Name: Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer de Golgi-Cox methode voor het beoordelen van dendritische complexiteit in het hippocampus van oude muizen. Deze techniek maakt hoogwaardige visualisatie van neuronale structuren mogelijk zonder weefselschade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een pilot-subsidie ​​onder NIH P20 GM109005 (ARA) en door het Center for Translational Neuroscience IDeA-programma P30 GM110702.

Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee bij UAMS. 1. Dieren en 5-Fu Injectie Paradigma <ol><li> Koop 6 maanden oude mannelijke C57Bl6 / J wild-type muizen en houd ze onder een constante 12 uur licht / donkere cyclus tot ze 1 jaar oud zijn. </li><li> Verdun de 5-Fu in 0,9% steriele zoutoplossing. Gebruik 60 mg / kg als de vereiste dosis per muis. </li><li> Geef de intraperitoneale injecties van de 5-Fu (eenmaal per week gedurende drie weken). <ol><li> Geef de intraperitoneale injecties ongeveer dezelfde tijd op elke dag. Bijvoorbeeld, tussen 0900-1200 uur. </li></ol></li><li> Euthanize de dieren en trek de hersenen 30 dagen na de laatste injectie. </li></ol> 2. Euthanasieprocedure en breinwinning <ol><li> Houd de knaagdier vast en grijp de basis van de staart vast. Plaats de duim of vinger aan de andere kant bij de handE basis van de nek van de knaagdier. Zet druk snel op de nek van de knaagdier en duw naar voren terwijl de andere hand met de staart naar achteren trekt. </li><li> Houd het knaagdier met de ene hand en de grote chirurgische schaar met de andere. Plaats de nek van de knaagdier tussen de twee bladen en ontdek het hoofd snel. </li><li> Neem de gesneden muishoofd en gebruik de fijne schaar om de bont boven de schedel te trimmen, tot aan de ogen. Plaats vervolgens de uiteinden van de schaar in elke oogcontact en sluit de schaar met kleine kracht. </li><li> Gebruik de lente schaar om de schedel naar links en rechts van het cerebellum te snijden. </li><li> Gebruik pincet om het gedeelte van de schedel omstreeks de cerebellum rechtstreeks op en uit te halen. </li><li> Gebruik de lente schaar om de midsagittale lijn van de schedel te snijden. </li><li> Gebruik de tang om het resterende gedeelte van de schedel uit de hersenen op te tillen. </li><li> Gebruik een spatel en een sonde om de hersenen in de gewenste container uit te schuiven. Met een roestvrij sTeelblad, snijd elke hersenen langs het midsagittale vlak. Voer de volgende Golgi-Cox methode uit op de rechterhelft. </li></ol> 3. Golgi Staining en Weefsel Voorbereiding <ol><li> Dompel de vers geoogste halve hersenen in een 10 ml conische buis in 5 ml oplossing op basis van oplossing op basis van oplossing op basis van chloride (oplossing A uit de kit). De mercuric chloride oplossing is lichtgevoelig; Bedek de buis met folie. Bewaar het monster bij kamertemperatuur in het donker. OPMERKING: Oplossing A wordt geleverd in de kit die staat vermeld in de tabel van materialen. Voorzichtigheid! Oplossing A (ook wel mercuric chloride oplossing genoemd) bevat giftige reagentia zoals kaliumdichromaat, mercuric chloride en kaliumchromaat. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap. </li><li> Na 1 dag, verdeel de oplossing langzaam in een tijdelijke container (zoals een grote weegboot) en verwijder het in een afvalhouder voor biohazard. Dompel de hersenen (nog steeds in de originele 10 ml conische buizen) met 5 mlDe mercuric chloride oplossing, en laat het monster gedurende 13 dagen terugkeren naar het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 30 g postimpregnatiebuffer toe aan 90 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water (dH 2 O). Vul elk putje van een 6-putjesplaat met 6,5 ml van de postimpregnatiebuffer, een put per brein OPMERKING: Postimpregnatiebuffer wordt geleverd in de kit die staat vermeld in de tabel van materialen. <ol><li> Na 14 dagen (in totaal) in de mercuric chloride oplossing, spoel het weefsel met dH 2 O af en laat ze vervolgens over in 6-putjes platen met postimpregnatiebuffer. Bedek de platen met folie en sla ze op bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol></li><li> Pipetteer de postimpregnatiebuffer na 1 dag onderdompeling en vernieuw met verse post-impregnatiebuffer; Bewaar gedurende 1 dag in het donker bij kamertemperatuur. Bewaar dit indien nodig bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand 22 . </li></ol> 4. Sectie <ol><li> Meld de 12-putjesplaten op hun deksels met nummers