Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Het algemene doel van deze chromatine immunoprecipitatieprocedure is om de door TGF beta 1 geïnduceerde binding van het transcriptiefactor SMAD2 aan SMAD binding elementen in de C kit promotor te evalueren. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van cellulaire biologie beantwoorden, zoals door cytokinen geïnduceerde gentranscriptie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de potentie heeft om directe binding van transcriptiefactoren en andere transcriptieregulerende eiwitten aan hun DNA-bindingsplaatsen in vivo aan te tonen.

Laat de cellen groeien tot tussen de 70 en 80% confluentie op tien centimeter weefselkweekplaten. Stimuleer de cellen volgens de experimentele doelstellingen. Verwijder het weefselkweekmedium en voeg vijf milliliter fixeeroplossing toe.

Bewaar vervolgens de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schuddende platform. Verwijder de fixeeroplossing en was de cellen twee keer met 10 milliliter ijskoud één X PBS. Verwijder de één X PBS en voeg vijf milliliter glycine stop fix oplossing toe.

Na het incuberen van de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een schuddende platform, verwijder de glycine stop fix oplossing en was de cellen twee keer met 10 milliliter ijskoud één X PBS. Na het verwijderen van de PBS, voeg twee milliliter celkraatoplossing toe en verzamel de cellen met behulp van een celschraper. Breng vervolgens de verzamelde cellen over naar een kegelvormige buis op ijs.

Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 600 keer G, en vier graden Celsius. Verwijder het supernatant, suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter van één X cel lysis buffer, en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Zodra het pellet opnieuw is gesuspendeerd in de cel lysis buffer, breng de celsuspensie over naar een ijskoud Dounce homogenisator, en Dounce gedurende 10 slagen met behulp van een type B stamper voor celdisruptie.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis, en centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 2.400 keer G en vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet opnieuw in 350 microliter van nucleaire spijsverteringsbuffer. Na het incuberen van de monsters gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius, voeg micrococcinale nuclease toe en meng door middel van vortexen.

Incubeer de monsters gedurende vijf tot 20 minuten bij 37 graden Celsius, waarbij de monsters elke twee minuten worden gemengd door inversie. De tijd in sommige concentratie, als u tussen cellijnen zit, kan het mogelijk zijn om optimalisatie te vereisen in geval van suboptimale enzymatische schaaf. Een alternatieve schaafprocedure met behulp van commercieel verkrijgbare sonicare kan worden gevonden in het tekstprotocol.

Na de incubatie met de micrococcinale nuclease, voeg zeven microliter van ijskoud 0,5 molair EDTA toe om de reactie te stoppen. Centrifugeer de monsters met het geschaafde DNA gedurende 10 minuten bij 16.200 keer G en vier graden Celsius. Breng het geschaafde DNA bevattende supernatant over naar een verse microcentrifugebuis.

Breng 50 microliter in een aparte microcentrifugebuis aan om de succesvolle schaaf van het DNA te bevestigen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik het resterende volume onmiddellijk voor immunoprecipitatie of bewaar het op min 80 graden Celsius. Combineer 10 tot 25 microgram van het geschaafde gekruiste chromatine met 25 microliter van chromatine immunoprecipitatie graad proteïne G magnetische kralen.

Voeg vervolgens 10 microliter van immunoprecipitatie verdunningsbuffer en één microliter van proteaseremmercocktail toe. Na vier uur incubatie, voeg één tot 10 microgram antilichaam toe aan een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. En voeg gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 100 microliters.

Incubeer de monsters op een eind-tot-eind roterende shaker gedurende vier tot 12 uur bij vier graden Celsius. Na incubatie, plaats de buizen op een magnetische standaard. Zodra de magnetische kralen zich aan de zijkant van de buis verzamelen, verwijder en gooi voorzichtig het supernatant weg.

Was de kralen drie keer met 800 microliter van wasbuffer één. Voor elke wassing, meng de kralen door de buis meerdere keren te keren. Breng vervolgens de buis op de magnetische standaard en verwijder voorzichtig de wasbuffer zodra de magnetische kralen zich aan de zijkant van de buis verzamelen.

Was vervolgens de kralen een keer met 800 microliter van wasbuffer twee volgens dezelfde procedure. Na het wassen, suspendeer de kralen opnieuw in 50 microliter van elutiebuffer en incubeer de monsters op een eind-tot-eind roterende shaker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens het supernatant over naar een verse buis met behulp van de magnetische standaard.

Voeg zes microliter van vijf molair natriumchloride toe om de kruisingsomkering om te keren gevolgd door twee microliter van proteïnase K. Na het mengen van de monsters, incubeer ze gedurende twee uur bij 65 graden Celsius. Op dit punt kunnen de monsters direct worden geanalyseerd op eiwitbindingsplaatsen zoals beschreven in het tekstprotocol, of ze kunnen worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Om de door TGF beta 1 geïnduceerde binding van SMAD2 aan de SCF promotor te bevestigen, werd de chromatine immunoprecipitatietest uitgevoerd.

De TGF beta 1 behandeling resulteerde in SMAD2 binding aan de SCF promotor in menselijke leverkankerlijnen, HepG2 en Hep3B. In afwezigheid van TGF beta 1 stimulatie, werd geen SMAD binding opgemerkt. Als positieve controle, voor TGF beta 1-geïnduceerde SMAD activering, werd chromatine immunoprecipitatie voor PAI-1 uitgevoerd.

De PAI-1 promotor is een bekend doelwit van TGF beta en SMAD. Specificiteit van de SMAD2 immunoprecipitatie werd bevestigd door het gebruik van onspecifieke IgG antilichamen. Er werd geen SMAD2 binding aan de SBE opgemerkt na immunoprecipitatie met IgG.

Om de door TGF Beta 1 geïnduceerde binding van STAT3 aan het TGF beta ligand gen te bevestigen, werden chromatine immunoprecipitatie tests uitgevoerd met behulp van TGF beta 1 behandelde HepG2 en Hep3B cellen. De TGF beta 1 behandeling resulteerde in STAT3 binding aan de tweede putatieve STAT3 bindings