Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode
22 juni 2017
Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.
Het algemene doel van deze methodologie is om hersenweefsel goed te Golgi-kleuren om de dendritische morfologie en complexiteit te onderzoeken en te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen. Aangezien Golgi-kleuring slechts een kleine subset van cellen kleurt, zou deze techniek kunnen worden gebruikt om de structuur van neuronen te traceren.
Het grote voordeel van deze techniek is dat hersensecties gemakkelijk kunnen worden gekleurd zonder dat ze tijdens een van de wasstappen uitdrogen of eraf vallen. Fred Kiffer, Tyler Alexander en Julie Anderson, afgestudeerde studenten in het laboratorium van Dr. Allen, zullen de procedure demonstreren. Begin door vers geoogste, niet-gefixeerde knaagdierhalve hersenen onder te dompelen in vijf milliliter kwikchloride-oplossing.
Aangezien kwikchloride-oplossing lichtgevoelig is, bedek de buis met folie. Bewaar de monsters in het donker op kamertemperatuur. De volgende dag giet je de oplossing langzaam in een tijdelijke container voordat je het op de juiste manier weggooit in een biogevaar container.
Voeg vijf milliliter verse kwikchloride-oplossing toe en zorg ervoor dat de hersenen ondergedompeld zijn. Plaats de monsters weer in het donker op kamertemperatuur gedurende 13 dagen. Na 14 dagen bereid je de post-impregnatie buffer voor door 30 gram poedervormige post-impregnatie buffer toe te voegen aan 90 milliliter gedestilleerd of gedeïoniseerd water, DH2O.
Vul elke put van de zes-puttenplaat met 6,5 milliliter van de post-impregnatie buffer, één put per hersenen. Verwijder vervolgens de kwikchloride-oplossing van het hersenweefsel zoals eerder. Spoel het weefsel met DH2O, en breng het weefsel vervolgens over naar de zes-puttenplaten met post-impregnatie buffer.
Bedek de platen met folie en bewaar ze op kamertemperatuur in het donker. De volgende dag zuigt u de post-impregnatie buffer af en vervangt u deze. Bedek de plaat opnieuw en bewaar in een koelkast van vier graden Celsius.
Bereid twee of drie 12-puttenplaten per hersenen voor door de platen op hun deksel eerst te labelen met nummers in oplopende volgorde van links naar rechts en van boven naar beneden. Voeg het identificatienummer van de hersensectie toe. Pipet twee milliliter 1X PBS in elke put van elke plaat, stel vervolgens de trap op en zet de vibratoom aan.
Plak vervolgens tape op het weefselblok van de monsterhouder en breng een beetje cyanoacrylaatlijm op aan. Verwijder een hersenen van de zes-puttenplaat en plaats deze op een plastic of glazen schaal. Gebruik een roestvrijstalen dubbelzijdige kling om het cerebellum caudal af te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat het gedeelte van het cerebellum dat op de hersenen overblijft, vlak is.
Plaats vervolgens het platte oppervlak van het resterende cerebellum op de lijm. Nadat de lijm droog is, plaats u de monsterhouder met het weefsel in het monstersbad. Plaats het monstersbad op de vibratoom en bedek het weefselmonster in PBS.
Bevestig vervolgens het mes aan de meshouder van de vibratoom en laat het mes langzaam zakken in het monstersbad tot het volledig ondergedompeld is en iets onder het bovenste deel van het weefsel. Stel vervolgens de vibratoom snelheid in op zeven, de amplitude op zes en de snijwhoek op 12 graden. Start de trilling en snijd secties van 200 micron.
Gebruik een grote verfkwast om de weefselsecties van het monstersbad naar elke aangewezen put van de 12-puttenplaten te verplaatsen. Blijf het weefsel snijden totdat het gewenste aantal weefselsecties is bereikt. Na het snijden gebruikt u een transferpipet om het PBS uit de putten van de 12-puttenplaat te zuigen, en voegt u vervolgens twee milliliter PBS-T toe en wast u gedurende 30 minuten met roeren.
Tegen het einde van de wasperiode verdunt u drie delen ammoniumhydroxide-oplossing met vijf delen DH2O. Vervolgens, na het verwijderen van de PBS-T, voegt u de verdunde ammoniumhydroxide-oplossing toe. Bescherm tegen licht met folie en kleur de secties gedurende 19 tot 21 minuten.
Vervolgens, na het veilig verwijderen van de ammoniumhydroxide-oplossing, voegt u post-kleuring buffer toe. Bescherm met folie en kleur nog eens 19 tot 21 minuten. Spoel de secties vervolgens driemaal drie keer gedurende vijf tot tien minuten in PBS-T.
Monteer de secties op met 1%gelatine gecoate dia's met de grote verfkwast. Laat ze 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur drogen, plaats ze vervolgens in een Coplin Jar en laat ze overnacht staan. Verwijder de dia's uit de Coplin Jar en plaats ze in een plastic rek in de afzuigkap.
Plaats in een kleurinschaal met 100%ethanol gedurende vijf minuten. Dehydrateer de secties door twee verdere vijf minuten durende ethanol wasbeurten. Plaats vervolgens de dia's in een glazen rek en gebruik een metalen handvat om het rek in een glazen kleurinschaal met 99%xyleen te laten zakken.
Was de dia's in twee wisselingen van xyleen gedurende vijf minuten. Nadat de tijd voor de tweede was is verstreken, verwijdert u de dia's één voor één uit de xyleen en bedekt u het weefsel snel met ongeveer 0,25 milliliter montagemedium. Neem vervolgens een schuifdeksel en leg het over het medium.