in oplopende volgorde van links naar rechts en van boven naar beneden. </li><li> Bereid twee of drie 12-putjesplaten per hersen voor als u de hele hersenen snijdt. <ol><li> Benoem de bovenkant van elk 12-deksel deksel met het identificatienummer van de hersenen. </li><li> Pipetteer 2 ml 1x PBS in elke putje van elke plaat. </li></ol></li><li> Stel het podium op en zet de vibratomeer aan; Zorg ervoor dat er genoeg 1x PBS in de container is om het weefsel te bedekken. <ol><li> Snijd twee stukken plastic parafinfolie en vouw ze twee keer over. Plaats ze over de gaten voor de specimenhouderknoppen om te voorkomen dat 1x PBS op de toonbank lekt. </li><li> Zet de tape op het weefselblok van de specimenhouder en zet dan de cyanacrylaat lijm lijm (zie tabel van materialen) erop. </li></ol></li><li> Verwijder de hersenen uit de 6-putjesplaat en plaats deze op een plastic of glasschotel. Gebruik de roestvrijstalenStaal dubbelzijdig mes om ongeveer de helft van het cerebellum af te snijden. <ol><li> Snijd het cerebellum caudally. Zorg ervoor dat het gedeelte van het resterende cerebellum gelijk is. </li></ol></li><li> Plaats het platte oppervlak van het resterende cerebellum onmiddellijk op de lijm. OPMERKING: Het dorsale deel van het weefsel (de hersencortex) moet links of rechts ten opzichte van het mes worden geconfronteerd. Het rostrale uiteinde dat eerder de olfactorische bollen bevatte had, moest naar boven gericht zijn. <ol><li> Wacht minstens een paar minuten om ervoor te zorgen dat de lijm helemaal droogt. </li></ol></li><li> Terwijl de lijm die de hersenen vasthoudt, droogt, giet 1x PBS in het specimenbad. Nadat de lijm droog is, plaats de specimenhouder met het weefsel in het specimenbad. <ol><li> Als het weefselmonster niet volledig is bedekt, giet meer 1x PBS in het specimenbad. </li></ol></li><li> Bevestig het mes aan de meshouder van de vibratoom en langzaam lZet het mes in het specimenbad totdat het volledig is ondergedompeld in 1x PBS. Ga door met het verlagen van het mes tot het iets onder de bovenkant van het weefsel zit. </li><li> Stel de trillingssnelheid in op 7, de amplitude tot 6, en de snijhoek tot 12 ° (zie tabel van materialen voor het vibratome-model). Start de trilling en snijd 200 μm secties 23 . <ol><li> Gebruik een grote pensel om de weefselsecties van het specimenbad te verplaatsen naar elke aangewezen put van de 12-putjesplaten. </li></ol></li><li> Ga door tot het gewenste aantal weefselsecties bereikt wordt. </li></ol> 5. Post-staining <ol><li> Voor elk van de volgende vlekstapjes en spoeltjes gebruikt u 2 ml van de aangegeven oplossing per putje. Gebruik een gemotoriseerde pipet vulmiddel (zie tabel van materialen) om de oplossingen in de putjes over te brengen. Gebruik een transferpipette (zie tabel van materialen) om oplossingen uit de putjes en in het juiste afval over te brengencontainers. </li><li> Spoel de secties in een 30 minuten was van 0,01 M PBS-T (voeg 3,0 mL detergens toe (zie tabel van materialen) tot 1000 ml 0,01 M PBS). </li><li> Verdun ammoniumhydroxideoplossing (voorzichtig) 3: 5 vol met dH 2 O onmiddellijk voor gebruik. Vlek de secties in de verdunde ammoniumhydroxideoplossing gedurende 19-21 minuten. <ol><li> Bescherm de lichtgevoelige ammoniumhydroxideoplossing met folie. OPMERKING: Ammoniumhydroxide binnen oplossing heeft een concentratie van ~ 10% en is geclassificeerd als &#39;gevaarlijk&#39;. Ammoniumhydroxideoplossing kan brandwonden veroorzaken als het in contact komt met de huid. Het kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken bij inademing. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap. </li></ol></li><li> Vlek de secties in de post-staining buffer (voeg 90 g reagent D in 500 mL dH 2 O) gedurende 19-21 min. De post-staining buffer is lichtgevoelig; Bescherm het met folie 22 . </li><li> Spoel de secties in drie, 5-10 minuten wassen van 0,01 M PBS-T. </li></ol> 6. Montage, schoonmaken en bedekken <ol><li> Monteer de afdelingen op 1% gelatine-gecoate glijbanen met de grote verfborstel. Laat ze gedurende 20-30 minuten drogen bij kamertemperatuur, en plaats ze dan in een Coplin pot overnacht. </li><li> Verwijder de glijbanen met handschoenen uit de Coplin pot en plaats ze in een plastic rek (zie tabel van materialen). Plaats het plastic rek in de vlekschotel (zie tabel van materialen) die 100% ethanol bevat. Ontvetten ze met drie 5 minuten wast. </li><li> Was de glijbanen twee keer gedurende 5 minuten elk in 99% xyleen. Plaats de glijbanen in een glazen rek en steek het rekje in een glazen vlekschotel met xyleen met een metalen handgreep (zie tabel van materialen). OPMERKING: Voorzichtigheid Xylene is schadelijk bij inademing en irritatie veroorzaakt als het aan de huid raakt. Het is zeer brandbaar in vloeibare en damptoestanden. