Name: Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Ontdek hoe je antilichaam-antigeen bindingskinetiek meet met vier biosensorplatforms voor drug discovery. Deze methode vergelijkt Biacore, ProteOn, Octet en IBIS-MX96 voor betrouwbare therapeutische antilichaamselectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Noah Ditto en Adam Miles voor technische bijstand aan de IBIS MX96.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
<li>Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3">http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3</a> 35-76 (2015).</li>
<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel werd betaald door Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Onze head-to-head vergelijking studie toont aan dat elke biosensor platform heeft zijn eigen sterke en zwakke punten. Hoewel de bindingsprofielen van de antilichamen vergelijkbaar door visuele vergelijking (figuren 3-6), en de rangorde van de verkregen kinetische snelheidsconstanten zeer consistent instrumenten (figuur 7), onze resultaten tonen aan dat SPR gebaseerde instrumenten continue stroom vloeistofcomponenten) zijn beter in oplossing met hoge affiniteit interacties met trage dissociatie tarieven. Toenemend verschil in de dissociatiefase waargenomen in datasets (bijvoorbeeld mAb 2, 5 mAb, mAb en 9 Figuur 5) gegenereerd door de BLI fluidics-vrij instrument. Deze bevinding kan grotendeels toegeschreven monster verdamping tijd in de microtiterplaat en een belangrijkste beperking van het systeem. Deze inherente beperking, worden experimentele keer ook beperkt tot minder dan 12 h; de experimenten werden daarom geprogrammeerd met shorter keer (500 s associatie- en dissociatie 30 min) vergeleken met die van andere platformen (10 min associatie- en dissociatie 45 min). Echter, het verkorten van de experimentele tijd niet lijken om de impact van de verdamping op de kwaliteit van de gegevens / consistentie te beperken, als de snelheid constanten die door de BLI-gebaseerde instrument tonen minder lineariteit als gevolg van fluctuaties in een aantal van de off-rates (Figuur 8C ). Naast monster verdamping, kunnen afwijkingen in de invangreagentia die hebben bijgedragen tot de verschillen in de resultaten. Terwijl proteïne A / G werd in alle drie fluidics SPR gebaseerde platforms werden AHC sensoren voor non-fluidics BLI platform. Omdat proteïne A / G zal waarschijnlijk een zwakkere affiniteit voor de mAbs dan doet de AHC, een antilichaam gebaseerde biosensor oppervlak, de off-rates van de mAb-antigeencomplex van het proteïne A / G oppervlakken kan kunstmatig lijkt sneller dan hebben verkregen uit het AHC oppervlak. Deze mogelijkheid wordt ondersteund by de experimentele gegevens die aantonen dat de off-rate waarden gegenereerd door de BLI platform constant lager dan die verkregen uit andere instrumenten (figuur 7, rode lijn). Toch is de BLI platform heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere platformen. Zo is het zeer flexibel in sensor keuze en proefconfiguratie gevolg van de verschillende vooraf beklede sensoren voor onmiddellijk gebruik. In onze experimenten, het gebruik van de AHC sensoren langer nodig dat de ligand immobilisatie stappen, waardoor de voorbereidingstijd. Bovendien is de BLI platform vergt minder onderhoud vergeleken met de andere vloeistofcomponenten SPR platforms, die ingewikkeld slangen en waar switchconfiguraties voorzien. Dit kenmerk is een voordeel voor experimenten met ongezuiverde monsters die verstopping en vervuiling problemen kunnen veroorzaken. Omdat de vraag voor een efficiënte, snelle en nauwkeurige identificatie van therapeutische kandidaten toeneemt, neemt de behoefte aan biosensor throughput stijgt eveneens. Van de vier biosensor platforms, het debiet van de biosensor geschikt 96-ligand matrix printen is het hoogst, gevolgd door de biosensor gekoppeld met een kriskras 36-ligand formaat en het BLI-gebaseerde biosensor met 16-kanaals gelijktijdige uitlezing, wat uiteindelijk stijgen het aantal interacties gemeten in een bindcyclus 96, 36 en 16, respectievelijk. Deze throughput mogelijkheden zijn significant hoger dan die van de traditionele SPR platform, dat wordt begrensd doordat slechts vier stroomcellen verbonden door een seriële