Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Het algemene doel van deze biochemische procedure is om intermediate filament verrijkte fracties te isoleren uit meerdere muisweefsels om post-translationele modificaties van de verschillende weefselspecifieke intermediaire filamenteiwitten te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van intermediaire filamenten te beantwoorden, zoals hoe de functie en regulatie van deze belangrijke stressbeschermende cytoskeletal eiwitten wordt beïnvloed tijdens het verouderingsproces van zoogdieren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het opnemen van een geautomatiseerde weefsel lysestap gebruikers in staat stelt om meerdere weefselmonsters snel en efficiënt te verwerken.

Om te beginnen, voegt u één milliliter ijskoud Triton X-100 buffer, aangevuld met proteaseremmers, toe aan een glazen buishomogenisator en plaats deze op ijs. Verwijder een klein stukje weefsel uit de vloeibare stikstofopslag en plaats het direct in de glazen homogenisator. Gebruik vervolgens, terwijl de homogenisator en het monster altijd op ijs worden gehouden, ongeveer 50 slagen met een polytetrafluorethyleen pastille om het monster te homogeniseren en tegelijkertijd de vorming van bellen te minimaliseren.

Breng het lysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis op ijs en centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 20.000 keer G in vier graden Celsius. Verzamel vervolgens de Triton X-oplosbare supernatantfractie in een aparte buis. Deze fractie kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie en analyse van de detergent-oplosbare pool van IF-eiwitten.

Voeg vervolgens aan het weefselpellet één milliliter hoog-zoutbuffer toe, aangevuld met proteaseremmers. Breng het over naar een schone homogenisator en dounce 100 slagen. Breng het homogenaat terug naar de microcentrifugebuis en plaats de buis op een roterende shaker in de koude kamer gedurende één uur.

Centrifugeer de homogenaten gedurende 20 minuten bij 20.000 keer G in vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg één milliliter ijskoud PBS EDTA-buffer toe aan het pellet en breng het over naar een schone homogenisator als laatste reinigingsstap. Na homogenisatie, breng het monster over naar een nieuwe buis en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 20.000 keer G in vier graden Celsius om het IF-eiwitrijke hoog-zout extract, of HSC, te verkrijgen.

Gooi het supernatant weg en los het pellet op in 300 microliters voorverwarmde niet-reducerende SDS-monsterbuffer. Breken het pellet aanvankelijk op door te pipetteren en te vortexen. Verhit de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius.

Vortex en pipetteer indien nodig om ervoor te zorgen dat het pellet volledig is opgelost, wat enkele minuten kan duren. Bewaar alle monsters op min 20 graden Celsius tot analyse. Om RNA-extractie uit te voeren, voeg lysisbuffer toe in een buis met lysine matrix D, voeg vervolgens het monsterweefsel toe aan de weefsel lyser en pulseer twee keer gedurende 25 seconden elk.

Scheid het lysaat van de matrix door centrifugatie bij 20.000 keer G.Voor eiwitextractie, voeg Triton X-100 of SDS-monsterbuffer toe als u een totaal lysaat bereidt. In een lysinebuis met lysine matrix SS.Voeg vervolgens het monsterweefsel toe. Pulseer het monster kort om te mengen.

Om HSC te bereiden, gebruik een magneet om de roestvrijstalen bol uit de buis te verwijderen en centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 20.000 keer G in vier graden Celsius. Scheid de supernatant en pelletfracties en ga verder zoals eerder in de video is gedemonstreerd. Bereid PBST-buffer voor door 10 microliters T20 toe te voegen aan 50 milliliter PBS pH 7,4.

Bereid vervolgens de PTM-antilichaamoplossing voor door één tot 10 microgram antilichaam toe te voegen aan 200 microliters PBST. Verdeel 50 microliters magnetische kralen in een microcentrifugebuis. Plaats het op de magneet en zuig de kralenopslagoplossing af.

Conjugeer de kralen met het immunoprecipitatie-antilichaam door de kralen op te schorsen in de antilichaamoplossing en het monster gedurende 20 minuten op een rotator bij kamertemperatuur te incuberen. Plaats de buizen op de magneet en zuig de antilichaamoplossing af. Gebruik vervolgens 200 microliters PBST om de antilichaam-geconjugeerde kralen één keer te spoelen en verwijder de oplossing.

Voeg 0,6 tot één milliliter van het weefsellysaat toe aan de kralen. Meng door voorzichtig te pipetteren en incubeer de oplossing gedurende drie uur op een rotator in een koude kamer. Plaats de buizen op de magneet en verwijder het lysaat, gebruik vervolgens 200 microliters PBST om de kralen vijf keer te wassen.

Na de laatste wasstap, verzamel de kralen en 100 microliters PBS en breng de kralen over naar een nieuwe, schone buis. Plaats de buis op de magneet en zuig het PBS op. Verwijder de buis van de magneet en voeg 100 microliters niet-reducerende monstersoplossing toe.

Doel 50 microliters van de buis en combineer het met 5% 2ME om reducerende monsters te maken. Verhit de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius. Met de buis op de magneet, verzamel de IP-fractie van de kralen en breng deze over naar een verse buis.

Bewaar de monsters op min 20 graden Celsius tot analyse. Om besmetting van eiwitmonsters voor massaspectrometrie-analyse te voorkomen, gebruik schone handschoenen om alle gels te hanteren en incubeer ze in schone containers die alleen zijn gewassen met DD H2O. Laat 20 tot 50 microliters van het HSE-monster lopen op een SDS-paginagel volgens standaardvoorwaarden.

Nadat het gel is gekleurd volgens het tekstprotocol, plaats het gel tussen plastic bladbeschermers. Scan en markeer vervolgens de banden die zullen worden uitgesneden. Gebruik een nieuwe, schone scheermes om de IF-eiwitbanden uit te snijden en plaats de banden in schone microcentrifugebuisjes op ijs voordat ze worden ingediend voor massaspectrometrie-analyse.

Deze figuur toont een typisch resultaat van HSE's uit negen muisweefsels geïsoleerd met behulp van de snelle methode