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap. </li><li> Verwijder de dia&#39;s van de xylÉén op een keer en bedek het weefsel snel met ~ 0,25 ml montagemedia (zie Materiaaltafel). Vervolgens pak de diahoes en leg ze over de media. <ol><li> Duw alle gevangen luchtbellen onder de schuifdoppen naar de rand met een stomp voorwerp, zoals het einde van een penseel. </li></ol></li><li> Plaats de glijbanen in een gebied buiten het zonlicht en laat ze 2-3 dagen drogen. </li><li> Ga door met het verkrijgen van beelden met behulp van een microscoop en analyseren met de juiste software. </li></ol> 7. Verkrijg Beeldstack <ol><li> Open het afbeeldingsprogramma (zie Materialtabel ). Plaats de dia op het podium van de microscoop. Klik in het menu bovenaan het programma op &#39;Acquisitie&#39; en klik vervolgens op &#39;Live Image&#39;. </li><li> Zet de microscoop op 10X. Identificeer de neuron van voorkeur en breng dan de cursor, die lijkt op een rode X, in het midden van de soma. Links klikken om het referentiepunt in te stellen. </li><li> Zet de microscoop op 40X. Klik op &#39;Beweeg&#39; in het menu boven aan het programma en klik vervolgens op &#39;Naar referentiepunt&#39;. </li><li> Begin met het maken van de beeldstapel door handmatig te scrollen met de fijne doelstelling boven het weefsel totdat het iets uit focus ligt. <ol><li> Klik op &quot;Set Top&quot; in de rechterbenedenhoek van het programma onder de rubriek &quot;Image Acquisition.&quot; </li><li> Blader iets onder het weefsel totdat het een beetje uit de focus ligt en klik vervolgens op &quot;Set Bottom&quot; onder &quot;Image Acquisition.&quot; Klik vervolgens op &#39;Beeldstack ophalen&#39;. </li></ol></li><li> Nadat de afbeeldingsstapel is verkregen, typt u de gewenste naam voor het afbeeldingsbestand in het venster dat verschijnt. Opslaan als &quot;MBF Ascii-bestand.&quot; <ol><li> Wanneer u wordt gevraagd, selecteer het bestandstype als &quot;MBF JPEG2000 stapelbestand&quot; en klik vervolgens op &quot;Opslaan&quot;. </li></ol></li></ol> 8. Neuronale tracing <ol><li> In de toolbaKlik onder het menu op het vakje met de titel &quot;Contour Name&quot;. Selecteer &quot;Soma&quot; in de vervolgkeuzelijst. </li><li> Spoor de soma handmatig op. Klik dan met de rechtermuisknop en selecteer &quot;Afwerking cellichaam&quot; wanneer het traceren voltooid is. </li><li> Selecteer &quot;AutoNeuron&quot; om een ​​ander tabblad met de titel &quot;AutoNeuron Workflow&quot; op te halen. </li><li> Onder &quot;Configuratietype&quot; selecteert u &quot;Nieuw&quot;. Stel de parameters in en klik vervolgens op &quot;Next Step&quot; om &quot;Soma Detection&quot; onderverdeling op te roepen. <ol><li> Selecteer &quot;Brightfield&quot; om de parameters in te stellen. Klik vervolgens onder &quot;Max proces diameter&quot;, klik op &quot;Start meten&quot;. Ga met de cursor naar de basis van de dendriet en stel de diameter handmatig in. </li></ol></li><li> Klik op &#39;Ja&#39; in het venster dat de gebruiker vraagt ​​om de gehele afbeelding te traceren. Spoor de soma handmatig op. Klik op en klik vervolgens op &quot;Volgende stap&quot; om de onderkant van de zaadpositie op te halen. </li><li> Klik op &quot;Bevestigen SeedS &quot;en klik vervolgens op&quot; Next Step &quot;om de subrubriek&quot; Neuron Reconstruction &quot;op te halen. </li><li> Klik onder &#39;Neuron&#39; op &#39;Interactief&#39;. Doe interactieve tracing door de richting van het programma van de dendriten te volgen en met de rechtermuisknop te klikken om het gemarkeerde gebied dat door het programma wordt gevolgd af te ronden. Nadat u alle dendriten hebt opgespoord, klikt u op &#39;Volgende stap&#39;. </li><li> Nadat een nieuw venster verschijnt, slaat u de nieuwe configuratie op met een gewenste titel. Klik op &#39;Opslaan&#39;. </li></ol> 9. Analyse <ol><li> Open het analyseprogramma (zie de tabel van materialen). </li><li> Klik op &quot;Bestand&quot; in het bovenste menu en klik vervolgens op &quot;Gegevensbestand openen&quot;. Selecteer het bestand van belangstelling. </li><li> Selecteer onder de analyse onderverdeling &quot;Sholl Analysis.&quot; </li><li> Stel in het venster &quot;Sholl Analyse&quot; de startradius op 10 μm. Klik onder &#39;Analyse&#39; op de vakken &#39;Dendrites&#39; en &#39;Branch Orders&#39;. </li><li> Rechts clIck de nieuw geopende windows en klik op &quot;Excel Export.&quot; Klik op &#39;Opslaan&#39;. </li><li> Klik onder de analyse op &#39;Vertakte structuuranalyses&#39;. Selecteer &#39;Alle mogelijke analyses&#39;. </li><li> Klik met de rechtermuisknop op het nieuw geopende venster en klik op &quot;Excel Export&quot; 24 . </li></ol>

