Name: Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer een biochemische methode om intermediaire filamenten te isoleren uit meerdere muisweefsels voor analyse van post-translationele modificaties tijdens veroudering. Deze geautomatiseerde techniek ondersteunt hoogdoorvoerstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] en P30 DK034987 [naar UNC-Chapel Hill]. De auteurs bedanken Deekshita Ramanarayanan voor hulp bij qPCR en western blot experimenten.

Het protocol is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de Universiteit van Noord-Carolina. 1. Voorbereidingen <ol><li> Bereid Triton-X buffer (1% Triton X-100, 5 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) op, haal volume op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Om 500 ml te maken: roer 5 ml elk van Triton X-100 en 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4. Bewaar Triton-X buffer oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid een hoge zoutbuffer op (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, haal volume in dubbel gedestilleerd (dd) H20) op. Om 500 ml te maken: roer 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA en 2,5 ml Triton X-100, stel volume aan op 500 ML met dubbel gedistilleerd water). Bewaar de hoge zoutbufferoplossing bij 4 ° C. </li><li> Net voor gebruik, vul een passende hoeveelheid Triton-X en High Salt Buffer ( <em&gt; Bijv. 1 ml voor elk 25 mg weefselmonster) met een protease- of protease- / fosfataseremmerscocktail en weggooien elke ongebruikte buffer die de remmers bevat. </li><li> Bereid 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Om 500 ml te maken: roer 5 ml 0,5 M EDTA in 495 ml 1x PBS, pH 7,4. </li><li> Isolatie van verschillende muisorganen (hersenen, hart, long, lever, pancreas, dikke darm, darm, nier, milt) met behulp van goedgekeurde protocollen die voldoen aan veterinaire richtlijnen en institutionele normen 23 . De weefselinzamelprocedure moet maximaal 5 minuten duren om RNA en eiwitintegriteit van protease-rijke weefsels te behouden ( bijv. Moet de eerste alvleesklier worden verwerkt). </li><li> Knip een klein stukje weefsel (~ 5-20 mg) en plaats in RNA-opslagoplossing voor latere RNA-extractie, cDNA-synthese en kwantitatieve real-time PCR analyse voor IF-expressie. Plaats RNA-opslagoplossingsbuizen met weefsel bij 4 ° C overnacht en volg fabrikant protocol voor verdere sTorage en isolatie stappen. </li><li> Snijd de rest van het weefsel in kleinere fragmenten ( bijv. 0,5 cm) en plaats in cryovial. Snap-freeze en houd flesjes op -80 ° C of vloeibaar stikstof voor langere opslag. </li></ol> 2. Als genexpressieanalyse <ol><li> Extract RNA uit weefsels bewaard in het RNA opslagoplossingsreagens. Gebruik een geschikte / geprefereerde RNA-extractie methode volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Kwantificeer RNA concentratie en gebruik 2 μg RNA om cDNA te genereren met behulp van een geschikte reverse transcriptie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Met behulp van de gegenereerde cDNA en muis IF-gen-specifieke primers zetten qPCR reacties op, waaronder drie technische replicaten van elk monster, evenals blanco controle volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Bepaal IF-genuitdrukking als vouwverandering, waarbij verschillende condities worden vergeleken ( bijv. Jong versus oud weefsel). </li></ol> 3. PReparatie van Total Tissue Lysates voor Immunoblot <ol><li> Homogeniseer 25 mg weefsel in 1 ml 2x niet-reducerende SDS monsterbuffer. Verwijder bromfenol blauwe kleurstof uit de monsterbuffer indien een colorimetrische eiwitassay moet worden uitgevoerd om eiwitconcentratie te kwantificeren. </li><li> Voeg 5% (v / v) 2-mercaptoethanol (2-ME) toe om verminderde monsters te maken. Voeg 200 μL van de niet-reducerende monsters toe, voeg 10 μL 2-ME toe. