop met de ventrale zijde naar boven in de V-vormige inkeping van de mal in een licht schuine positie. Bevestig twee minutian-pinnen van 0,1 millimeter stevig in een pinnhouder en gebruik één pin om de huid boven het hart, dat zichtbaar moet kloppen, door te prikken.
Steek de pin door het gat in de ruimte tussen het hart en de huid zonder het hart te doorboren en positioneer de ingebrachte punt in het gebied waar de incisie zal worden gemaakt. Wrijf vervolgens de tweede pin tegen de ingebrachte pin om een lineaire incisie te maken en gebruik beide pinnen samen om de incisie voorzichtig te verbreden, zodat het hart bloot komt te liggen. Om de DiI geacetyleerde LDL-oplossing te injecteren, steekt u de glazen pipetpunt in het hart en injecteert u 50 tot 60 nanoliters van de DiI geacetyleerde LDL in ongeveer 10 uitstotingspulsen.
Wanneer de volledige kleuroplossing is toegediend, bevestig dan dat het hart nog klopt en breng het embryo over naar een nieuwe Petrischaal met 0,1X MBS. Na vijf tot 10 minuten zou de kikkervisje moeten herstellen van de anesthesie en beginnen te bewegen. Nadat een passend aantal embryo's is geïnjecteerd, worden de correct gelabelde geanestheseerde embryo's visueel gescreend onder een fluorescentiemicroscoop, waarbij alle dieren worden weggegooid bij welke andere organen gelabeld zijn.
Embryo's die onvoldoende zijn gelabeld, kunnen opnieuw worden geïnjecteerd. Leg vervolgens beelden vast van de correct gelabelde embryo's. Voor een grondigere beeldvorming van de bloedvaten worden opnieuw geneerstheticiseerde embryo's gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor visualisatie via confocale microscopie.
Wanneer een voldoende hoeveelheid diI geacetyleerd LDL in het hart wordt geïnjecteerd, zou de posterieure kardinale vene, of PCV, onmiddellijk zichtbaar moeten zijn onder een fluorescentiemicroscoop. De intersomitische venen, of ISV's, ontspringen dorsaal uit de PCV in een anterieur-posterieure golf die begint bij stadium 36 en eindigt rond stadium 40 tot 41, waarna ze rond stadium 43 licht vertakt raken. De PCV en ISV's groeien in een stereotiep angiogeen patroon dat onder strikte ontwikkelingscontrole staat.
Interessant genoeg vermindert het uitschakelen van TIE-2-signalering door antisense morpholino's de lengte en de complexiteit van de ISV's, terwijl expressie van de constitutief actieve vorm van TIE-2 overmatige vertakking van de ISV's induceert. Een Vein Complexity Index kan worden berekend om de complexiteit van de ISV's te beoordelen, en er kunnen gerenderde paden worden gegenereerd om de algehele architectuur van de embryonale Xenopus tropicalis vasculatuur te visualiseren. Het oorspronkelijke protocol werd beschreven voor het gebruik van Xenopus laevis door Levin en Colics, en wij hebben dit aangepast voor Xenopus tropicalis.
Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Voorafgaand aan deze procedure kunnen genetische en farmacologische manipulaties worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen en signaleringspaden de vasculaire ontwikkeling reguleren. Met behulp van deze procedure kan het gelabelde vaatstelsel in real-time worden afgebeeld in een intact dier, wat een krachtig instrument biedt voor het onderzoek naar de dynamiek van de vasculaire ontwikkeling.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u diI geacetyleerd LDL in het hart van een Xenopus tropicalis kikkervisje injecteert om de vasculatuur te visualiseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een fluorescentiegebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis. De techniek maakt beeldvorming van bloedvaten mogelijk kort na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo, wat studies naar de cardiovasculaire ontwikkeling in vivo faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cardiovasculaire biologie
- Angiogenese
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Xenopus tropicalis is een modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelden.
- Inzicht in de vasculaire ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen van diverse ziekten.
- Fluorescentie-beeldvormingstechnieken verbeteren de visualisatie van biologische structuren.
- Deze methode maakt real-time observatie van vasculaire veranderingen mogelijk.
Doel van de studie
- Om de vasculatuur van Xenopus tropicalis kikkervisjes te visualiseren.
- Om de regulatie van angiogenese te onderzoeken.
- Om een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het bestuderen van de cardiovasculaire ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo.