stroom. Aangezien onze experimenten betrof een relatief kleine steekproef stel 10 mAbs geëvalueerd op verschillende oppervlaktedichtheden met lange dissociatie maal de instrumentele doorvoer speelde matige rol bij het bepalen van de efficiëntie van de experimenten. Er waren geen significante verschillen in de experimentele tijden van de drie high-throughput platformen, en in alle gevallen werden de experimenten in één dag voltooid. Aan de andere kant, de traditionele seriële stroom SPR experimenten vereist 3 dagen in beslag, ondanks de walk-away automatisering van data-acquisitie na de installatie. In andere studies die een groot aantal monsters (dat wil zeggen in de honderden of duizenden) omvatten, voor off-rate ranking / kinetische screening of epitoop binning doeleinden, het debiet wordt een kritische factor. Hoewel de consumptie in IBIS MX96 is orden van grootte hoger dan die van de andere biosensoren en daarom een ​​optimale keuze voor deze doeleinden heeft enkele tekortkomingen. Met name de matrix drukken van de CFM toont groot oppervlak inconsistenties (figuur 1) en gereduceerde data reproduceerbaarheid (Figuur 8D en 8E). Voor nauwkeurige kinetische metingen de hoeveelheid ligand op de biosensor oppervlak een kritische parameter die moet worden geregeld zodanig dat de binding responsen niet worden verstoord door secundaire factoren zoalsmassaoverdracht of sterische hindering. Voor de Biacore T100 en Proteon XPR36 werden de optimale RL niveaus bepaald op basis van de standaardberekening van ingestelde Rmax waarden zoals beschreven in het onderzoek artikel 17. Anderzijds, voor Octet RED384 en IBIS MX96 platforms, het mAb capture niveaus werden bereikt empirisch met behulp van een reeks 2-voudig serieel verdunde antilichamen met constante tijd. Het gebrek aan kennis of controle van de vangstap resulteerde in een hoge dichtheid oppervlak en hoge binding responssignalen (figuur 2) dat de nauwkeurigheid van de kinetische snelheidsconstanten gevaar zouden brengen. Bovendien is de scheiding van de printer in de SPR detector presenteert ook een uitdaging bij het uitvoeren van meerdere metingen bindcyclus met regeneraties. De enige manier om de multi-cycle kinetiek instelling uit te voeren is door directe koppeling van het amine mAb, in tegenstelling tot het mAb Fc te vangen door het geïmmobiliseerde proteïne A / Goppervlak in de andere drie biosensor platforms. Als resultaat werd een extra regeneratie verkennende experimenten nodig om de optimale condities te bepalen regeneratie. Het resultaat van deze opstelling is verbonden met een -90% lager waargenomen oppervlakteactiviteit vergeleken met de Fc invangwerkwijze (figuur 9), naast een experimentele langere tijd. Om de Fc capture methode uit te voeren, werd een alternatief single-cycle kinetische benadering. Deze benadering omvat de achtereenvolgende injectie van analyt toenemende concentraties zonder regeneratie tussen elke injectie (figuur 2). Dit zeer gunstig, maar minder algemeen toegepaste benadering niet alleen verkort de experimentele tijd en verminderde reagensverbruik, maar produceerde ook kinetische snelheidsconstanten vrijwel gelijkwaardig aan die van de andere biosensoren (figuur 7). Daarom deze enkele cyclus kinetiek benadering overwint de inherente beperking configuratie van het instrument en fungeertmogelijkheid tot het verkrijgen van hoge-resolutie kinetische snelheidsconstanten in een high-throughput manier. Ondanks de doorvoer dat een belangrijke beperking in de Biacore T100, onze resultaten laten zien collectief dat het genereren van de meest consistente gegevens met de hoogste kwaliteit. Dit werd gevolgd door de Proteon XPR36 die ~ 10-voudig hogere doorvoer heeft. Hun vermogen om hoge kwaliteit te genereren wordt een voordeel bij het karakteriseren hoge affiniteit antilichaam-antigen interacties die technisch uitdagend zijn wanneer detectielimiet van het instrument bereikt. En de systematische beperkingen in instrumentatie van de Octet RED384 belemmeren de nauwkeurige meting van dissociatiesnelheidsconstanten (dat wil zeggen, achter bij de gevoeligheid voldoende verval van het signaal voor langzame off-rates te lossen), zowel de Biacore T100 en Proteon XPR36 kunnen gevoelig en betrouwbaar is detectie voor differentiatie.