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie met behulp van detergent- en reductiemiddel-compatibele eiwitanalyse. Als kleurstof al in de monsterbuffer is opgenomen, kan de eiwithoeveelheid geschat worden na het uitvoeren van een gel via een aantal technieken, waaronder Coomassie-gebaseerde vlek 24 . </li><li> Vortex alle monsters en verhit bij 95 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voer westerse blotting uit onder zowel reducerende als niet-reducerende omstandigheden. Blootstelling membraan kort (&lt;1 min) om monomere soorten te onthullen en langer (&gt; 1 min) om complexen met hoge molecuulmassa te onthullen bevattenNg IF eiwitten. Controleer bij aggregatie aggregatie hele gel / membraan (inclusief de bodem van de gelputten). </li><li> Doe een parallelle gel en vlek met een eiwitvlek als een laadbeheersing 24 . Bij ziektebeelden of letselonderzoeken moet totale eiwitvlek worden gebruikt als laadbeheersing, in tegenstelling tot immunoblots voor &#39;huishoudelijke&#39; eiwitten ( bijv. Actine, GAPDH) omdat deze onder verschillende stressomstandigheden veranderen. </li></ol> 4. Bereiding van detergentoplosbare en hoogzoutextracten van weefselspecifieke IF&#39;s <ol><li> Voeg 1 ml ijskoude Triton X-100 buffer in een glazen buishomogenizer toe en plaats het op ijs. </li><li> Verwijder een klein stukje weefsel (~ 25 mg) uit vloeibare stikstofopslag en plaats direct in de glazen homogenisator. Gebruik een polytetrafluorethyleenpestel om homogeniseren (50 slag) en vermijd bellen. Houd de homogenisator en koude koud te allen tijde. </li><li> Breng lysaat over naar een 1,5 ml micrOcentrifuge-buis op ijs en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten in een voorgekoelde centrifuge (4 ° C). </li><li> Verzamel de supernatantfractie in een aparte buis. Dit is de Triton X-oplosbare fractie, die kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie (ip) en analyse van het detergensoplosbare pool van IF-eiwitten. Merk op dat stap 4.1-4.4 herhaald kan worden om een ​​reiniger IF-extract uit breinweefsel te bereiken. </li><li> Voeg 1 ml High Salt Buffer toe aan het weefselpelletje, overbrengen naar een schone homogenisator en doei 100 strepen. Breng het homogenaat terug naar de microcentrifugebuis en plaats de buis gedurende 1 uur op een roterende shaker in de koude ruimte. </li><li> Centrifugeer de homogenaten bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant weg. </li><li> Voeg 1 ml ijskoude PBS / EDTA buffer aan de pellet toe en laat de pellet (20 slag) in een schone homogenisator homogeniseren als een laatste opruimingsstap *. Vervoer naar een nieuwe buis en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C om de IF-eiwit-Rijk hoog zoutextract (HSE). * Optioneel vortex in plaats van homogenisatie in deze stap. </li><li> Verwijder de supernatant en ontbind de pellets in 300 μL niet-reducerende SDS monsterbuffer die vooraf verwarmd is. Breng de pellet aanvankelijk door pipettering en vortexing, en verhit daarna de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C. </li><li> Vortex en pipet als nodig om ervoor te zorgen dat de pellet is opgelost. Het kan enkele minuten duren om de pellets volledig op te lossen. </li><li> Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse. </li></ol> 5. Geautomatiseerde Weefsel Lysis voor IF Proteïne Extractie in Experimenten met grote hoeveelheden <ol><li> Voor RNA-extractie, plaats lysisbuffer (600 μL buffer per 25 mg weefsel) in een buis die lyseringsmatrix D bevat (gebruikt kleine keramische bolle) en puls twee keer gedurende 25 s in de weefsellyser. Afzonderlijk lysaat uit de matrix door centrifugeren bij 20.000 xg en ga door naar de volgende stap in isolatie. </li><li> Voor eiwit extractie, plaats TritOp X-100 (of SDS monsterbuffer bij het bereiden van totaal lysaat) in een lyserbuis met lysende matrix SS (gebruik een enkele roestvrijstalen kralen). Na het testen van meerdere matrices, werd dit geselecteerd omdat het IF-eiwit extracten produceert die in gelijke kwaliteit zijn als de traditionele dotsmethode. Merk op dat de geautomatiseerde methode niet optimaal is voor pancreas en milt, en het standaard homogenisatieprotocol dient voor deze weefsels te worden gebruikt. </li><li> Om verder te gaan met de bereiding van High Salt Extract, verwijder de roestvrijstalen kralen uit de buis met een magneet en centrifugeer de buizen bij 20.