Name: Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) om eiwit-DNA-interacties in vivo te bestuderen in humane leverkankercellijnen. Deze methode detecteert TGF-β1-geïnduceerde binding van SMAD2 en STAT3 aan genpromotoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (startup funds, BB).

1. Bereiding van oplossingen <ol><li> Bereid de volgende oplossingen voor elk experiment voor. <ol><li> Voor de fixatieoplossing bereiden 37% formaldehyde op en opslaan bij RT. Verdun het in 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1,42%. VOORZICHTIG: Formaldehyde is geclassificeerd als irritant, bijtend, mutageen, teratogeen en kankerverwekkend. Niet innemen. Niet inademen gas / dampen / damp / spray. Bij onvoldoende ventilatie draag geschikte ademhalingsapparatuur. Vermijd contact met de huid en de ogen. Blijf weg van incompatibels, zoals oxidatiemiddelen, reductiemiddelen, zuren, alkaliën en vocht. </li><li> Voor de glycine stop-fix oplossing, berei 0.125 M glycine in 1x PBS oplossing op en berg deze bij RT. </li><li> Voor de celschraapoplossing bereidt u een 1x PBS-oplossing in dH 2O op en sla het op ijs op. Direct voor gebruik, voeg proteïnase inhibitor fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) t toeOa uiteindelijke concentratie van 0,5 mM. VOORZICHTIG: PMSF is geclassificeerd als corrosief en giftig; Draag beschermende kleding en gebruik het in een geventileerde ruimte. </li><li> Direct vóór gebruik van de cellysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl en 0,5% NP40), 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoethyl) benzeensulfonylfluoride hydrochloride (AEBSF), 80 μM aprotinine, 4 mM bestatine, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptine en 1,5 mM pepstatine A) en 0,5 mM PMSF. </li><li> Direct vóór gebruik van de nucleaire lysisbuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 1% SDS), 1X PIC en 0,5 mM PMSF toevoegen. </li></ol></li></ol> 2. Cell Fixatie en Scheren <ol><li> Groei de cellen tot 70-80% samenvloeiing op 10 cm weefselkweekplaten. Stimuleer de cellen per experimentele doelstelling. </li><li> Verwijder het weefselkweekmedium, voeg 5 ml fixatieoplossing toe en incubeerDe cellen gedurende 10 minuten bij RT op een schudderplatform. </li><li> Verwijder de fixatieoplossing en doe de cellen tweemaal met 10 ml ijskoude 1x PBS. </li><li> Verwijder de 1x PBS, voeg 5 ml glycine stop-fix oplossing toe en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij RT op een schuddenplatform. </li><li> Verwijder de glycine stop-fix oplossing en doe de cellen tweemaal met 10 ml ijskoude 1x PBS. </li><li> Verwijder de 1x PBS, voeg 2 ml celschraapoplossing toe, en oog de cellen met een celschraper. Breng de geoogste cellen over naar een kegelbuis op ijs. </li><li> Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 600 xg en 4 ° C. </li><li> Verwijder de supernatant, resusteer de pellet in 1 ml 1X cellysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Als alternatief snapvries de pellet in vloeibare stikstof en berg deze bij -80 ° C. </li><li> Zodra de pellet is geresuspendeerd in de cellysisbuffer, overdragen de cel suspensie naar een ijskoude dot-homogenisator en druppel voor 10 strepen door gebruik te maken van een type B-stamperE voor celverstoring. </li><li> Breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 2.400 xg en 4 ° C. </li><li> Gooi de supernatant weg, verwijder de pellet in 350 μl nucleaire digestiebuffer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg micrococcal nuclease (1 U / μL) toe en meng door vortexing. