Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe neurites te initiëren, deze snel uit te breiden en ze nauwkeurig te verbinden met doelcellen. Deze procedure is alleen mogelijk door het gebruik van cellen die in een gecontroleerde en reproduceerbare omgeving zijn gekweekt. Deze methode stelt ons in staat om belangrijke vragen in de neurowetenschap te beantwoorden.

Wat beperkt de groeisnelheid van neuronen? Hoe snel kunnen ze groeien? Spelen mechanische aanwijzingen een rol?

We kunnen ook bestuderen hoe synapsen worden gevormd, hoe vinden neuronen een doelcel? Hoe verouderen en rijpen synapsen? En ten derde kunnen we beginnen met het systematisch bouwen van neurale netwerken, het bestuderen van hoe neuronen rekenen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudige manipulatie, experimentele reproduceerbaarheid en uiteindelijk een hoge mate van controle op het niveau van één cel mogelijk maakt. Om deze procedure te beginnen, reinig en bereid het gewenste aantal steriele dekglasjes voor. Bedek vervolgens elk dekglas met 0,5 tot 1 milliliter van 100 microgram per milliliter PDL gedurende minimaal twee uur op kamertemperatuur.

Was daarna de dekglasjes twee keer met water en verwijder alle vloeistof. Laat ze 5 tot 10 minuten in een steriele omgeving drogen of tot het oppervlak volledig droog is. Plaats vervolgens de microfluïdische apparaten met de patronen naar boven onder de UV-lamp in een bioveiligheidskabinet gedurende 10 minuten.

Na 10 minuten plaatst u een microfluïdisch apparaat met het patroon naar beneden in contact met het schone dekglas. Gebruik de pincetten om het apparaat zachtjes aan te drukken zodat het aan het glas hecht. Om het apparaat met één populatie met medium te vullen, voegt u 50 microliter compleet celmedium toe aan het rechter bovenste putje.

En voeg vervolgens nog eens 50 microliter compleet celmedium toe aan de diagonaal daarvan. Om het apparaat met meerdere populaties met medium te vullen, voegt u 30 microliter compleet NBM toe aan een rij putjes. Zorg ervoor dat het medium tussen de putjes stroomt.

Voeg vervolgens 50 microliter medium toe aan elk van de overige putjes. Plaats de apparaten in een grotere plaat met een open schaaltje gesteriliseerd water en plaats de schaal in de incubator gedurende één tot twee uur terwijl u de celcultuur voorbereidt. Verwijder nu het medium uit de bovenste putjes van de microfluïdische apparaten zonder de putjes te legen.

Voeg vervolgens 20 microliter van de geconcentreerde celoplossing toe aan het bovenste rechter putje van het microfluïdische apparaat en controleer in de microscoop hoe de cellen in het apparaat met één populatie stromen. Om cellen in het apparaat met meerdere populaties te plateren, voegt u 20 microliter van de geconcentreerde celoplossing toe aan elk van de bovenste putjes. Controleer onder de microscoop of de cellen zich in de kamers bevinden.

Plaats vervolgens de apparaten gedurende 15 tot 30 minuten in de incubator om de aanhechting van cellen aan het substraat te bevorderen. Nadat de cellen zich aan het substraat hebben gehecht, voegt u 40 microliter NBM toe aan de twee bovenste putjes van het apparaat met één populatie. Dit helpt om de luchtbellen uit de microkanalen te verwijderen.

Voeg 20 microliter MBM toe aan de bovenste putjes van het apparaat met meerdere populaties, dezelfde putjes waarin de cellen zijn geïnjecteerd. Het medium moet lichtjes uitsteken om een positieve meniscus te vormen en de putjes een muffintop-aspect te geven. Een tot twee dagen voor het verwijderen van het microfluïdische apparaat, voegt u twee milliliter voorverwarmd NBM toe aan elk monsterbakje en overstroomt u de kamers.

Houd de apparaten vervolgens in de incubator. Vervolgens gebruikt u steriele pincetten en een pipettip om de microfluïdische apparaten van de dekglasjes te verwijderen en een gepatternde configuratie van neuronen achter te laten. In deze procedure en 40 tot 60 microliter van de voorbereide PDL-gecoate kralen tot de celcultuur.

Breng vervolgens het monster terug in de incubator gedurende één uur om de vorming van synaptische contacten te bevorderen. Installeer vervolgens het monster in een experimentele opstelling zodat de cellen van bovenaf door twee micropipetten kunnen worden beoordeeld en ook optisch kunnen worden benaderd. In deze configuratie bevindt zich een CCD-camera op de zijpoort van de microscoop voor beeldacquisitie.

Verbind elke pipet gevuld met fysiologische zoutoplossing aan een spuit van één milliliter en perfuseer het monster met fysiologische zoutoplossing. Controleer vervolgens onder de microscoop de opening tussen de twee geïsoleerde neuronale populaties om er zeker van te zijn dat de twee populaties niet natuurlijk verbonden zijn. Selecteer een PDL-kraal die niet is bevestigd aan de neuron in het gezichtsveld.

Lign de kraal met een micropipettip door te focussen op de kraal en vervolgens op de micropipet. Breng vervolgens de tip zo dicht mogelijk bij de kraal door hem onder de microscoop te controleren. Breng vervolgens negatieve druk aan op de pipet om de kraal op te pakken en houd de negatieve druk gedurende het hele experiment vast.

Selecteer nu een PDL-kraal die is bevestigd aan een neuron in het gezichtsveld en bevestig deze aan de tweede micropipet met behulp van zuiging. Trek het complex van de PDL-kraal en het neuron door langzaam de micromanipulator of de monsterstadium te bewegen met 0,5 micrometer per minuut gedurende 1 micrometer, en pauzeer gedurende vijf minuten om de initiatie van de neuriet toe te staan. Trek het complex van de PDL-kraal en het neuron door het langzaam lateraal te bewegen met 0,5 micrometer per minuut over twee micrometer, en pauzeer gedurende vijf minuten om de verlenging van de neuriet toe te staan.

Na succesvolle initiatie en neurietuitbreiding gedurende de eerste vijf micrometer, trekt u continu de neuriet met 20 micrometer per minuut. Om de neuronen te verbinden, selecteert u een gebied dat rijk is aan neurites. Gebruik andere kralen om de hoogte van de pipettip boven het dekglas te met