Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in Xenopus tropicalis
May 25th, 2017
Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om de vaatstructuur van Xenopus tropicalis kikkervisjes te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cardiovasculaire biologie, zoals hoe angiogenese wordt gereguleerd. Het grote voordeel van deze techniek is dat bloedvaten in een intact embryo van het juiste type kunnen worden gevisualiseerd door een eenvoudige injectie van een fluorescerende kleurstof.
Begin door een micro loader te gebruiken om een taps toelopende glasmicropipet te vullen met ongeveer vijf microliter heldere diI geacetyleerde LDL-oplossing, zorg ervoor dat er geen geprecipiteerde deeltjes worden geladen. Gebruik onder een dissectiescoop een fijn nummer 55 tang om de punt van de pipet af te knippen om het volume van het geladen complex aan te passen en stel het onder druk gecontroleerde injectiesysteem in om ongeveer vijf nanoliter oplossing per injectie uit te stoten. Dompel vervolgens de punt van de pipet in 0,04% MS-222 in 0,1X gemodificeerd Barth's-zoutoplossing of MBS in een op maat gemaakte Sylgard-vorm.
Breng vervolgens het Xenopus tropicalis-embryo over naar de Sylgard-vorm en bevestig volledige sedatie met een gebrek aan reactie op stimulatie van de rugvin. Laad onder de dissectiescoop het embryo met de buikzijde naar boven in de V-vormige inkeping van de mal in een licht schuine positie. Plaats twee 0,1 millimeter minutian-spelden strak in een speldenhouder en gebruik een speld om de huid boven het hart te doorboren, dat zichtbaar moet pulseren.
Breng de speld door het gat in de ruimte tussen het hart en de huid zonder het hart te doorboren en plaats de ingebrachte punt binnen het gebied waar de incisie zal worden gemaakt. Wrijf vervolgens de tweede speld tegen de ingebrachte speld om een lijnvormige incisie te maken en gebruik beide spelden om de incisie voorzichtig te verbreden, waarbij het hart wordt blootgesteld. Om de DiI geacetyleerde LDL-oplossing te injecteren, steekt u de glaspipetpunt in het hart en injecteert u 50 tot 60 nanoliter van de DiI geacetyleerde LDL in ongeveer 10 uitwerppulsen.
Wanneer alle kleurstofoplossing is afgegeven, bevestigt u dat het hart nog steeds klopt en brengt u het embryo over in een nieuwe petrischaal met 0,1X MBS. Na vijf tot tien minuten zou de kikkervis zich moeten herstellen van de anesthesie en beginnen te bewegen. Nadat een geschikt aantal embryo's is geïnjecteerd, screent u de correct gelabelde geanesthetiseerde embryo's visueel onder een fluorescentiemicroscoop en gooit u alle dieren weg die andere organen hebben gelabeld.
Embryo's die onvoldoende zijn gelabeld, kunnen opnieuw worden geïnjecteerd. Vang vervolgens afbeeldingen van de correct gelabelde embryo's. Voor een grondiger beeldvorming van de bloedvaten, fixeert u de opnieuw geanesthetiseerde embryo's in 4% paraformaldehyde gedurende een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht voor visualisatie door confocale microscopie.
Als er voldoende diI geacetyleerde LDL in het hart wordt geïnjecteerd, zou de achterste cardinale ader, of PCV, onmiddellijk zichtbaar moeten zijn onder een fluorescentiemicroscoop. De intersomitische aders, of ISV's, komen dorsaal uit de PCV in een golf van voor naar achter beginnend in stadium 36 en eindigend rond stadium 40 tot 41 en worden licht vertakt rond stadium 43. De PCV en ISV's groeien in een stereotiepe angiogene patroon dat onder strikte ontwikkelingscontrole staat.
Interessant is dat de knockdown van TIE-2-signalering door antisense morphalinos de lengte en de complexiteit van de ISV's vermindert, terwijl expressie van de constitutief actieve vorm van TIE-2 overmatige ISV-vertakking induceert. Een Vein Complexiteit Index kan worden berekend om de complexiteit van de ISV's te beoordelen en weergegeven paden kunnen worden gegenereerd om de algehele architectuur van de embryonale Xenopus tropicalis-vaatstructuur te visualiseren. Het oorspronkelijke protocol werd beschreven voor gebruik van Xenopus laevis door Levin en Colics en we hebben het aangepast voor Xenopus tropicalis.
Eenmaal beheerst kan deze techniek in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Voor deze procedure kunnen genetische en farmacologische manipulaties worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen en signaalroutes de vasculaire ontwikkeling reguleren. Met behulp van deze procedure kan de gelabelde vaatstructuur in een intact dier in realtime worden geïmageeerd, wat een krachtig hulpmiddel biedt voor het onderzoeken van de dynamica van vasculaire ontwikkeling.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe diI geacetyleerde LDL in het hart van een Xenopus tropicalis-kikkervisje moet worden geïnjecteerd om de vaatstructuur te visualiseren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont een op fluorescentie gebaseerde methode om het vaatstelsel te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis. De techniek maakt beeldvorming van bloedvaten mogelijk kort na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo, wat studies naar cardiovasculaire ontwikkeling in vivo vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire biologie
- Angiogenesis
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Xenopus tropicalis is een modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelde dieren.
- Het begrijpen van vaatontwikkeling is cruciaal voor inzichten in verschillende ziekten.
- Fluorescente beeldvormingstechnieken verbeteren de visualisatie van biologische structuren.
- Deze methode maakt real-time observatie van vaatveranderingen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om het vaatstelsel van Xenopus tropicalis-kikkervisjes te visualiseren.
- Om de regulatie van angiogenesis te onderzoeken.
- Om een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Injectie van een fluorescerende kleurstof in het hart van het embryo.
- Gebruik van een micro loader en taps toelopende glazen micro pipette voor nauwkeurige kleurstoflevering.
- Visualisatie van bloedvaten onder een disserpeermicroscoop.
- Toepassing van genetische en farmacologische manipulaties om effecten op het vaatstelsel te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van bloedvaten in intacte embryo's.
- Kwantificering van vasculaire complexiteit bereikt door beeldvorming.
- Inzichten verkregen in de dynamica van cardiovasculaire ontwikkeling.
- Aangetoonde effectiviteit van de fluorescerende kleurstofinjectiemethode.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van vaatontwikkeling.
- Fluorescente beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time analyse.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar cardiovasculaire biologie vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