<ol><li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+integration%3A+60+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Dynamics+of+Dendritic+Spines+in+Memory+and+Cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition.</a> Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).</li>
<li>von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+dendritic+spines+within+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure and function of dendritic spines within the hippocampus.</a> Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Bourne, J. N., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+structure+and+function+at+hippocampal+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines.</a> Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).</li>
<li>Lai, K. O., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%3A+the+underlying+mechanisms+and+its+dysregulation+in+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).</li>
<li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+development%2C+and+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Op+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>Harris, K. M., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines%3A+cellular+specializations+imparting+both+stability+and+flexibility+to+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function.</a> Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).</li>
<li>Leuner, B., Shors, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+anxiety%2C+and+dendritic+spines%3A+what+are+the+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections.</a> Neuroscience. 251, 108-119 (2013).</li>
<li>Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+dendritic+spine+synapses+during+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).</li>
<li>Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12850432">Structure-stability-function relationships of dendritic spines.</a> Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Koyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.oapublishinglondon.com/images/article/pdf/1397256114.pdf">The unending fascination with the Golgi method.</a> OA Anat. 1 (3), 24(2013).</li>
<li>Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/46234">On the "selectivity" of the Golgi-Cox method.</a> J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Rosoklija, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Golgi+methods+for+impregnation+of+brain+tissue+from+humans+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys.</a> J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).</li>
<li>de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal%3A+lessons+on+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Cajal: lessons on brain development.</a> Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22single%22+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+staining+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox staining step by step.</a> Front Neuroanat. 10 (38), (2016).</li>
<li>superGolgi Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf">http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf">https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf</a> (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neurolucida+11.03%22">Neurolucida 11.03</a>. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).</li>
<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+in+the+neurons+of+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Pillai, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+of+hippocampal+and+amygdalar+neurons+in+adolescent+mice+is+resilient+to+genetic+differences+in+stress+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Morley, B. J., Mervis, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+alterations+in+the+hippocampus+and+parietal+cortex+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice.</a> Neuroscience. 233, 54-63 (2013).</li>