De acquisitie van betrouwbare kinetische parameters voor het karakteriseren van antilichaam-antigeeninteracties is een essentieel onderdeel van het proces van geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling1. Optische Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensoren, de 'gouden standaard' voor real-time detectie van deze interacties, worden al ongeveer twee decennia gebruikt om de vroege selectie van criteria-volgende therapeutische antilichaamkandidaten mogelijk te maken2,3. Naast het verstrekken van een affiniteitsranglijst van antilichaamkandidaten door snelle bindingsscreening van ruwe supernatanten4 en rigoureuze bepalingen van kinetische constanten van gezuiverde preparaten5, kunnen biosensoren de functionele activiteit van leadkandidaten verder differentiëren via epitope binning studies6,7. 
Om aan de groeiende vraag naar antilichaamgebaseerde producten voor verschillende therapeutische indicaties8 te voldoen, is er de afgelopen jaren een breed scala aan innovatieve biosensorinstrumenten ontwikkeld die de efficiëntie van kandidaatidentificatie en -karakterisering verhogen9,10. Deze instrumenten verschillen in ontwerp van de microfluïdische kanaalconfiguratie en/of in de optische principes die betrokken zijn bij het detecteren van biomoleculaire interacties. Specifiek hebben de Octet RED38411, ProteOn XPR3612 en IBIS MX967 het aantal interacties gemeten in een enkele bindingscyclus uitgebreid naar respectievelijk 16, 36 en 96, wat een significante doorvoerverbetering betekent ten opzichte van het traditionele Biacore-platform. Hoewel deze verschillende biosensorplatforms allemaal essentiële kinetische gegevens leveren voor het karakteriseren van antilichaam-antigeeninteracties, verschillen ze in experimentele opstelling en operationele procedures vanwege variaties in instrumentele configuraties. Bijvoorbeeld, in de SPR-beeldarrayplatform van IBIS MX96, wordt de multiplex ligand-immobilisatie stap uitgevoerd in een offline modus in een extern afdrukapparaat gescheiden van de detector7,13; in tegenstelling, de andere drie biosensorplatforms gebruiken een 'all-in-one' setup, waarbij het toevoegen van componenten op het sensoroppervlak, of het nu de activeringsreagens, ligand of analyt is, in real-time en door voorgeprogrammeerde commando's in sequentiële volgorde wordt geregistreerd. In de Octet RED384 is een uniek kenmerk van dit BioLayer Interferometry (BLI)-gebaseerde platform de beschikbaarheid van voorgecoate optische vezelbiosensoren voor onmiddellijk 'dip-and-read' gebruik14, waardoor de noodzaak voor ligandoppervlaktevoorbereiding en initiërings-/conditioneringsstappen wordt geëlimineerd, die vaak vereist zijn voor de sensorchips in SPR-gebaseerde platforms. Het vloeistof-vrije ontwerp van dit instrument vereenvoudigt ook de mechanica en vermijdt verstoppingen en besmettingszorgen bij het omgaan met ruwe monsters. Met het nieuwe 6 x 6 kriskras vloeistofontwerp in de ProteOn XPR36, kan een 'one-shot' kinetische aanpak worden geïmplementeerd door het schakelen van de stroomkanalen tussen horizontale en verticale richtingen om 36 interactieplekken te creëren15. In plaats van bindingskinetiek te beoordelen voor één ligand of analytconcentratie per keer, zoals in het traditionele seriële flow Biacore T100-platform, biedt deze aanpak de mogelijkheid om tot 36 verschillende interacties tegelijkertijd in een enkele bindingscyclus te monitoren. 