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 5-20 minuten; Meng de monsters elke 2 minuten door inversie. OPMERKING: De tijd- en enzymconcentratie verschilt tussen cellijnen en kan optimalisatie vereisen bij suboptimale enzymatische afscheiding. </li><li> Alternatief, het bereiken van chromatinafscheiding door sonicatie onder gebruikmaking van commercieel verkrijgbare sonicatoren. OPMERKING: Sonication voorwaarden vereisen optimalisatie. Een voorbeeld van het optimalisatievoorbeeld wordt hieronder gegeven met behulp van een monstervolume van 300 μl en een monsterverwerkingskracht van 25%. <ol><li> Na stap 2.10, verwijder de supernatant en resuspendeer de nUclear-pellet in 1,0 mL commerciële schuifbuffer. </li><li> Aliquot 300 μL van de geresuspendeerde nucleaire pellet in drie 1,7 ml microcentrifuge buizen. Plaats ze op ijs. </li><li> Scheid de 3 aliquots van vaste chromatine bij 25% vermogen met 3 verschillende condities om de optimale sonicatieomstandigheden te bepalen: 5 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls. 10 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls. 20 pulsen van 20 s elk, met een 30 s rust op ijs tussen elke puls. </li><li> Ga verder met stap 2.15, zoals hieronder uiteengezet. </li></ol></li><li> Na de incubatie met de micrococculaire nuclease, voeg 7 μL ijskoud 0,5 M EDTA toe om de reactie te stoppen. </li><li> Centrifugeer de monsters met het gesneden DNA gedurende 10 minuten bij 16.200 xg en 4 ° C. </li><li> Breng het gesneden DNA-bevattende supernatant over naar een frisse microcentrifugebuis. Aliquot 50 μL in een aparte microcentrifugebuis om de su te bevestigenCcessful shearing van het DNA (sectie 3). Gebruik het resterende volume onmiddellijk voor immunoprecipitatie (sectie 4) of bewaar het bij -80 ° C. </li></ol> 3. Bevestiging van de scherpe efficiëntie <ol><li> Voeg 150 μL nuclease-vrij dH20 en 10 μl 5 M NaCl toe aan de 50 μl aliquot van het gesneden chromatin uit stap 2.16. </li><li> Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 4 uur om de crosslinks om te keren. </li><li> Voeg 2 μL RNase A (10 μg / μl) toe en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 10 μl eiwitase K (0,5 μg / μl) toe en incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 90 minuten. </li><li> Voor zuivering van het DNA, voer een fenol / chloroform extractie 12 uit . <ol><li> Voeg nuclease-vrij water toe aan een eindvolume van 200 μl. Voeg 200 μl fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) toe aan het monster en de werveling gedurende 20 s. </li><li> Centrifuge bij kamertemperatuurPeratuur gedurende 5 minuten bij 16.000 x g. Verwijder de bovenste waterfase zorgvuldig en breng het over naar een frisse buis. Zorg ervoor dat u geen fenol tijdens de pipettering doorbrengt. </li><li> Voeg 0,1 volumes 3 M natriumacetaat (NH 4 OAc), pH 5,2 toe, en meng door de tube meerdere malen met een vinger te vlokken. Voeg 2,5 volumes ijskoud 100% ethanol toe en meng door vortexing gedurende 5 s. Incubeer het monster O / N bij -20 ° C of gedurende ten minste 1 uur bij -80 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster gedurende 30 min bij 4 ° C en 16.000 xg om het cDNA te pelletiseren. </li><li> Verwijder de supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Voeg 1 ml RT, 70% ethanol en keer de tube meerdere keren in. </li><li> Centrifugeer het monster gedurende 2 minuten bij 4 ° C en 16.000 x g. Verwijder de supernatant zorgvuldig. </li><li> Droog de pellet gedurende 5-10 minuten bij RT. Resuspendeer de pellet in 30 μl dH2O. </li></ol></li><li> Gebruik een 5 en 10 μl aliquot van het gezuiverde DNA voor gelelektroforese met een 1% TAEAgarosegel. OPMERKING: Succesvolle chromatinafscheiding resulteert in een DNA-patroon van 200-1.500 bp. Als de afscheiding niet succesvol is, bepaal de optimale afschuifcondities voor de specifieke cellen door de incubatietijd van de afschuifstap (stap 2.12) tot 5, 10 en 15 minuten te wijzigen. </li><li> Gebruik het resterende monster om de DNA-concentratie van het monster te analyseren. Reverse-bereken de DNA-concentratie in het gesneden chromatinemonster (stap 2.16); Gebruik dezelfde DNA-hoeveelheden voor elke behandelingsgroep voor de immunoprecipitatie (sectie 4). </li></ol> 4. Immunoprecipitatie <ol><li> Combineer 