Duwt eventuele luchtbellen onder de schuifdeksels naar de rand met een stomp object, zoals het uiteinde van een verfkwast. Plaats de dia's op een plek buiten direct zonlicht en laat ze twee tot drie dagen drogen. Na het drogen gaat u verder met beeldverwerving met behulp van een microscoop en analyse met de juiste software.
Deze lichtveldafbeelding toont een Golgi-gekleurde neuron die voldoet aan de criteria voor beeldvorming en verdere analyse. Alle drie de soorten doorns zijn gemakkelijk te zien. De kleuring is consistent over de gehele lengte van de dendriet en de dendriet is geïsoleerd van andere neuronen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd Golgi-Cox-protocol voor het kleuren van hersenweefsel, wat een kwalitatief hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus en in de rest van de hersenen mogelijk maakt. De methode minimaliseert probleemoplossing en vergemakkelijkt het onderzoek naar dendritische morfologie en complexiteit.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuroanatomie
- Histologie
Achtergrond
- Golgi-kleuring labelt selectief een kleine subset van neuronen.
- Deze techniek is cruciaal voor het in kaart brengen van neuronale structuren.
- Het maakt de beoordeling van de dendritische complexiteit mogelijk.
- Hersendoorsneden blijven intact tijdens het kleuringsproces.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor Golgi-kleuring van hersenweefsel.
- Om het onderzoek van neuronale morfologie te vergemakkelijken.
- Om een protocol te bieden dat het risico op weefselschade minimaliseert.
Gebruikte methoden
- Onderdompeling van niet-gefixeerde knagerhalfhersenen in een oplossing op basis van kwik(II)chloride.
- Toepassing van het Golgi-Cox-kleuringsprotocol.
- Beoordeling van de dendritische morfologie en complexiteit.
- Demonstratie door promovendi in een laboratoriumomgeving.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kleuring van hersensecties zonder uitdroging of beschadiging.
- Hoogwaardige visualisatie van neuronale structuren.
- Effectieve tracering van de dendritische morfologie.
- Minimale probleemoplossing vereist voor het protocol.
Conclusies
- Het Golgi-Cox-protocol is een betrouwbare methode voor het bestuderen van hersenweefsel.
- Deze techniek vergroot het inzicht in de neuronale architectuur.
- Het is geschikt voor diverse neurowetenschappelijke onderzoekstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het beoordelen van de dendritische complexiteit van de hippocampus biedt mechanistische inzichten in neurocognitieve veranderingen die geassocieerd zijn met veroudering en blootstelling aan chemotherapie, wat de validatie van targets bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel ondersteunt. De Golgi-Cox-methode maakt kwantitatieve evaluatie van de dendritische arborisatie en spine-dichtheid mogelijk en biedt een ziekterelevant systeem voor preklinische risicoreductie van neurotoxische verbindingen. Deze benadering versterkt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door structurele neuronale veranderingen te koppelen aan functionele uitkomsten in verouderde muismodellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk met betrekking tot neurostructurele veranderingen in de verouderde hippocampus.
- Operationele waarde: Biedt biologische risicoreductie door functionele targetvalidatie van de dendritische integriteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het kwantificeren van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in spindichtheid en arborisatie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerd hippocampusweefsel voor voor downstream screening van verbindingen met een consistente kleuringskwaliteit.
- Kwantitatieve output: Levert reproduceerbare metingen van dendritlengte, vertakking en spine-dichtheid in verschillende hippocampussubregio's.
- Nut van het platform: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk via gestandaardiseerde neuroanatomische fenotypering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de leeftijdgerelateerde kwetsbaarheid van de hippocampus voor chemotherapeutica zoals 5-fluorouracil.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door middel van regio-specifieke dendritische analyse.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert beslissingen over verdere ontwikkeling door neurotoxische risico's vroeg in de pijplijn te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De Golgi-Cox-methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen via leadidentificatie tot preklinische veiligheidsbeoordelingen, in het bijzonder voor verbindingen die de bloed-hersenbarrière kunnen passeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van neurostructurele paden en biologische risicoreductie van mechanische ambiguïteit.
- Screening: Levert assay-klaar weefsel met kwantitatieve morfometrische resultaten voor de vergelijking van compound-effecten.
- Analytics: Maakt Sholl-analyse en kwantificatie van de spine-densiteit mogelijk om condities te vergelijken en de impact van compounds te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt structurele veranderingen in de hippocampus met preklinische continuïteit via regio-specifieke kwetsbaarheid in CA1, CA3 en DG.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar histologieplatform voor neuroanatomische screening over verschillende therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door vermindering van mechanistische ambiguïteit bij neuronale structurele veranderingen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de beoordeling van dendritische morfologie over verschillende hersengebieden.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de ontwikkeling van neurotherapeutica.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van dendritische complexiteit en spine-dichtheid als translationele biomarkers.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neurohistologie en weefselverwerking voor een correcte uitvoering van de Golgi-kleuring.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een vibratoom voor het snijden en lichtveldmicroscopie voor beeldvorming.
- Vereist standaardisatie tussen de histologie-, beeldvormings- en analyseteams voor reproduceerbare resultaten.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende hersengebieden of ziektemodellen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals het omgaan met gevaarlijke reagentia (kwik(II)chloride, ammoniumhydroxide, xyleen), waarvoor het gebruik van een zuurkast en PBM is vereist.
