Een methode om het effect van milieueisen op paring gedrag in te testen Drosophila melanogaster

Het algemene doel van deze gedragstest is om het effect van omgevingssignalen op reproductiegedrag, zoals balts en paring, te kwantificeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van gedragsbiologie en eurogenetica te beantwoorden. Zoals de afleiding van genetische en omgevingsfactoren op reproductiegedrag en de mechanismen die dat gedrag modereren.

Deze techniek biedt snelheid en flexibiliteit bij het testen van een breed scala aan omgevingssignalen die reproductie beïnvloeden. En dat met een zeer goed aantal replica's. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jenke Gorter, een afgestudeerde student uit mijn lab.

Begin het experiment door een liter rijk vliegmedium te bereiden. Giet een liter leidingwater in een tweedeliter glazen beker met magnetische roerbar. En zet de beker op een magnetische hotplate.

Houd het roeren uit en verhoog de temperatuur tot 300 graden Celsius, totdat de kooktemperatuur is bereikt. Zet het roeren aan op 500 tpm en voeg de ingrediënten toe aan het kokende water. Wacht tot de gist krachtig schuimt.

Verlaag vervolgens de temperatuur van de hotplate tot 120 graden Celsius. Na 10 minuten zet de hotplate naar 30 graden Celsius. En laat het mengsel roeren tot het afkoelt tot 48 graden Celsius.

Bewaak de temperatuur door een thermometer direct in het voedsel te steken. Los twee gram Tegosept op in 10 milliliter 96% ethanol. Combineer het mengsel en vijf milliliter van één molaire propionzuur in de beker.

Roer gedurende drie minuten. Verhit een naald tot roodgloeiend in een Bunsen-brander. En prik een gat van 0,3 centimeter in diameter aan de bovenkant van een plastic petrischaal van 3,5 centimeter bij 1,0 centimeter.

Bij het bereiden van voedselmedium, met geurige verbindingen, pipet eerst 30 microliter van de gewenste verbinding in het schaaltje voor de helft van de experimentele schotels. Laat de andere helft van de schotels leeg voor vergelijking. Gebruik een vijf milliliter serologische pipet om drie milliliter voedselmedium te gieten, dat de bodem van de schaal bedekt.

Dek het af met een kaasdoek om besmetting te voorkomen en laat het medium een uur op kamertemperatuur stollen. Plaats vervolgens een deksel op de schotels en plak de deksels op twee zijden dicht. Bereid kleine paraffinefoliepluggen om de gaten van de schotels te bedekken door stukjes paraffinefolie op te rollen tot rolletjes van 0,2 centimeter dik.

En snijd ze vervolgens in segmenten van 0,5 centimeter. Snijd twee kleine gaten in het septum om strak te passen op haken, doorvoeren. Pas open vier en een halve centimeter flesdoppen met een siliconen septum van 0,32 centimeter dik aan.

Bevestig de kleine PVC-buis aan beide uitlaten die het flesje verlaten en aan slechts een van de inlaten die het flesje binnenkomen. Bevestig vervolgens een glazen buis aan de uitlaat van elke YPD-kweekfles, met behulp van kleine buisjes. Vul de buis met glasvezel.

En autoclaveer het voor gebruik. Wikkel de aangepaste doppen en buisjes in aluminiumfolie. En autoclaveer ze 25 minuten bij 120 graden Celsius en een bar druk.

Dompel een steriele 100 microliter pipettip in een van de gistkolonies van de YPD-agarplaat en laat deze vallen in de geautoclaveerde YPD-vloeibare mediumfles. Sluit deze gist en geïnoculeerde YPD-vloeibare mediumfles, evenals een YPD-mediumcontrolevles, zonder gist, met geautoclaveerde doppen, gemonteerd in een uitlaat. Om besmetting van het YPD-medium met micro-organismen te voorkomen, bevestig de kleine buis aan een steriele spuitfilter van 0,45 micrometer, met een plastic push op de bulkhoofdknoopconnector, richting het filter.

En een schroefbare kunststof bulkhoofdknoopconnector die het filter verlaat. Bevestig vervolgens de buis aan de inlaat van de YPD-kweekfles. Plaats de flessen op afzonderlijke magnetische platen.

En roer de oplossing 24 uur lang bij 100 tpm op kamertemperatuur voor het begin van het experiment. Verbind de inlaten van beide flessen met een buis die is aangesloten op geperste lucht. Zorg ervoor dat de uitlaat van de experimentele gistfles is aangesloten op een buis die de gistopgeur uit de experimentele ruimte laat ontsnappen, om interferentie met het experiment te voorkomen.

Bevestig PVC-buisjes aan de uitlaatzijde van de glazen buis en leid deze naar de onderste gaten van de experimentele kast. Gebruik een T-splitter, met een buitendiameter van minimaal 0,5 centimeter, en korte stukjes klein PVC-buis, bevestig twee serologische pipetten aan elk van de twee uitlaten aan beide zijden. Plak de pipetten plat op het witte papierblad onder de camera's, in de stalen kast.

Gebruik een mondpipet om één experimenteel vrouwtje om ZT zes in een kleine petrischaal te plaatsen. En laat de vlieg zich een uur lang aanpassen aan de paringsarena. Na een uur, om ZT zeven, zet een wild type mannetje over naar de petrischaal.

En klik op Start Monitoren voor 24 uur. Voor het luchtpompexperiment, plaats de schaal zo dat een pipetuitlaat is verbonden met de entree van de paringsarena. Om het paringsgedrag van het paar te analyseren, selecteert u een open alle foto's, in een beeldbewerkingssoftware.

En blader er in chronologische volgorde doorheen. Schrijf de datum, experimentnummer, schotelnummer en starttijd in een spreadsheet in dezelfde rij. Neem de starttijd van elke arena vanaf het moment dat deze onder de webcam wordt geplaatst.

Noteer de tijdstempel van de foto's. Markeer de starttijd van elke paring in dezelfde rij in de spread sheet. Tel een paring als een incident, wanneer het mannetje het vrouwtje heeft gemonteerd en het paar matig stationair blijft en in dezelfde houding, gedurende ten minste vijf opeenvolgende frames.

Analyse van gistlucht, gescheiden voor voedselmedium, laat zien dat een paringspaar niet reageert op gistgeur wanneer er geen gist in het voedselmedium aanwezig is. Maar ze verhogen wel hun paringsfrequentie in gistluch