Ondanks hun verschillen worden deze vier biosensorplatforms allemaal wereldwijd veel gebruikt door veel laboratoria. Voor nieuwe gebruikers met weinig praktische ervaring met biosensoren kan het beslissen welk instrument te gebruiken een uitdagende taak zijn, gezien de verschillen in instrumenteel ontwerp. Om het meest geschikte instrument voor hun onderzoeksdoeleinden te bepalen, moeten factoren zoals datakwaliteit, consistentie van prestaties, doorvoer, gebruiksgemak en materiaalverbruik collectief worden overwogen. Terwijl verschillende benchmarkstudies de variabiliteit van kinetische snelheidsconstanten verkregen uit meerdere laboratoria en biosensoren hebben onderzocht5,16, heeft een recent gepubliceerd head-to-head vergelijkingsonderzoek verder de systematische factoren aangepakt die de gegevensbetrouwbaarheid beïnvloeden vanuit het oogpunt van instrumentele prestaties17,18. De protocollen die in deze video worden geleverd, richten zich in detail op de experimentele opstelling en procedures, en gaan vergezeld van het onderzoeksartikel getiteld 'Vergelijking van biosensorplatforms in de evaluatie van hoge affiniteit antilichaam-antigeenbindingskinetiek'17. Deze protocollen zijn niet alleen bedoeld om nieuwe biosensorgebruikers te helpen deze instrumenten te implementeren voor hun onderzoeksdoeleinden, maar ook om aanvullende inzichten te bieden voor huidige biosensorgebruikers met betrekking tot technische uitdagingen en overwegingen in experimentele ontwerpen voor het evalueren van hoge-affiniteit antilichaam-antigeeninteracties.

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 System</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>Het T100-systeem is geüpgraded naar T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensor Chip&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Versie 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 Control Software</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>De T100-besturingssoftware is geüpgraded naar T200</td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Bevat: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10,5 mL 1,0 M ethanolamine-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer 10&times;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Geconcentreerde stockoplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Caps, type 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager Software&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Versie 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Sensor Chip</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>Bevat EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Bevat 1 glycine buffer (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0), en NaOH, SDS, HCl, fosforzuur, NaCl; 50 mL elke oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Bevat fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octet RED384 System</td><td>FortéBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>FortéBio</td><td></td><td>Versie 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td><td>FortéBio</td><td>18-5060</td><td>Een lade met 96 biosensoren&nbsp;</td></tr><tr><td>384-Well Tilted-Bottom Plate&nbsp;</td><td>FortéBio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor Dispenser</td><td>FortéBio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>FortéBio</td><td>18-1092</td><td>10x concentratie. Bevat ProClin 300.&nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versie 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G chip</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versie 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint Data Analysis Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versie 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>BioLogic Software</td><td></td><td>Versie 2</td></tr><tr><td>Pierce Recombinant Protein A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend kinetics met behulp van vier biosensor platforms

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-vrije optische biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen in drug discovery voor de karakterisering van biomoleculaire interacties. In deze studie beschrijven we het gebruik van vier routinematig biosensor platforms in ons laboratorium om de bindingsaffiniteit en kinetiek van tien hoge affiniteit monoklonale antilichamen (mAbs) tegen humaan subtilisine proprotein convertase Kexin Type 9 (PCSK9) te evalueren. Terwijl zowel Biacore T100 en Proteon XPR36 zijn afgeleid van de gevestigde Surface Plasmon Resonance (SPR) technologie, de eerstgenoemde vier stroomcellen verbonden door seriële stroom configuratie, terwijl laatstgenoemde stelt 36 reactiemengsel spots in parallel via een geïmproviseerde 6 x 6 kruiselings microfluïdische kanaalconfiguratie. IBIS MX96 werkt ook op basis van de SPR sensortechnologie, met een extra imaging functie die detectie bepaalt ruimtelijke oriëntatie. Deze detectietechniek combinatie met de continue toediening Microspotter (CFM) breidt de doorvoersnelheid pernabling multiplex matrix printen en detectie van 96 reactie sport tegelijkertijd. Daarentegen wordt het Octet RED384 basis van de BioLayer interferometrie (BLI) optisch principe met optische probes als de biosensor aan interferentiepatroon detecteren verandert na binding interacties op het tipoppervlak. In tegenstelling tot de SPR-gebaseerde platforms, heeft de BLI-systeem niet vertrouwen op continue stroom fluidics; in plaats daarvan de sensor tips verzamelen metingen terwijl ze in analytoplossingen van een 384-putjes microplaat worden ondergedompeld tijdens orbitaal roeren. Elk van deze biosensor platforms heeft zijn eigen voor- en nadelen. 1 moleculair interactiemodel: een directe vergelijking van het vermogen van deze instrumenten om kwaliteit kinetische gegevens, de beschreven protocollen illustreren experimenten die dezelfde test formaat en dezelfde hoge kwaliteit reagens om antilichaam-antigen kinetiek die de simpele 1 stop karakteriseren bieden .

