Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Het doel van deze biosensorstudie is om het vermogen van de vier routinematig gebruikte biosensorplatforms te vergelijken om kwalitatieve kinetiekgegevens te leveren en om inzichten te geven over technische uitdagingen en overwegingen in experimentele ontwerpen voor het evalueren van hoog-affiniteit antilichaam-antigeen interacties. Deze studie beantwoordt sleutelvraagstukken in het gebied van geneesmiddelontdekking voor de selectie van biosensorplatforms en testformaten die de meest betrouwbare resultaten opleveren bij het evalueren van therapeutische antilichaamkandidaten. Het grootste voordeel van deze studie is dat het een directe en uitgebreide vergelijking biedt van de verschillende biosensorplatforms, wat betreft gegevensconsistentie, kwaliteit en operationele efficiëntie.

Videodemonstratie van de vier protocollen is cruciaal, omdat het nieuwe gebruikers met weinig praktische ervaring helpt om experimenten op deze instrumenten op te zetten. Voor kinetische metingen in de Biacore T100, klik op Bestand, Open Nieuwe Methode, en open het methodebestand. Bekijk de parameters in de methode.

In Cyclustypen, stel de contacttijd in op 220 seconden voor opvang 1 over stroomkanaal 2, 110 seconden voor opvang 2 over stroomkanaal 3, en 55 seconden voor opvang 3 over stroomkanaal 4. De stroomsnelheid is 10 microliter per minuut voor alle opvangcycli. Selecteer Steekproef 1 en controleer steekproefoplossing als variabele.

Stel vervolgens de contacttijd in op 600 seconden, en de dissociatietijd op 2.700 seconden over stroomkanaal 1, 2, 3, 4. De stroomsnelheid is ingesteld op 30 microliter per minuut. Selecteer Regeneratie 1, voer glycine HCl pH 1,5 in het oplossingsveld in, en stel de contacttijd in op 20 seconden over stroomkanaal 1, 2, 3, 4.

In Variabele Instellingen, voer tweevoudig titrerende concentraties van 100 nanomolair tot 6,25 nanomolair in voor cyclus 1-3, 50 nanomolair tot 3,12 nanomolair voor cyclus 4-8, en 5 nanomolair tot 0,323 nanomolair voor cyclus 9-10. In Setup Run, kies de detectie stroomkanaal 2-1, 3-1, 4-1, klik vervolgens op volgende. Controleer prime voor run en klik vervolgens opnieuw op volgende.

Selecteer Steekproef en ReagensRak 1 en definieer de locatie voor de reagentia. Pipetteer de reagentia in de afzonderlijke steekproefvialen en plaats de rek in het instrument. Klik op Eject Rak om de deur van het steekproefladecompartiment te openen en plaats vervolgens de steekproefrek in het instrument.

Klik vervolgens op Start en voer een experimentnaam in om op te slaan om de run te starten. Voor de kinetische metingen in de ProteOn XPR36, begin met immobilisatie door Protocollen en vervolgens Steekproeven te selecteren. Definieer EDC/Sulfo-NHS als activator in putjes H1-H6, proteïne A/G als ligand in G1-G6, ethanolamine als deactivator in F1-F6, glycine als regenerator in E1-E6, PBS-T-EDTA als blanco in D1-D6, monoklonaal antilichaam X-steekproef als ligand in C1-C6, en humaan PCSK9 als analyt in putjes B1-B6.

Selecteer Stappen en dubbelklik vervolgens op Immobilisatie in de protocoleditor. De stappen omvatten drie opeenvolgende horizontale injecties van EDC/Sulfo-NHS, proteïne A/G, en één molaire ethanolamine. Elke injectie moet een stroomsnelheid van 30 microliter per minuut en een contacttijd van 300 seconden hebben.

Klik vervolgens op Regenereer. Injecteer drie 18-seconde pulsen van glycine bij 100 microliter per minuut in zowel de horizontale als verticale richting. Volg dit met twee 60-seconde pulsen van PBS-T-EDTA bij 25 microliter per minuut, ook in beide richtingen.

Klik vervolgens op Ligand en injecteer monoklonaal antilichaam 1, monoklonaal antilichaam 2 in de verticale richting, met een stroomsnelheid van 25 microliter per minuut en een contacttijd van 160 seconden. Na op Analyt te hebben geklikt, injecteer vijf concentraties van humaan PCSK9 in een blanco buffer over zes horizontale kanalen gelijktijdig. Gebruik 40 microliter per minuut voor 600 seconden associatietijd, gevolgd door 2.700 seconden dissociatietijd.

Klik vervolgens op Regenereer en injecteer twee 18-seconde pulsen van glycine bij 100 microliter per minuut in zowel de horizontale als verticale richting. Bereid vervolgens de steekproeven en reagentia voor in een 96-welplate volgens de gedefinieerde reagentiaposities. Breng de plaat over naar het instrument en klik vervolgens op het tabblad Run, selecteer het protocol, en klik op Start.

De zes-naald parallelle injectie bij het opnemen van live experimentele gegevens wordt gedemonstreerd. Voor de kinetische metingen in de Octet RED384, stel de experimentele methode in door eerst op Experiment te klikken, gevolgd door Nieuwe Experiment Wizard, Nieuwe Kinetiek Experiment, en vervolgens Basis Kinetiek in de dataverzamelsoftware. Klik vervolgens op Modify Plates en verander 96 Wells naar 384 Wells in zowel Plate 1 als Plate 2.

Definieer de steekproeftypen en posities in de plaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Navigeer naar assaydefinitie om de experimentele opstelling te definiëren. De experimentele opstelling wordt gedefinieerd als een baselinetijd van 30 seconden, een regeneratietijd van 30 seconden, een evenwichtstijd van 18 seconden, een laadtijd van 200 seconden, een associatietijd van 500 seconden, en een dissociatietijd van 1.800 seconden.

De schudsnelheid is ingesteld op 1.000 RPM. Om de stappen toe te voegen aan de assaystappenlijst, klikt u eerst op een stap en klikt vervolgens op de putjes in de steekproef- of reagensplaat. Voer eerst de evenwichtsregeneratie-instructies in om de anti-humaan Fc-opvangsensoren voor te conditioneren door drie cycli van 15-seconde duiken in glycine afwisselend met 15-seconde duiken in 1XKB.

Voer vervolgens de laadinstructies in om de monoklonale antilichaamsteekproeven op de anti-humaan Fc-opvangsensoren gedurende 200 seconden vast te leggen. Voer vervolgens de baseline-instructies in om het bio-laaginterferometri