10-25 μg van de afgeschuinde, verknoopte chromatine (stap 2.16) met 25 μl ChIP-grade eiwit G magnetische kralen, 10 μl immunoprecipitatieverdunningsbuffer (voorraadoplossing: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA en 167 mM NaCl) en 1 μl PIC. </li><li> Na 4 uur incubatie, voeg 1-10 μg antilichaam toe (het antilichaam concentrAtion zal variëren op basis van de affiniteit van het antilichaam; Het moet aanvankelijk per fabrikantaanbevelingen gebruikt worden en eventueel experimenteel geoptimaliseerd worden) naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg dH 2O toe aan een eindvolume van 100 μl. OPMERKING: In plaats van de hierboven beschreven directe immunoprecipitatiewerkwijze kan de indirecte immunoprecipiatiemethode worden gebruikt door eerst het chromatine te combineren met de antilichamen en vervolgens het toevoegen van eiwit G magnetische kralen. </li><li> Incubeer de monsters op een end-to-end rotator gedurende 4-12 uur bij 4 ° C. </li></ol> 5. Elutie <ol><li> Plaats de buizen op een magnetische stand. Zodra de magnetische kralen aggregaat aan de zijkant van de buis hebben, verwijder het supernatant zorgvuldig en verwijder deze. </li><li> Was de kralen driemaal met 800 μl wasbuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCI, pH 8 en 150 mM NaCl); Meng door de buis meerdere keren in te wenden. Plaats de buis op de magnetische stand aEn verwijder de wasbuffer voorzichtig en verwijder deze zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis samenvoegen. </li><li> Was de kralen eenmaal met 800 μL wasbuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HC1 pH 8 en 500 mM NaCl); Meng door de buis meerdere keren in te wenden. Plaats de buis op de magnetische stand en verwijder de wasbuffer voorzichtig en verwijder deze zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis aggregeren. </li><li> Resuspendeer de kralen in 50 μl elutiebuffer (1% SDS en 100 mM NaHC03) en incubeer de monsters op een eind-tot-eind rotator gedurende 15 min bij RT. </li><li> Plaats de buizen op een magnetische stand, en zodra de magnetische kralen aan de zijkant van de buis verzamelen, overstappen de supernatant naar een frisse buis. </li><li> Voeg 6 μl 5 M NaCl toe, om de verknoping te reverseren en 2 μl eiwitase K (0,5 μg / μl). Na het mengen van de monsters, incuberen de monsters gedurende 2 uur bij 65 ° C. </li><li> Voor zuivering van het DNA, voer een phe uitNol / chloroform extractie 12 (stap 3.5) en vervolgens de pellet opnieuw suspenderen in 30 μl dH20. OPMERKING: De monsters kunnen direct worden geanalyseerd voor eiwitbindingsplaatsen (sectie 5) of kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol> 6. Binding-site analyse <ol><li> Doe een analyse voor specifieke bindingsplaatsen binnen een bekende nucleïnezuursequentie met behulp van PCR of qRT-PCR. Voor primerontwerp, volg conventionele PCR- of qRT-PCR-protocollen. Ontwerp de primers om een ​​150-400 bp amplicon te synthetiseren dat de eiwitbindingsplaats van belang brengt ( Figuur 1 ). </li><li> Stel de PCR op met behulp van vier verschillende DNA-templates om de specificiteit te verzekeren: i) DNA uit ChIP, die immunoprecipitief is met het antilichaam van belang, ii) DNA uit ChIP immunoprecipitueert met een niet-specifiek IgG-antilichaam, iii) DNA invoeren, en iv) H20 als een Negatieve controle voor de PCR om verontreiniging uit te sluiten. In het geval van stimulatie van de weg, Kies een vijfde sjabloon met behulp van een andere set primers die specifiek zijn voor een bekende bindingsplaats van het immunoprecipitatieproteïne. OPMERKING: In het geval van de c-KIT ligand promotor analyse, gebruik conventionele PCR om TGF-p geïnduceerde SMAD binding aan de SBE in het c-KIT ligand promotor gebied te demonstreren. Als een positieve controle, voer PCR uit op plasminogeen activator-inhibitor-1 (PAI-1) als een bekend doel van TGF-ß-geïnduceerde SMAD binding. </li></ol>