Figuur 1 het antilichaam matrix beeld van CFM en gespot mAb niveaus van beide immobilisatie werkwijzen en figuur 2 toont het overeenkomstige bindende sensorgrammen gegenereerd in de MX96 van multicyclische kinetische en de single-cycle kinetische volgende mAb arrays . De real-time binding en kinetisch ingerichte curven van verschillende met antilichaam beklede oppervlakken gevormd in de vier biosensor platforms zijn getoond in figuren 3-6. Figuur 7 toont de vergelijking van de uiteindelijke kinetische prijzen en equilibrium bindingsconstanten verkregen uit de globale analyse van deze bindingscurven. De afzonderlijke associatie (ka), dissociatiesnelheid (kd) en evenwicht (KD) bindende constanten worden in tabel 1. Om de variabiliteit van datasets gegenereerd binnen hetzelfde instrument aan te tonen, <strong&gt; Figuur 8 toont grafieken van ka, kd en KD met verschillende mAb oppervlaktedichtheden, en Figuur 9 vergelijkt verder de berekende bindingsactiviteiten van het mAb oppervlakken over de bio platforms. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figuur 1. Multiplex Ligand geïncorporeerde Amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichaam oppervlakken van CFM afdrukken in de IBIS MX96. Beelden van de gedrukte arrays worden weergegeven in de linker panelen, waar de grijze gebieden omsloten door rode vierkanten wijzen op de aanwezigheid van het antilichaam. De donkere interspots gelegen tussen actief antilichaam vlekken worden als referentie aftrekken. Elke kolom bevat een antilichaam afgedrukt titratie concentraties beneden en links van de afbeelding aangegeven. De hoeveelheden van de gedrukte antilichamen gekwantificeerd door het berekenen van de difference in bulk verschuivingen tussen de actieve en de referentie locaties worden getoond in de rechterpanelen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figuur 2. Vergelijking van real-time Binding sensorgrammen van multi-cyclus (A) en gedurende één cyclus (B) Kinetische experimenten in IBIS MX96. De opeenvolgende injecties van humaan PCSK9 bij toenemende concentraties over de 10 x 8 antilichaam arrays zijn boven elke corresponderende sensorgram segment genoteerd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <strong&gt; Figuur 3. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Biacore T100. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figuur 4. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Proteon XPR36. De interacties worden geëvalueerd over hoge (bovenste panelen), medium- (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figuur 5. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Octet RED384. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De overlay rode lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1:<html> 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figuur 6. Binding sensorgrammen van de amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in IBIS MX96. De bindingsprofielen zijn georganiseerd als 10 x 8 panelen die de relateringstabel plaat figuur 1 te volgen. De zwarte lijnen de geregistreerde binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 en bedekt rode lijnen stellen de gemonteerde bochten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> guur 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7. Vergelijking van de vereniging ka (A), dissociatie kd (B) en Equilibrium KD (C) Binding Constanten Gegenereerd door vier Biosensor platforms. De kinetische parameters worden afgeleid uit de globale analyse van de bindingskrommes in figuren 3-6. De instrumenten worden als volgt vertegenwoordigd: Biacore T100 (blauw), Proteon XPR36 (groen), Octet RED384 (rood), IBIS MX96, amine gekoppeld (paars) en IBIS MX96, Fc-gevangen (oranje). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figuur 8. Vergelijking van de Consistentie van de Kinetic snelheidsconstanten over meerdere Antibody Surface dichtheden in de Biac<html> ore T100 (A), Proteon XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, amine-gekoppelde (D) en IBIS MX96, Fc-ingevangen (E). De kinetische parameters ka (bovenste subpanelen), kd (middelste subpanelen), en KD (bottom subpanelen) afgeleid uit groep analyse op individuele oppervlakte-antilichaam dichtheid. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figuur 9. Binding Activiteiten van het antilichaam oppervlakken en hun standaarddeviaties (foutbalken) in het Four Biosensor Platforms. De berekening vindt plaats via vergelijkingen in de onderzoeksartikelen 17 beschreven.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> ka </td><td> kd </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M-1 s-1) </td><td> (S-1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4.89 (4.18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1.30 (1.54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4.20 (2.13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12.5 (7.64) x 10 -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Kinetic tarieven en Equilibrium Binding constanten van 10 mAbs Verkregen door Global Fitting bindingskrommes van Four Biosensor Instruments aan de 1: 1 Interaction Model.