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Ga verder met stap 4.4 (boven) van het handmatig protocol. </li><li> Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot analyse. </li></ol> 6. Immuno-verrijking van post-translationeel gemodificeerde IF-eiwitten <ol><li> Bereid PBST buffer (0,02% Tween-20 in PBS) op. Om 50 ml te maken, voeg 10 μL Tween-20 tot 50 ml PBS toe, pH 7,4. </li><li> Bereid PTM antilichaam opOplossing (1-10 μg antilichaam in 200 μl PBST). In het algemeen is 3 μg antilichaam / reactie een goede startconditie die eventueel verder geoptimaliseerd kan worden. </li><li> Voor elke reactie, plaats 50 μL magnetische kralen in een microcentrifugebuis, plaats op de magneet en aspireer de kraalopslagoplossing. </li><li> Conjugate de kralen aan het immunoprecipitatie antilichaam door opnieuw suspensie in de antilichaamoplossing en incubatie op rotator (eind-over-end, om te zorgen voor het mengen van kleine volumes) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Plaats de buizen op de magneet en haal de antilichaamoplossing aan. </li><li> Spoel de antilichaam-geconjugeerde kralen eenmaal in 200 μl PBST en verwijder wasbuffer. </li><li> Voeg 0,6-1 ml van het weefsellysaat toe aan de kralen, meng door zacht pipetten en incubeer gedurende 3 uur op de rotator in een koude kamer. </li><li> Plaats buizen op de magneet, verwijder lysaat, en doe de kralen vijf keer met 200 μL PBST. Na de laatste wasstap verzamelen de kralen in 100 _6; L van PBS (geen Tween-20) en overbrengen naar een schone nieuwe buis. Plaats de buis op de magneet. </li><li> Aspireren PBS en voeg 100 μL niet-reducerende monsterbuffer toe. Verwijder 50 μL en voeg 2-ME (5%) toe aan het reduceren van monsters. Verhit de monsters tot 95 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Scheid de ip fractie van de kralen op de magneet en pak het in een nieuwe buis. </li><li> Bewaar monsters bij -20 ° C tot analyse. </li></ol> 7. Bereiding van IF-eiwitmonsters voor massaspektrometrie-analyse <ol><li> Scheduleer een raadpleging met een proteomics expert voorafgaand aan het starten van een studie, aangezien er significante tijd en kosten betrokken zijn bij massaspectrometrie analyse. </li><li> Neem speciale voorzorgsmaatregelen om besmetting te vermijden. Hanteer alle gels met schone handschoenen en incubeer in schone houders, alleen wassen met ddH 2O (vermijd zeep). </li><li> Run 20-50 μL van het HSE-monster (uit secties 4 en 5) op een SDS-PAGE gel volgens de standaard omstandigheden. </li&gt; <li> Vlek met een eiwitvlek gedurende 1 uur. Spoel meerdere keren af ​​en ontvlam overnacht in ddH 2 O. De IF-eiwitbanden moeten gemakkelijk na het ontkleuren zichtbaar zijn. </li><li> Plaats de gel tussen de plastic beschermers, scan en markeer de bands die worden uitgesneden en verzonden voor analyse. </li><li> Accijns de IF-eiwitbanden met behulp van een nieuwe schone scheermes. </li><li> Plaats de gelbanden in schone microcentrifugebuizen en overbrengen naar een massaspectrometrie faciliteit. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Methoden die biochemische karakterisering van IF-eiwitten mogelijk maken, kunnen nuttig zijn om talloze pathofysiologische verschijnselen in zoogdierstelsels te begrijpen, aangezien IF-eiwitten beide markers en modulatoren zijn van cellulair en weefselspanning 29 . Het principe achter de huidige methode is gebaseerd op de initiële procedures die in de jaren 1970 en 1980 zijn ontwikkeld om IF-eiwitten uit cellen en weefsels te isoleren, te scheiden en te reconstrueren, in het algemeen met lage en ...