<li>Titus, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypobaric+hypoxia-induced+dendritic+atrophy+of+hippocampal+neurons+is+associated+with+cognitive+impairment+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats.</a> Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).</li>
<li>Groves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluorouracil+chemotherapy+upregulates+cytokines+and+alters+hippocampal+dendritic+complexity+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice.</a> Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).</li>
<li>Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Golgi+analysis+method+for+efficient+and+unbiased+classification+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In vergelijking met moderne technieken heeft de Golgi-Cox-methode verschillende voordelen die het de voorkeur geven aan de methode voor het onderzoeken van de ruggengraat morfologie: 1) De kleuring kan voor ieder willekeurig weefsel gebruikt worden. 2) Een basislichtmicroscoopopstelling is alles wat nodig is om Golgi-gebaseerde beelden verkrijgen, 3) De Golgi-Cox beeldvorming is sneller dan confocal beeldvorming, en 4) Golgi-gekleurde afdelingen zijn enkele maanden levensvatbaar tot jaren langer dan monsters die fluores...

<html> Dendrieten zijn het grootste deel van neuronen die presynaptische input 1 ontvangen en verwerken. Hun dendritische processen hebben een complexe geometrie, waarbij de proximale takken een grotere diameter hebben dan de distale takken. Zoals dendrieten ontwikkelen vormen ze verschillende verbindingen met andere neuronen in een proces dat wordt aangeduid als dendritische arborisatie. De omvang en het patroon van deze vertakking bepaalt de hoeveelheid synaptische ingangen die een dendriet adequaat kan verwerken 2 . Dendritische arborisatie is een noodzakelijk proces voor activiteitafhankelijke plasticiteit en goede ontwikkeling van neuronale circuits. Extensie, terugtrekking, vertakking en synaptogenese zijn ingewikkelde processen die intrinsieke genetische programma&#39;s bevatten en invloeden van extrinsieke factoren. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvormingF &quot;&gt; 3 , 4. De veranderingen in dendritische complexiteit worden geassocieerd met pathofysiologische en gedragsveranderingen 5. Abnormaliteiten zijn gerelateerd aan verschillende ziektetoestanden, waaronder Fragile X Syndrome en Down Syndrome 6 . Dendritische stekels zijn de gespecialiseerde subcellulaire compartimenten van de dendritische arbors die excitatoire input binnen het centrale zenuwstelsel ontvangen. Er zijn drie morfologische klassen dendritische stekels, met de naam van elke klas op basis van hun grootte en vorm: 1) Paddestoelenwervels, die complexe postsynaptische dichtheden hebben met meer glutamaatreceptoren dan andere stekels 7 ; 2) Stompe stekels, die geen stam hebben; En 3) dunne stekels, die bestaan ​​uit een langwerpige, smalle stam en een bolvormige kop 8 . Het dendritische wervelkolomvolume wordt gedeeltelijk gebruikt om ze te definiëren, met dunne wervelkolven over het algemeen kleiner (0,01 μm 3 </sup&gt;) In vergelijking met paddenstoelen (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . De stekels stabiliseren met rijping. Bijvoorbeeld, de dunne wervels trekken zich na een paar dagen terug of ontwikkelen zich tot paddenstoelen. Als alternatief zijn de paddenstoelen relatief stabiel en kunnen ze gedurende een langere periode overleven. De sterkte van de neuronale verbindingen wordt geacht te zijn gebaseerd op het aantal stekels en / of hun volume 11 , 12 , 13 . De klassieke Golgi-kleurmethode en zijn modernere variaties zijn allemaal handig om de dendritische ruggengraat morfologie en dichtheid te onderzoeken. Een uniek aspect van de Golgi-kleuring is dat het ongeveer 5% van de totale neuronen willekeurig vlekt, waardoor er sprake is van individuele neuronen 14 , 15 . Hoewel het exacte mechanisme waarin de Golgi methOd vlekken individuele neuronen is nog onbekend, het principe van de methode is gebaseerd op de kristallisatie van zilverchromaat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Er zijn drie hoofdsoorten van de Golgi-methode: de snelle Golgi, de Golgi-Cox en de Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drie methoden beginnen met een eerste incubatiefase in chroomzouten gedurende meerdere dagen tot maanden, maar er zijn bepaalde belangrijke verschillen