We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Het doel van deze biosensorstudie is om het vermogen van de vier routinematig gebruikte biosensorplatforms om kwalitatieve kinetische gegevens te leveren te vergelijken en om inzichten te verschaffen met betrekking tot technische uitdagingen en overwegingen bij experimentele ontwerpen voor het evalueren van antilichaam-antigeeninteracties met een hoge affiniteit. Deze studie beantwoordt kernvragen in het veld van drug discovery voor de selectie van biosensorplatforms en assayformaten die de meest betrouwbare resultaten mogelijk maken bij de evaluatie van therapeutische antilichaamkandidaten. Het belangrijkste voordeel van deze studie is dat het een directe en uitgebreide vergelijking biedt van de verschillende biosensorplatforms met betrekking tot dataconsistentie, kwaliteit en operationele efficiëntie.Een videodemonstratie van de vier protocollen is essentieel, omdat het nieuwe gebruikers met weinig praktijkervaring helpt te leren hoe ze experimenten op deze instrumenten moeten opzetten. Voor kinetische metingen in de Biacore T100 klikt u op File, Open New Method, en opent u het methodebestand. Controleer de parameters in de methode.Stel in Cycle Types de contacttijd in op 220 seconden voor capture 1 via flow path 2, 110 seconden voor capture 2 via flow path 3, en 55 seconden voor capture 3 via flow path 4. De stroomsnelheid is 10 µL per minuut voor alle capture-cycli. Selecteer Sample 1 en vink sample solution aan als variabele.Stel vervolgens de contacttijd in op 600 seconden en de dissociatietijd op 2.700 seconden voor stroompad 1, 2, 3, 4. De stroomsnelheid wordt ingesteld op 30 µL per minuut. Selecteer daarna Regeneratie 1, voer glycine HCl pH 1.5 in het veld voor de oplossing in en stel de contacttijd in op 20 seconden voor stroompad 1, 2, 3, 4.Voer bij Variable Settings tweevoudige titratieconcentraties in van 100 nanomolar tot 6,25 nanomolar voor cyclus 1-3, 50 nanomolar tot 3,12 nanomolar voor cyclus 4-8, en 5 nanomolar tot 0,323 nanomolar voor cyclus 9-10. Kies bij Setup Run het detectie-stroompad 2-1, 3-1, 4-1 en klik vervolgens op next. Vink prime before run aan en klik daarna opnieuw op next.Selecteer Sample and Reagent Rack 1 en definieer de locatie voor de reagentia. Pipetteer de reagentia dienovereenkomstig in de individuele monsterbuisjes en plaats het rek in het instrument. Klik op Eject Rack om de deur van het monsterladecompartiment te openen en plaats vervolgens het monsterrek in het instrument.Klik vervolgens op Start en voer een experimentnaam in om deze op te slaan en de run te starten. Selecteer voor de kinetische metingen in de ProteOn XPR36 eerst Protocols en daarna Samples om de immobilisatie te starten. Definieer EDC/Sulfo-NHS als activator in wells H1-H6, proteïne A/G als ligand in G1-G6, ethanolamine als deactivator in F1-F6, glycine als regenerator in E1-E6, PBS-T-EDTA als blank in D1-D6, monoklonaal antilichaam X-monster als ligand in C1-C6, en menselijk PCSK9 als analyt in wells B1-B6.Selecteer Stappen en dubbelklik vervolgens op Immobilisatie in de protocoleditor. De stappen omvatten drie opeenvolgende horizontale injecties van EDC/Sulfo-NHS, proteïne A/G en een molaire ethanolamine. Elke injectie moet een stroomsnelheid van 30 microliters per minuut en een contacttijd van 300 seconden hebben.Klik vervolgens op Regenerate. Injecteer drie pulsen van 18 seconden glycine met een snelheid van 100 microliters per minuut in zowel de horizontale als verticale richting. Volg dit op met twee pulsen van 60 seconden PBS-T-EDTA met een snelheid van 25 microliters per minuut, eveneens in beide richtingen.Klik vervolgens op Ligand en injecteer monoklonaal antilichaam 1 en monoklonaal antilichaam 2 in verticale richting, met een stroomsnelheid van 25 microliters per minuut en een contacttijd van 160 seconden. Klik daarna op Analyte en injecteer vijf concentraties van humaan PCSK9 in een blanco buffer over zes horizontale kanalen gelijktijdig. Gebruik 40 microliters per minuut voor 600 seconden associatietijd, gevolgd door 700 seconden dissociatietijd.Klik vervolgens op Regenerate