- Gebruik van een micro-loader en een taps toelopende glazen micropipet voor nauwkeurige toediening van de kleurstof.
- Visualisatie van bloedvaten onder een dissectiemicroscoop.
- Toepassing van genetische en farmacologische manipulaties om effecten op de vasculatuur te bestuderen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van bloedvaten in intacte embryo's.
- Kwantificering van de vasculaire complexiteit gerealiseerd via beeldvorming.
- Verworven inzichten in de dynamiek van de cardiovasculaire ontwikkeling.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode voor injectie van fluorescerende kleurstof.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling.
- Fluorescente beeldvorming is een krachtig instrument voor real-time analyse.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar cardiovasculaire biologie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze methode maakt directe visualisatie en kwantificering van vasculaire complexiteit in een gewervde modelorganisme mogelijk, wat vroege targetvalidatie in angiogenese-routes ondersteunt. Door kwantitatieve resultaten van vaatuitloping en vertakking te bieden, faciliteert het de mechanistische risicoreductie van vasculaire targets voordat er wordt overgegaan tot lead-identificatiecampagnes. Het Xenopus tropicalis-systeem biedt een ziekte-relevant platform voor het beoordelen van angiogene fenotypes met voorspellende betrouwbaarheid in preklinisch cardiovasculair onderzoek.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over angiogene regulatoren, zoals TIE-2-signalering, mogelijk door directe observatie van vaatuitlopingspatronen.
- Operationele waarde: Biedt een snelle workflow van één week om de impact van genen of signaalpaden op de vasculaire ontwikkeling te beoordelen zonder dat genetisch gemanipuleerde modellen vereist zijn.
- Voorspellende waarde: Kwantificeerbare resultaten, zoals de Vein Complexity Index, ondersteunen een objectieve beoordeling van de effecten van targetmodulatie voor beslissingen over portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare vasculaire labeling die compatibel is met downstream imaging- en analysepipelines.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de lengte van de intersomitische aderen en de vertakkingscomplexiteit mogelijk als dosisresponsieve read-outs voor compound screening.
- Schaalbaarheid: Een eenvoudige procedure voor kleurstofinjectie en imaging ondersteunt medium-throughput evaluatie van farmacologische of genetische perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert stereotype angiogenese in Xenopus tropicalis, wat inzicht biedt in menselijke vasculaire ontwikkelingspaden.
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie via geconserveerde angiogene mechanismen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt snelle tests van padmodulatoren mogelijk om de doelbiologie te verduidelijken voordat er wordt geïnvesteerd in studies met zoogdiermodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetesten voor targets tot leadidentificatie en levert vasculaire fenotypegegevens die de go/no-go-beslissingen in programma's gericht op angiogenese onderbouwen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door genetische of farmacologische verstoringen te koppelen aan kwantificeerbare veranderingen in de vasculaire architectuur.
- Screening: Levert reproduceerbare, op beeldvorming gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van verbindingen op angiogene uitlopers.
- Analytica: Biedt kwantitatieve metrieken voor vasculaire complexiteit die objectieve vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van geconserveerde angiogenesemechanismen om continuïteit te waarborgen van embryonale modellen naar vasculaire systemen van zoogdieren.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor vasculaire fenotypering dat toepasbaar is op meerdere projecten gericht op angiogenese.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van angiogene targets door middel van directe, kwantitatieve visualisatie van vasculaire netwerken.
- Operationele waarde: Standardiseert de vasculaire beoordeling via eenvoudige kleurstofinjectie en reproduceerbare beeldvorming, waardoor de variabiliteit tussen experimenten wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van vasculaire targets mogelijk te maken, wat het risico op falen in een laat stadium van cardiovasculaire programma's verkleint.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van angiogenesis-modifiers op basis van kwantitatieve fenotypische resultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken voor de hantering van embryo's en cardiale micro-injectie.
- Afhankelijk van de infrastructuur voor fluorescentiemicroscopie voor de visualisatie van vaten en beeldvastlegging.
- Vereist standaardisatie van de embryonale stadia en het tijdstip van injectie voor een consistente vasculaire labeling.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het uitbreiden van de bevindingen naar andere modelsystemen of contexten van menselijke relevantie.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de toegankelijkheid van embryo's en de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de kleurstofconcentratie om aspecifieke labeling te voorkomen.