tussen hen. De snelle Golgi maakt gebruik van osmiumtetroxide in de eerste stap, terwijl de Golgi-Kopsch paraformaldehyde bevat. De vlek in zowel de snelle Golgi als de Golgi-Kopsch wordt gevolgd door een incubatie in ongeveer 1-2 dagen zilvernitraatoplossing. De methode Golgi-Cox maakt gebruik van mercuric chloride en kalium dichromaat in plaats van zilvernitraat en heeft een impregneringstijd van 2-4 weken. De weefsels worden dan gesneden en snel in een verdunde ammoniak geplaatstOplossing, gevolgd door een fotografische fixer om zouten te verwijderen. Van de drie typen wordt de Golgi-Cox methode gedacht als het beste bij het vlek van de dendritische arbors zonder veel achtergrondinterferentie, onder andere omdat de kristalartefacten niet op het oppervlak van het weefsel voorkomen (anders dan in de snelle Golgi-methode) 17 , 20 , 21 . De huidige methode is een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commercieel Golgi-kleurset, en is ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van de 5-Fu de dendritische morfologische eigenschappen en de ruggengraat zou beïnvloeden. Alle verkregen gegevens kunnen verder inzicht geven in de manier waarop chemotherapeutische behandeling de neuronale schakeling beïnvloedt.

<table><tbody><tr><td>superGolgi Kit&nbsp;</td><td>Bioenno Lifesciences</td><td>30100</td><td>&nbsp;Bevat gevaarlijke materialen.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x powder concentrate</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Slide cover&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Transfer pipette&nbsp;</td><td>Globe Scientific&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Falcon tubes&nbsp;</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Foil&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate&nbsp;</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Gevaarlijk.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serological pipette</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Male Mice&nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Multiple components, see website for details.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc Camera</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish, Green</td><td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish Set&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Pipet Filler&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida&nbsp;</td><td>mbf Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer&nbsp;</td><td>mbf Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van hippocampale dendritische complexiteit in oude muizen met behulp van de golgi-cox methode

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritische stekels zijn de uitsteeksels van de neuronale dendritische assen die excitatoire synaptes bevatten. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvorming. Er zijn verschillende benaderingen voor Golgi-kleuring, die allemaal nuttig zijn om de morfologische kenmerken van dendritische arbors te bepalen en een heldere achtergrond te geven. De huidige Golgi-Cox methode, (een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commerciële Golgi-kleuringskit) werd ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van het chemotherapeutische geneesmiddel 5-flurouracil (5-Fu) de dendritische morfologie zou beïnvloeden , Het aantal stekels en de complexiteit van arborisatie binnen de hippocampus. De 5-Fu gemoduleerde de dendritische complexiteit aanzienlijk en verminderde de ruggengraat door de hippocampus op een regio-specifieke manier. Uit de getoonde gegevens blijkt dat de Golgi-kleurmethode efFectively gekleurde de volwassen neuronen in de CA1, de CA3 en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Dit protocol rapporteert de details voor elke stap, zodat andere onderzoekers het weefsel in de hersenen op betrouwbare wijze kunnen vlek met hoge kwaliteit resultaten en minimale probleemoplossing.

De effecten van de 5-Fu behandeling op de dendritische arborisatie en complexiteit in de hippocampus van Golgi-gekleurde hersensecties werden gekwantificeerd en opgespoord onder gebruikmaking van een commercieel beschikbare beeldsoftware. Na het traceren werden de dendritische arborisatie, de ruggengraat en de ruggengraat morfologie geanalyseerd met behulp van Sholl analyse en de dendritische complexiteitsindex (DCI). Sholl analyse is een kwantitatieve analytische methode die kan worden ...