<html> IF&#39;s zijn een familie van eiwitten die bij mensen worden gecodeerd door 73 genen en zijn ingedeeld in zes hoofdvormen: typen I-IV zijn cytoplasmatisch ( bijv. Epitheliale en haarkeratinen (K), myocyt desmin, neurofilamenten, glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), en anderen); Type V zijn de kernlamellen; En type VI zijn IF&#39;s in de ooglens 1 . In termen van hun moleculaire organisatie hebben IF-eiwitten drie gemeenschappelijke domeinen: een hoogwaardig geconsolideerd &quot;spiraal&quot; -domein, en bolvormige &quot;hoofd- en&quot; staartdomeinen. Als eiwittetrameren elkaar samenvoegen om korte filamentprecursoren te vormen, die uiteindelijk worden opgenomen in volwassen filamenten die dynamische cytoskeletale en nucleoskeletale structuren vormen die betrokken zijn bij mechanische bescherming 2 , stresswaarneming 3 , 4 , regulatie van transcriptie 5 en groei en andere kritische cellulaire functies&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . Het functionele belang van het IF-systeem wordt gemarkeerd door het bestaan ​​van vele menselijke ziekten veroorzaakt door missense-mutaties in IF-genen, waaronder neuropathieën, myopathieën, huidverstoringsstoornissen, metabolische disfuncties en vroegtijdige verouderende syndromen 8 . Sommige IF-genmutaties veroorzaken niet, maar veronderstellen hun dragers op ziekteprogressie, zoals de eenvoudige epitheliale keratinen bij de leverziekte 9 . Deze laatste is te danken aan de kritische stress-beschermende functies van IF&#39;s in epithelia. IF&#39;s in het algemeen behoren tot de meest voorkomende cellulaire eiwitten onder basale condities, maar worden verder sterk geïnduceerd tijdens verschillende soorten stress 10 . Bijvoorbeeld, recente studies die de eiwitbreedse veranderingen in de nematode C. elegans hebben aangetoond, aangetoond dat meerdere IF&#39;s sterk geherreguleerd en gevoelig zijn voor aggregatieAan tijdens organismeveroudering 11 , 12 . Aangezien het behoud van een juiste IF-structuur essentieel is voor cellulaire resistentie tegen verschillende vormen van stress 10 , kan IF aggregatie ook bijdragen aan de functionele daling tijdens veroudering. Echter, organismen op het niveau van studies die meerdere zoogdier IF-eiwitten onderzoeken over verschillende weefsels die stress ondervinden, ontbreken. IF&#39;s zijn zeer dynamische structuren die zich aanpassen aan mobiele eisen. Keratinen ondergaan bijvoorbeeld een biosynthese-onafhankelijke cyclus tussen oplosbaar (niet-filamente) en onoplosbaar (filamentvormig) eiwitpool 13 . Bij normale fysiologische omstandigheden kan ongeveer 5% het totale K8 / K18-pool worden geëxtraheerd in detergentvrije buffer, in vergelijking met ongeveer 20% die kan worden opgelost in het nonionische wasmiddel Nonidet P-40, dat biochemisch vergelijkbaar is met Triton- X100 14 , </sUp&gt; 15 . Tijdens mitose is er een opmerkelijke toename van de oplosbaarheid van enkel-type epitheel K8 en K1814, die minder zichtbaar is in epidermale keratinen, maar meer duidelijk in vimentine en andere type III IF-eiwitten 15 , 16 . Oplosbaarheidseigenschappen van IF-eiwitten worden strikt gereguleerd door fosforylering, een sleutel post-translationele modificatie (PTM) voor filamentherrangschikking en oplosbaarheid 17 , 18 , 19 , 20 . De meeste IF&#39;s ondergaan uitgebreide regelgeving door een aantal PTM&#39;s op geconserveerde locaties, wat resulteert in functionele veranderingen 17 . Het doel van deze methode is om onderzoekers te introduceren die nieuw zijn op het IF-gebied naar biochemische extractie en analytische methoden voor de studie van IF-eiwitten over meerdere muisweefsels. SpecifiekBondgenoot, concentreren we ons op isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van een extractiemethode met hoge zout en beoordeling van veranderingen in PTM&#39;s via massaspectrometrie en door PTM-targetende antilichamen. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures 21, maar omvatten wijzigingen voor het extraheren van verschillende IF-eiwitsoorten om gemeenschappelijk mechanisme voor regulering over de IF-familie te ontdekken. Bijvoorbeeld reguleert K8-acetylering bij een specifiek lysine-residu filamentorganisatie, terwijl hyperacetylatie K8-onoplosbaarheid en aggregaatvorming 22 bevordert. Recent recente wereldwijde proteomische profileringsstudies hebben bovendien aangetoond dat de meeste weefselspecifieke IF-eiwitten ook doelstellingen voor acetylering zijn en dat de meeste IF-acetyleringsplaatsen beperkt zijn tot het sterk geconserveerde staafdomein. Dit wijst op de noodzaak van methoden die geschikt zijn voor wereldwijde profilering van het IF-systeem. We introduceren ook een snelle methode om IF-eiwitten van meerdere weefsels te isoleren met behulp van geautomatiseerde homogenisatie in optiGematiseerde lysingsmatrix. De resulterende preparaten zijn geschikt voor stroomafwaartse PTM analyse via massaspectrometrie en andere methoden.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>immunoprecipitation beads</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>voor buffers</td></tr><tr><td>Purelink RNA mini kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>RNA extractie uit weefsel</td></tr><tr><td>Purelink DNAse set</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12185010A</td><td>DNA-digestie op kolom</td></tr><tr><td>Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>magneet voor gebruik met Dynabeads</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>massaspectrometrie-compatibele gelkleurstof</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>voor gebruik in western blot</td></tr><tr><td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368813</td><td>voor gebruik in genexpressieanalyse</td></tr><tr><td>Proflex 3 x 32-well PCR System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4484073</td><td>PCR-systeem</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td><td>voor western blot</td></tr><tr><td>Power Up SYBR master mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td><td>voor qPCR-analyse</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td>oplossing voor weefselopslag voorafgaand aan RNA-isolatie</td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Voorgevormd eiwitgel</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>voor western blot detectie van K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>voor western blot detectie van vimentin</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>voor natte overdracht van eiwitgels</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>voor het bereiden van eiwitgel monsters</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>voor het draaien van eiwitgels</td></tr><tr><td>Lysing beads - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Lyse-kralen en matrixbuizen voor weefseldisruptie en RNA-extractie</td></tr><tr><td>Lysing beads - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>Lyse-kralen en matrixbuizen voor weefseldisruptie en eiwitextractie</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td>meting van eiwit en nucleïnezuur</td></tr><tr><td>Precellys 24 homogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>Geautomatiseerde weefselhomogenisator</td></tr></tbody></table>

isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Intermediaire filamenten (IF&#39;s), samen met actinfilamenten en microtubules, vormen het cytoskelet - een kritisch structureel element van elke cel. Normaal functioneren IF&#39;s leveren cellen met mechanische en spanningsbestendigheid, terwijl een dysfunctioneel IF-cytoskelet de cellulaire gezondheid compromiseert en met veel mensenziekten is geassocieerd. Post-translationele modificaties (PTM&#39;s) regelen de IF-dynamiek kritiek op fysiologische veranderingen en onder stressomstandigheden. Daarom kan het vermogen om veranderingen in de PTM-handtekening van IF&#39;s te volgen, bijdragen aan een beter functioneel begrip en uiteindelijk conditioneren van het IF-systeem als een stressrespons tijdens cellulaire verwondingen. Het grote aantal IF-eiwitten, die door meer dan 70 individuele genen worden gecodeerd en op weefselafhankelijke wijze worden uitgedrukt, is echter een grote uitdaging om het relatieve belang van verschillende PTM&#39;s te sorteren. Daartoe zijn methoden die de controle op PTM&#39;s op IF-eiwitten mogelijk makenOp organisme-breed niveau, in plaats van voor geïsoleerde leden van de familie, kan de vooruitgang op het gebied van onderzoek op dit gebied versnellen. Hier presenteren we biochemische methoden voor het isoleren van de totale, detergensoplosbare en detergensbestendige fractie van IF-eiwitten uit 9 verschillende muisweefsels (hersenen, hart, long, lever, dunne darm, dikke darm, pancreas, nier en milt). We tonen verder een geoptimaliseerd protocol voor snelle isolatie van IF-eiwitten door gebruik te maken van lysende matrix en geautomatiseerde homogenisatie van verschillende muisweefsels. Het geautomatiseerde protocol is nuttig voor het profileren van IF&#39;s in experimenten met een hoog monstervolume (zoals bij ziektemodellen waarbij meerdere dieren en experimentele groepen betrokken zijn). De resulterende monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream analyses, met inbegrip van massaspectrometrie-gebaseerde PTM profilering. Met behulp van deze methoden geven wij nieuwe gegevens aan om te tonen dat IF-eiwitten in verschillende muizenweefsels (hersenen en leveren) parallelle veranderingen ondergaan met betrekking tot hun expressiesZioniveaus en PTM&#39;s tijdens veroudering.