en injecteer twee pulsen glycine van 18 seconden met een snelheid van 100 microliters per minuut in zowel de horizontale als verticale richting. Bereid daarna de monsters en reagentia voor in één 96-wellplaat volgens de gedefinieerde posities van de reagentia. Plaats de plaat in het instrument, klik vervolgens op het tabblad Run, selecteer het protocol en klik op Start.De parallelle injectie met zes naalden bij de registratie van live experimentele gegevens wordt gedemonstreerd. Voor de kinetische metingen in de Octet RED384 stelt u de experimentele methode in door in de software voor gegevensverwerving eerst op Experiment te klikken, gevolgd door New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment en vervolgens Basic Kinetics. Klik daarna op Modify Plates en wijzig 96 Wells in 384 Wells voor zowel Plate 1 als Plate 2.Definieer de monster-types en posities in de plaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Ga naar de assay-definitie om de experimentele opstelling te definiëren. De experimentele opstelling wordt gedefinieerd als een baselijntijd van 30 seconden, een regeneratietijd van 30 seconden, een equilibratietijd van 18 seconden, een loading met een tijd van 200 seconden, een associatietijd van 500 seconden en een dissociatietijd van 1.800 seconden.De schudspeed is ingesteld op 1, 000 RPM. Om de stappen aan de lijst met assay-stappen toe te voegen, klikt u eerst op een stap en vervolgens op de wells in ofwel de monsterplaat of de reagensplaat. Voer eerst de instructies voor regeneratie-equilibratie in om de anti-human Fc capture sensoren voor te conditioneren door middel van drie cycli van 15 seconden dompelen in glycine, afgewisseld met 15 seconden dompelen in 1XKB.Voer vervolgens de ladingsinstructies in om de monoklonale antilichaammonsters gedurende 200 seconden te vangen op de anti-humane Fc-capturesensoren. Voer daarna de basislijninstructies in om het bio-layer interferometriesignaal gedurende 60 seconden vast te stellen vóór de associatiestap. Voer de associatiestap in om de sensoren gedurende een associatieperiode van 500 seconden in putjes met variërende concentraties menselijk PCSK9 te dopen.Voer de dissociatiestap uit door de met PCSK9-gebonden sensoren in nieuwe wells met 1XKB te dopen voor een dissociatieperiode van 1.800 seconden. Voer ten slotte, voor de regeneratiestap, de met monoklonaal antilichaam PCSK9-gebonden sensoren in wells met glycine, met twee pulsen van 18 seconden tussen elke bindingscyclus. Ga naar Review Experiments, scroll door de stappen en klik vervolgens op de groene open-knop om het monstercompartiment te openen.Plaats de monsterplaten in het instrument. Navigeer naar Run Experiments, voer een vertragingstijd van 60 seconden in en schud de monsterplaat tijdens het wachten. Stel de plaattemperatuur in op 25 °C, voer de naam van de experimentele run in en druk vervolgens op Go. De live gegevensverzameling wordt hier getoond.Voor kinetische metingen met meerdere cycli in de IBIS-MX96 installeert u de sensorchip in de continuous flow microspotter. Open de CFM2.0-software, klik vervolgens op Load Settings en selecteer 96 Amine Couple. Plaats de twee platen met monsters en reagentia in de CFM-printer.Om de antilichaam-array te maken, klikt u op 'Run' om de printer te starten en de EDC/Sulfo-NHS in de bovenste helft van de reagentenplaat via 48 microkanalen naar de sensor te transporteren en deze gedurende vijf minuten over het sensoroppervlak te laten circuleren. Transporteer de monoklonale antilichaammonsters in de bovenste helft van de bronplaat naar de sensor en laat deze gedurende 10 minuten over de geactiveerde oppervlakken circuleren. Breng vervolgens de immobilisatiebuffer uit een conische buis van 50 milliliter gedurende vijf minuten over het antilichaamoppervlak aan.Plaats de geprinte sensorchip in het instrument. Klik in de besturingssoftware op Bestand, Meting openen, Bestaande meting, en selecteer het methodebestand. Breng de geprinte sensorchip over naar het instrument.Selecteer in het algemene menu G-System Prime onder Full system script. Selecteer vervolgens G-Quench om de monoklonale