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Het algemene doel van deze methodologie is het correct Golgi-kleuren van hersenweefsel om de dendritische morfologie en complexiteit te onderzoeken en te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen. Omdat Golgi-kleuring slechts een kleine subset van cellen kleurt, kan deze techniek worden gebruikt om de structuur van neuronen in kaart te brengen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat hersendoorsneden gemakkelijk kunnen worden gekleurd zonder risico dat ze uitdrogen of loslaten tijdens de wasstappen. De procedure wordt gedemonstreerd door Fred Kiffer, Tyler Alexander en Julie Anderson, promovendi in het laboratorium van Dr. Allen. Begin met het onderdompelen van vers geoogste, niet gefixeerde rodenten-halfhersenen in vijf milliliter van een op kwik(II)chloride gebaseerde oplossing.Aangezien de kwik(II)chloride-oplossing lichtgevoelig is, moet de buis met folie worden afgedekt. Bewaar de monsters donker bij kamertemperatuur. Giet de volgende dag de oplossing langzaam over in een tijdelijke container voordat deze op de juiste wijze wordt afgevoerd in een container voor biologisch gevaarlijk afval.Voeg vijf milliliters verse kwik(II)chloride-oplossing toe en zorg ervoor dat de hersenen volledig ondergedompeld zijn. Bewaar de monsters nog 13 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Bereid na 14 dagen de post-impregneringsbuffer door 30 grams post-impregneringsbufferpoeder toe te voegen aan 90 milliliters gedestilleerd of gedeïoniseerd water, DH2O.Vul elke put van de zes-puts plaat met 6,5 milliliters van de post-impregnatiebuffer, één put per brein. Verwijder vervolgens de kwik(II)chloride-oplossing uit het breinweefsel zoals voorheen. Spoel het weefsel met DH2O en breng het weefsel daarna over naar de zes-puts platen met post-impregnatiebuffer.Dek de platen af met folie en bewaar ze op kamertemperatuur in het donker. Aspireer de volgende dag de post-impregnatiebuffer en vervang deze. Dek de plaat opnieuw af en bewaar deze in een koelkast op 4 °C.Bereid per brein twee of drie 12-well platen voor door de platen eerst op de deksels te labelen met nummers in oplopende volgorde van links naar rechts en van boven naar beneden. Voeg het identificatienummer van het gesneden brein toe. Pipetteer twee milliliters 1X PBS in elke well van elke plaat, stel vervolgens de tafel in en zet de vibratoom aan.Plak vervolgens tape op het weefselblok van de monsterhouder en breng daarop een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm aan. Haal een brein uit de zes-wells plaat en plaats dit op een plastic of glazen schaal. Gebruik een roestvrijstalen tweesnijdend mesje om het cerebellum caudaal door te snijden, waarbij u erop let dat het deel van het cerebellum dat op het brein achterblijft vlak is.Plaats vervolgens het vlakke oppervlak van het resterende cerebellum op de lijm. Nadat de lijm is opgedroogd, plaatst u de specimenhouder met het weefsel in het specimenbad. Plaats het specimenbad op de vibratoom en bedek het weefselmonster met PBS.Bevestig vervolgens het mes aan de meshouder van de vibratoom en laat het mes langzaam in het monsterbad zakken tot het volledig is ondergedompeld en zich net onder de bovenkant van het weefsel bevindt. Stel daarna de snelheid van de vibratoom in op zeven, de amplitude op zes en de snijhoek op 12 graden. Start de vibratie en snijd secties van 200 micron.Gebruik een grote verfkwast om de weefselcoupes vanuit het monsterbad naar de aangewezen putjes van de 12-well platen te verplaatsen. Ga door met het snijden van het weefsel totdat het gewenste aantal weefselcoupes is bereikt. Gebruik na het snijden een transferpipet om de PBS uit de putjes van de 12-well plaat te aspireren, voeg vervolgens twee milliliters PBS-T toe en was gedurende 30 minuten onder agitatie.Tegen het einde van de wastijd wordt drie delen ammoniumhydroxide-oplossing verdund met vijf delen DH2O. Voeg vervolgens, na het verwijderen van de PBS-T, de verdunde ammoniumhydroxide-oplossing toe. Bescherm de coupes tegen licht met aluminiumfolie en kleur deze gedurende 19 tot 21 minuten.Verwijder vervolgens voorzichtig de ammoniumhydroxide-oplossing en voeg de post-staining buffer toe. Bescherm de coupes met aluminiumfolie en laat ze nogmaals 19 tot 21 minuten kleuren. Spoel de coupes tot slot drie keer gedurende vijf tot 10 minuten met PBS-T.Monteer de coupes met een grote