Een nieuwe snelle methode voor het op hoge zout gebaseerde extractie van IF-eiwitten uit meerdere muisweefsels met behulp van lyseringsmatrix. De traditionele methode 25 , 26 van het isoleren van het grootste deel van de tussenliggende filament eiwitfractie uit epitheliaal weefsel werd hier gewijzigd om 9 verschil...

In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF&#39;s kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Het algemene doel van deze biochemische procedure is het isoleren van fracties die verrijkt zijn met intermediaire filamenten uit meerdere weefsels van muizen, om posttranslationele modificaties van de verschillende weefselspecifieke intermediaire filamenteiwitten te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de intermediaire filamenten, zoals de vraag hoe de functie en regulatie van deze belangrijke stressbeschermende cytoskeletale eiwitten beïnvloed worden tijdens de veroudering bij zoogdieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de integratie van een geautomatiseerde weefsellysisstap gebruikers in staat stelt om meerdere weefselmonsters op een snelle en efficiënte manier te verwerken.Begin met het toevoegen van één milliliter ijskoude Triton X-100-buffer, aangevuld met protease-remmers, aan een glazen buishomogenisator en plaats deze op ijs. Haal een klein stukje weefsel uit de vloeibare stikstofopslag en plaats het direct in de glazen homogenisator. Homogeniseer vervolgens het monster met ongeveer 50 slagen van een polytetrafluoretheleen-pastille, terwijl u de homogenisator en het monster te allen tijde op ijs houdt en de vorming van bellen minimaliseert.Breng het lysaat op ijs over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer de monster bij 20.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel vervolgens de Triton X oplosbare supernatante fractie in een aparte buis. Deze fractie kan worden gebruikt voor immunoprecipitatie en analyse van de detergent-oplosbare pool van IF-eiwitten.Voeg vervolgens één milliliter high salt buffer, aangevuld met proteaseremmers, toe aan het weefselpellet. Draag dit over naar een schone homogenisator en voer 100 slagen dounce-homogenisatie uit. Draag het homgeneaat terug over naar de microcentrifugebuis en plaats de buis gedurende één uur op een roterende shaker in de koelruimte.Centrifugeer de homogenaten bij 20.000 ×g bij 4 °C gedurende 20 minuten en verwijder het supernatant. Voeg één milliliter ijskoud PBS-EDTA-buffer toe aan het pellet en breng dit over naar een schone homogenisator als laatste reinigingsstap. Breng het monster na homogenisatie over naar een nieuwe buis en centrifugeer dit bij 20.000 ×g bij 4 °C gedurende 10 minuten om het IF-proteïnerijke high salt extract, of HSC, te verkrijgen.Verwijder het supernatant en los het pellet op in 300 microliters voorverwarmde niet-reducerende SDS-monsterbuffer. Breek het pellet aanvankelijk op door middel van pipetteren en vortexen. Verhit de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij 95 degrees Celsius.Vortexen en pipetteren indien nodig om ervoor te zorgen dat het pellet volledig is opgelost, wat enkele minuten kan duren. Bewaar alle monsters bij -20 °C tot aan de analyse. Om RNA-extractie uit te voeren, wordt lysisbuffer toegevoegd aan een buis met lysine matrix D, waarna het monsterweefsel aan de weefsellyser wordt toegevoegd en twee keer gedurende elk 25 seconden wordt gepulst.Scheid het lysaat van de matrix door centrifugatie bij 20.000 ×g. Voeg voor eiwitextractie Triton X-100 of SDS-monsterbuffer toe indien er een totaal lysaat wordt voorbereid. Voeg dit toe aan een lysine-buis met lysine-matrix SS. Voeg vervolgens het monsterweefsel toe. Pulseer het monster kort om te mengen.Om HSC voor te bereiden, gebruikt u een magneet om de roestvrijstalen kraal uit de buis te verwijderen en centrifugeert u de buizen bij 20,000 ×g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Scheid de supernatant- en pelletfracties en ga verder zoals eerder in de video is gedemonstreerd. Bereid