<ol><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687986300119">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC366919/">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li>
<li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22GenesDev%22%5BJournal%5D)">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li>
<li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+TGF-beta%2Fc-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol%3Achloroform%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA%3A+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li>
<li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+%28signal+transducers+and+activators+of+transcription%29+DNA+binding+and+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202303000902">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li>
<li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754(2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit rapport tonen we de TGF-β1-geïnduceerde binding van SMAD2 aan een SBE binnen de c-KIT ligand promotor en TGF-β1 geïnduceerde binding van STAT3 aan zijn herkenningssequentie binnen het TGF-β1 ligand gen. Wij demonstreren cytokine geïnduceerde binding van beide transcriptiefactoren met behulp van chromatine immunoprecipitatie. Chromatine immunoprecipitatie is een krachtig instrument om de directe binding van een eiwit dat van belang is voor DNA aan te tonen, om de stimuli die eiwitbindi...

In de kern van eukaryoten interageert DNA met histonproteïnen en nonhistone eiwitten en wordt gecondenseerd in chromatine. In de fysiologische, pathofysiologische en celbiologische context worden cellulaire functies ruimtelijk en tijdelijk gecontroleerd door chromatine gecoördineerde genexpressie. DNA-eiwitinteracties hebben een essentiële rol in de regulering van cellulaire processen, zoals DNA replicatie, recombinatie en reparatie, evenals eiwituitdrukking. Daarom is de analyse van DNA-eiwitinteracties een onontbeerlijk hulpmiddel bij de evaluatie van genuitdrukking en celfunctie. Er bestaan ​​verschillende technieken om DNA-eiwitinteracties in vitro te beoordelen , zoals de Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) en DNase I footprinting 1 , 2 . Deze technieken analyseren echter niet de eiwit-DNA-interactie binnen de chromatin- en cellulaire context. ChIP iEen techniek die eiwitten vastlegt die gebonden zijn aan hun specifieke DNA-bindingsplaatsen en daarmee het identificeren van DNA-eiwitinteracties binnen de chromatincontext vergemakkelijkt. De techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door Gimour en Lis voor de beoordeling van RNA polymerase II binding aan specifieke genen in Escherichia coli en Drosophila melanogaster 3 , 4 . Het wordt gedaan door fixatie van de DNA-eiwit complexen, gevolgd door het uitvoeren van chromatine extractie en het scheren van het DNA in ~ 200 basis paar (bp) fragmenten. Vervolgens wordt het door DNA gebonden eiwit van belang geïsoleerd door immunoprecipitatie. Na de omkering van de DNA-eiwit verknoping wordt het DNA gezuiverd en geanalyseerd. Verscheidene methoden kunnen gebruikt worden voor de analyse van de eiwitbindingsplaatsen en zijn afhankelijk van de nucleïnezuursequentie van de eiwitbindingsplaats binnen het doelgen 5 . In gevallen waar de DNA-sequentie bekend is, wordt standaard PolYmerase Chain Reactions (PCR) kunnen worden toegepast met behulp van specifieke primerparen die de bekende bindingsplaats flankeren. Kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR) kan ook gebruikt worden 6 . In gevallen waarin de sequentie onbekend is, kan ChIP gecombineerd worden met DNA-microarrays (ChIP-on-chip), DNA-sequencing (ChIP-seq) of kloneringstechnieken 7 , 8 , 9 . De TGF-β-weg heeft krachtige tumoronderdrukkende functies en is een belangrijke weg in celdifferentiatie. Het wordt geactiveerd door de binding van het TGF-B1-ligand aan het gecognateerde receptorcomplex, wat resulteert in de serinefosforylering van SMAD2 / 3-transcriptiefactoren. Na hun associatie met de gemeenschappelijke mediator, SMAD4, verplaatst het SMAD-complex naar de kern en bindt het aan de SBE binnen het promotorgebied van de doelgenen, waarbij het degenen regelt die de celcyclus, apoptose en celdifferentiatie regelenop. De transcriptie-respons op TGF-β-stimulatie is celtype- en contextspecifiek 10 . Onlangs hebben we een positieve terugkoppeling beschreven tussen TGF-β en de c-KIT pathway 11 . In dit model bindt TGF-β1-geactiveerde SMAD2 aan de c-KIT ligand promotor en induceert zijn expressie en afscheiding. Vervolgens activeert het c-KIT ligand de c-KIT receptor op een auto- en para-crinische wijze. C-KIT receptor activatie resulteert in STAT3 Tyr 705- fosforylering via JAK1 / 2. Na aanleiding van STAT3-activering en nucleaire translocatie bindt STAT3 aan het TGF-β1 ligand gen en regelt de expressie daarvan. Hier tonen we de essentiële rol van ChIP analyse voor de identificatie van SMAD2 binding aan de c-KIT receptor ligand promotor en voor de identificatie van de transcriptie 3 van de Signal Transducer (en) Activator (STAT3 binding aan de TGF-β1- gen).