schilderspenseel op coupesglas gecoat met 1% gelatine. Laat ze 20 tot 30 minuten drogen bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens in een Coplin-pot om daar een nacht in te blijven. Haal de coupesglas uit de Coplin-pot en plaats ze in een plastic rek in de zuurkast.Plaats de coupes gedurende vijf minuten in een kleurschaal met 100% ethanol. Dehydrateer de coupes vervolgens door twee extra ethanolwasbeurten van vijf minuten. Plaats de objectglazen daarna in een glazen rek en gebruik een metalen handvat om het rek in een glazen kleurschaal met 99% xyleen te laten zakken.Was de objectglazen in twee opeenvolgende xyleenbaden van elk vijf minuten. Nadat de tijd voor de tweede wasbeurt is verstreken, worden de objectglazen één voor één uit het xyleen gehaald en wordt het weefsel snel bedekt met ongeveer 0,25 milliliters monteermedium. Plaats vervolgens een dekglas over het medium.Duw eventuele ingesloten luchtbellen onder de dekglasjes naar de rand met een stomp voorwerp, zoals het uiteinde van een schilderspenseel. Plaats de preparaten op een plek uit direct zonlicht en laat ze twee tot drie dagen drogen. Ga na het drogen over tot beeldacquisitie met behulp van een microscoop en analyse met de geschikte software.Deze bright field-afbeelding toont een Golgi-gekleurd neuron dat voldoet aan de criteria voor beeldvorming en verdere analyse. Alle drie de typen spines zijn duidelijk zichtbaar. De kleuring is consistent over de gehele lengte van de dendriet en de dendriet is geïsoleerd van andere neuronen.Deze figuur laat zien dat Golgi-gekleurde neuronen binnen de Gyrus Dentatus een afgenomen lengte vertoonden bij de vierde en zesde orde na behandeling met 5-fluorouracil in vergelijking met de zoutoplossing-behandelde groep. Golgi-kleuring kan worden gebruikt om significante verschillen in spindichtheid aan te tonen. In de apicale piramidale dendrieten van CA1 leidde de toediening van 5-fluorouracil aan levende muizen tot een significante afname van de spindichtheid.In de basale dendrieten waren er geen significante veranderingen in de algemene densiteit van de spines. Sholl-analyse van de apicale piramidale dendrieten in CA1 onthulde dat behandeling met 5-fluorouracil de dendritische arborisatie significant verminderde op afstanden tussen 40 en 160 microns vanaf het soma. In de basale dendrieten verminderde de 5-fluorouracilbehandeling de dendritische arborisatie op 30 tot 110 microns afstand van het soma.Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen zowel het Golgi-kleuringsproces als het monteren, reinigen en afdekken in drie uur per brein worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers in het vakgebied van de neurobiologie neuroanatomische verbindingen in een muismodel verkennen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de coupes slechts 19 tot 21 minuten in de ammoniumhydroxide-oplossing mogen blijven, om overkleuring van de neuronen te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe hersenweefsel correct gekleurd, gesneden en gespoeld dient te worden. Vergeet niet dat het werken met de op kwik(II)chloride gebaseerde oplossing, de ammoniumhydroxide-oplossing en xyleen extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen, draag laboratoriumhandschoenen en werk in een zuurkast bij het uitvoeren van deze procedure.

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop werd aangetoond in deze video opgenomen protocol.

Dissectie van de hippocampus dentate gyrus van de volwassen muis

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

Dit artikel beschrijft de procedures voor de tactiele stimulatie van pups rat en de daaropvolgende Golgi-Cox kleuring van neuronale morfologie. Tactiele stimulatie is een positieve ervaring die wordt toegediend in de perinatale periode door strelen pups met een huishouden stofdoek. Golgi-cox kleuring is een betrouwbare procedure waardoor de visualisatie van hele neuronen.

Visualiseren van de effecten van een positieve vroege Experience, Tactiel Stimulatie, op dendritische morfologie en Synaptic Connectiviteit met Golgi-Cox kleuring

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

Leer de Golgi-Cox methode voor het beoordelen van dendritische complexiteit in het hippocampus van oude muizen. Deze techniek maakt hoogwaardige visualisatie van neuronale structuren mogelijk zonder weefselschade.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Meer video's verkennen