PBST-buffer door 10 µL T20 toe te voegen aan 50 mL PBS pH 7.4.Bereid vervolgens de PTM-antilichaamoplossing door 1 tot 10 µg antilichaam toe te voegen aan 200 µL PBST. Verdeel 50 µL magnetische beads over een microcentrifugebuisje. Plaats dit op de magneet en aspireer de bewaarloesing van de beads.Conjugeer de beads aan het immunoprecipitatie-antilichaam door de beads opnieuw te suspenderen in de antilichaamoplossing en het monster gedurende 20 minuten op een rotator bij kamertemperatuur te incuberen. Plaats de buisjes op de magneet en aspireer de antilichaamoplossing. Gebruik vervolgens 200 µL PBST om de geconjugeerde antilichaam-beads één keer te spoelen en verwijder de oplossing.Voeg 0,6 tot één milliliter van het weefsellysaat toe aan de beads. Meng door voorzichtig te pipetteren en incubeer de oplossing op een rotator in een koelruimte gedurende drie uur. Plaats de buisjes op de magneet en verwijder het lysaat, gebruik vervolgens 200 microliters PBST om de beads vijf keer te wassen.Verzamel na de laatste wasstap de beads en 100 µL PBS en breng de beads over naar een nieuwe, schone buis. Plaats de buis op de magneet en aspireer vervolgens de PBS. Verwijder de buis van de magneet en voeg 100 µL niet-reducerende monsterbuffer toe.Neem een aliquot van 50 µL uit de buis en combineer dit met 5% 2ME om reducerende monsters te maken. Verhit de monsters gedurende vijf minuten tot 95 °C. Terwijl de buis op de magneet staat, verzamelt u de IP-fractie van de beads en brengt u deze over naar een nieuwe buis.Bewaar de monsters bij -20 °C tot aan de analyse. Om contaminatie van eiwitmonsters voor massaspectrometrieanalyse te voorkomen, dienen schone handschoenen te worden gebruikt bij de behandeling van alle gels, en moeten deze worden geïncubeerd in schone containers die uitsluitend met DD H2O zijn gewassen. Breng 20 tot 50 µL van het HSE-monster aan op een SDS-PAGE-gel volgens standaardcondities.Nadat de gel volgens het tekstprotocol is gekleurd, wordt de gel tussen plastic beschermhoezen geplaatst. Scan vervolgens de gel en markeer de banden die worden uitgesneden. Gebruik een nieuw, schoon scheermesje om de IF-eiwitbanden uit te snijden en plaats de banden in schone microcentrifugebuisjes op ijs voordat ze worden ingeleverd voor massaspectrometrie-analyse.Deze figuur toont een typisch resultaat van HSE's van negen muisweefsels die met de snelle methode zijn geïsoleerd. Let op dat deze methode niet goed werkt bij de pancreas en milt, en aanvullende banden oplevert in een monster van de dikke darm. Deze genexpressieanalyse laat zien dat Keratin 8 is opgereguleerd tijdens veroudering.Bovendien tonen western blots aan dat Keratine 8 sterk is upgereguleerd in de levers van oude muizen. Hier laat een lever-HSE, verkregen met behulp van het geautomatiseerde protocol, de sterke verrijking van Keratine 8 en 18 op de gel zien. Massaspectrometrie-analyse laat zien dat K8 en K18 in de lever van een oude muis meerdere fosforylerings- en acetyleringsplaatsen hebben die niet aanwezig zijn in de lever van de jonge muis.Vergelijkbaar met de veranderingen in keratine in de lever, onthult analyse van hersenweefsel via QPCR een vijfvoudige inductie van GFAP mRNA in de hersenen van muizen van 24 maanden oud in vergelijking met muizen van drie maanden oud. Ten slotte laat eiwitanalyse van de extracten met een hoog zoutgehalte via Coomassie-kleuring, en immunoblots van totale en acetyllysine-verrijkte fracties, zien dat het GFAP-eiwit is upgereguleerd en geacetyleerd in de hersenen van de verouderde muis. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals op massaspectrometrie gebaseerde proteomix, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de belangrijke posttranslationele modificaties en bindingspartners van intermediaire filament-eiwitten zijn tijdens verschillende fysiologische en pathofysiologische condities.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intermediaire filament-eiwitten uit verschillende zoogdierweefsels kunt isoleren.