<table><tbody><tr><td>HepG2 cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta;1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>101-B1</td><td>Gebruikt in een concentratie van 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antilichaam</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>5339</td><td>Gebruikte hoeveelheid/IP: 3 &micro;g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 antilichaam</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4904</td><td>Gebruikte hoeveelheid/IP: 3 &micro;g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Proteïne G Magnetische Kralen</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR voorwaartse primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&rsquo;</td></tr><tr><td>PCR achterwaartse primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&rsquo;</td></tr><tr><td>PCR voorwaartse primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR achterwaartse primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&rsquo;</td></tr><tr><td>PCR voorwaartse primer: TGF-&beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR achterwaartse primer: TGF-&beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR voorwaartse primer: TGF-&beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&rsquo;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR achterwaartse primer: TGF-&beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Volgorde: 5&rsquo;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&rsquo;&nbsp;&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analyse van de c-kit ligand promoter gebruik van chromatine immunoprecipitatie

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Meerdere cellulaire processen, inclusief DNA replicatie en reparatie, DNA recombinatie en gen expressie, vereisen interacties tussen eiwitten en DNA. Daarom regelen DNA-eiwitinteracties veelvoudige fysiologische, pathofysiologische en biologische functies, zoals celdifferentiatie, celproliferatie, celcycluscontrole, chromosoomstabiliteit, epigenetische genregulatie en celtransformatie. In eukaryote cellen interactieert het DNA met histon- en nonhistone-eiwitten en wordt gecondenseerd in chromatine. Verschillende technische hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om DNA-eiwit interacties te analyseren, zoals de elektroaforesis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) en DNase I footprinting. Deze technieken analyseren echter de eiwit-DNA-interactie in vitro , niet binnen de cellulaire context. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een techniek die eiwitten opneemt op hun specifieke DNA-bindingsplaatsen, waardoor de identificatie van DNA-eiwit interactie mogelijk wordtS binnen hun chromatin context. Het wordt gedaan door fixatie van de DNA-eiwit interactie, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Vervolgens werd de genomische plaats waaraan het eiwit werd gebonden, gekenmerkt. Hier beschrijven en bespreken we ChIP en analyseren we de analytische waarde voor de identificatie van de transformerende groeifactor-β (TGF-β) geïnduceerde binding van de transcriptiefactor SMAD2 tot SMAD Binding Elements (SBE) binnen het promotorgebied van de tyrosine- Proteïne kinase Kit (c-KIT) receptorligand stamcelfactor (SCF).

De binding van het TGF-B1-ligand aan het gecognateerde receptorcomplex resulteert in de serinefosforylering van SMAD2 / 3 transcriptiefactoren, gevolgd door hun associatie met de gemeenschappelijke mediator, SMAD4. Het SMAD-complex translocates naar de kern. TGF-β kan gentranscriptie regelen, hetzij direct via SMAD-binding aan SBE&#39;s binnen regulatorische gebieden van de doelgenen, of indirect door middel van de SMAD-gereguleerde expressie van transcriptieve activators of repressoren ...

DNA-eiwit interacties zijn essentieel voor meerdere biologische processen. Tijdens de evaluatie van cellulaire functies is de analyse van DNA-eiwitinteracties onontbeerlijk voor het begrijpen van genregulering. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtig instrument om dergelijke interacties in vivo te analyseren .

Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Het algemene doel van deze chromatine-immunoprecipitatieprocedure is om de door TGF bèta 1 geïnduceerde binding van de transcriptiefactor SMAD2 aan SMAD-bindingsplaatsen in de C-kit-promotor te evalueren. Deze methode kan antwoord geven op kernvragen in het veld van de celbiologie, zoals cytokinen-geïnduceerde gentranscriptie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de potentie heeft om de directe binding van transcriptiefactoren en andere transcriptie-regulerende eiwitten aan hun DNA-bindingsplaatsen in vivo aan te tonen.Kweek de cellen tot een confluentie van tussen de 70 en 80% op weefselkweekplaten van tien centimeter. Stimuleer de cellen volgens de experimentele doelstellingen. Verwijder het weefselkweekmedium en voeg vijf milliliter fixeeroplossing toe.Incubeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform. Verwijder de fixatieoplossing en was de cellen tweemaal met 10 milliliters ijskoud 1X PBS. Verwijder de 1X PBS en voeg vijf milliliters glycine stop-fixatieoplossing toe.Na het incuberen van de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform, wordt de glycine stop-fixeeroplossing verwijderd en wo

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

DNA regelgevende elementen, zoals versterkers, kwaliteitsbeheersing genexpressie door fysiek contact met target gene initiatiefnemers, vaak door middel van lange-afstands chromosomale interacties verspreid over grote genomic afstanden. Promotor vangen Hi-C (PCHi-C) identificeert belangrijke interacties tussen initiatiefnemers en distale regio's, waardoor de toewijzing van potentiële regulerende sequenties aan hun doelgenen.

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) om eiwit-DNA-interacties in vivo te bestuderen in humane leverkankercellijnen. Deze methode detecteert TGF-β1-geïnduceerde binding van SMAD2 en STAT3 aan genpromotoren.

Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Meer video's verkennen