antilichaamoppervlakken te deactiveren door 150 µL van één molar ethanolamine te injecteren. Selecteer in Analysis Cycle de optie A-AP Standard Run onder IBIS Scripts.Stel 1,0 minuten in voor de basislijn, 10,0 minuten voor associatie en 90 stappen voor dissociatie bij een snelheid van acht microliters per seconde. Injecteer binnen de cycli telkens één concentratie menselijk PCSK9, na vijf bufferinjecties. Regenereer de monoklonale antilichaamoppervlakken met glycine tussen elke bindingscyclus.De geregistreerde bindingssensorgrammen in overlays van fits volgens een één-op-één kinetisch model worden getoond voor de antilichamen die interageren met humaan PCSK9 in vier instrumenten. De bindingsprofielen van de antilichamen bij meerdere dichtheden zijn vergelijkbaar tussen de instrumenten. Hoewel de snelheidsconstanten geassocieerd met elk van de antilichamen varieerden tussen de instrumenten, bleven hun rangordes grotendeels hetzelfde.De reproduceerbaarheid en consistentie van affiniteiten in kinetische snelheden over meerdere antilichaamoppervlakken werd onderzocht. Zoals hier wordt getoond, werd een sterke lineariteit waargenomen voor alle snelheidsconstanten die werden gegenereerd met de Biacore T100 en ProteOn XPR36. De snelheidsconstanten die werden gegenereerd door Octet RED384 waren echter minder lineair vanwege schommelingen in enkele van de dissociatiesnelheden.Dit werd mogelijk veroorzaakt door verdamping van de monsters in de microplaat gedurende de tijd. De snelheidsconstanten die door de IBIS-MX96 werden gegenereerd, waren ook minder lineair vanwege fluctuaties in oppervlakteheterogeniteiten. De antilichaambindingsactiviteiten geassocieerd met de meeste systemen waren consistent, terwijl voor de amine-gekoppelde methode van de IBIS-MX96 een ongeveer tienvoudig lagere activiteit werd waargenomen.Dit was mogelijk te wijten aan antilichaam-inactivatie, of het ontstaan van antilichaam-oriëntaties die niet gunstig waren voor antigeenbinding. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u experimenten opzet in elk van de vier biosensorplatforms, en hoe u de juiste biosensortechnologie selecteert voor uw eigen onderzoeksdoel. Onze directe vergelijkende studie laat zien dat elk biosensorplatform zijn eigen voor- en nadelen heeft.Ondanks bepaalde inherente systematische beperkingen in de instrumentatie waren de directe ordes van zowel de associatie- als dissociatiesnelheidsconstanten sterk gecorreleerd tussen deze instrumenten. Voor het doel van de rangschikking van kandidaten kan elk van deze instrumenten worden gebruikt, uitgaande dat het aantal monsters en de hoeveelheid materialen geen beperkende factoren zijn, omdat ze de antilichamen op vergelijkbare wijze kunnen differentiëren, ongeacht het gebruikte instrument. Er is een afweging tussen betrouwbaarheid van de gegevens en de doorvoersnelheid van de monsters.Biacore T100, gevolgd door ProteOn XPR36R, vertoonde de beste datakwaliteit en consistentie. Daarentegen tonen Octet RED384 en IBIS-MX96 een hoge flexibiliteit en doorvoersnelheid, met compromissen op het gebied van datanauwkeurigheid en consistentie. Voor studies die een gevoelige en betrouwbare detectie vereisen, zijn Biacore T100 of ProteOn XPR36 het meest geschikt.Voor studies waarbij snelheid een kritieke factor is en een groot aantal monsters betrokken is, geniet Octet Red384 of IBIS-MX96 de voorkeur. Instrumenten met een continue vloeistofstroom X leveren hoogwaardige gegevens voor het oplossen van interacties met langzame dissociatiesnelheden. De belangrijkste beperking van het BRI vloeistof ex-a-fray instrument is de verdamping van het monster in de microplaat na verloop van tijd, wat kan leiden tot een opwaartse drift, waardoor de nauwkeurigheid van de gegevens in gevaar komt.

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Ontdek hoe je antilichaam-antigeen bindingskinetiek meet met vier biosensorplatforms voor drug discovery. Deze methode vergelijkt Biacore, ProteOn, Octet en IBIS-MX96 voor betrouwbare therapeutische antilichaamselectie.

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Meer video's verkennen