isolation-intermediate-filament-proteins-from-multiple-mouse-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates an in vivo imaging-based assay to determine proteostasis decline due to aging. The assay uses Caenorhabditis elegans expressing polyglutamine YFP-fusion protein in body wall muscles to measure the age-associated aggregation of polyglutamine and induction of proteotoxicity, leading to paralysis.

Fluorescent Reporter-Based Paralysis Assay: A Technique to Assess Age-Associated Progressive Formation of Polyglutamine Fluorescent Reporter and Associated Paralysis in Caenorhabditis elegans

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Microtubuli, die tubulinepolymeren zijn, spelen een cruciale rol als onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen en staan bekend om hun dynamische instabiliteit. Deze studie ontwikkelde een methode voor het fractioneren van microtubuli om ze te scheiden in stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline om de stabiliteit van microtubuli in verschillende muizenweefsels te evalueren.

Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden

Het protocol presenteert de beeldvormings- en computationele workflow om beeldvormingsgebaseerde chromatine en epigenetische leeftijd (ImAge) te extraheren en te valideren.

Meten van eencelveroudering met een beeldvormingsgebaseerde biomarker van chromatine en epigenetische veroudering

Gemodificeerde Northern blotting methode voor het meten N6 -methyladenosine (m 6 A) veranderingen in RNA wordt beschreven. De huidige methode kan wijzigingen in diverse RNA's en controles onder verschillende experimentele ontwerpen te detecteren.

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

Leer een biochemische methode om intermediaire filamenten te isoleren uit meerdere muisweefsels voor analyse van post-translationele modificaties tijdens veroudering. Deze geautomatiseerde techniek ondersteunt hoogdoorvoerstudies.

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties (Video) | JoVE Journal

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Meer video's verkennen