Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Het algemene doel van dit beeldvormingsprotocol is om de kwantificering van intracellulair pH te beschrijven, met behulp van een genetisch gecodeerde pH-indicator en te demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om basolaterale protonentransport in een insectenniermodel, de malpighische buis, te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cellulaire transport, zoals hoe specifieke transportproteïnen bijdragen aan epitheel protonenbeweging bij intracellulaire pH-regulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellulair transport snel en gemakkelijk kan worden beoordeeld in meerdere functioneel verschillende zones van intact epitheel.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in pH-regulatie en insectenepitheel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het zoogdier nefron en epitheelcellen in cultuur. Om deze procedure te beginnen, plaatst u twee sets soldeerhulpklemmen op de beeldvormingsmicroscoopstandaard, met één klem aan elke kant. Plaats vervolgens de respectieve gebogen glazen capillairen en de instroomlijn, en de vacuümverbinding, uitstroomlijn.

Monteer ze vervolgens in de helpende handen en lijn ze uit met de beeldvormingsfase van de microscoop. Smeer vacuümvet op de plafondtape en druk de plakbare overvloedsputscheider op de tape om de bodem met vet te bedekken. Trek de plakbare overvloedsputscheider eraf en plaats deze met de vette kant naar beneden op een met poly l-lysine gecoate schuif.

Verwijder vervolgens de overvloedsputscheider om individuele specifieke putjes achtergelaten in hydrofobe vet. Plaats daarna 200 microliter kamertemperatuur IPBS of insectenfosfaatbufferoplossing in de ingevette en cirkelvormige put op de met poly l-lysine gecoate schuif. Plaats vervolgens de schuif onder de stereoscoop, giet ijskoud Schneider's medium in de dissectiefa en breng een enkele verdoofde vrouwelijke vlieg over.

Houd de vlieg bij de thorax met een set pincetten en gebruik de andere om voorzichtig de achterste buik te grijpen. Trek de achterste kant in korte bewuste bewegingen open. Zodra de achterste bewaker zichtbaar is, grijpt u het uiteinde en bevrijdt u de darm en antes van de onderliggende trachea's, door de achterste bewaker door herhaalde korte trekjes van het lichaam weg te trekken.

Klep vervolgens de voorste antes van de ureter af met fijne pincetten, zodra de tweede set antes vrij is van de buik. Pak de vrije voorste antes op met de poolglasstaaf, door de staaf onder de ureter te schuiven, zodat de buisjes aan beide kanten vallen. Til vervolgens de antes recht omhoog, uit de oplossing, draai vervolgens de glasstaaf zodat de antes en ureter aan de onderkant van de staaf vastzitten.

Laat de ureter recht naar beneden op de schuif zakken, bevestig vervolgens de ureter en verzegel de distale uiteinden van de antes door de ureter verder op de glazen schuif te drukken. Gebruik het fijne uiteinde van de glasstaaf om elk buisje voorzichtig over het oppervlak van de schuif te vegen. Veeg de staaf tegen de schuif om de buisjes niet te verpletteren en schuif de staaf over de bovenkant van het buisje, van distaal naar proximaal, om de volledige lengte van elk buisje aan het oppervlak van de met poly l-lysine gecoate schuif te bevestigen.

Het succes van deze techniek hangt volledig af van nauwkeurige identificatie en zorgvuldige behandeling van de voorste malpighi-buisjes. Beschadigde buisjes zullen inconsistente resultaten opleveren. Plaats vervolgens de plakbare overvloedsputscheider terug op de schuif om een klein, met vloeistof gevuld putje te vormen over het gemonteerde buisje.

Plaats daarna het monster op de microscoopstandaard. Plaats de instroom en uitstroom capillairen over de inlaat- en uitlaatopening van de overvloedsput, respectievelijk. Zet in deze procedure de microscoop, lichtbron en beeldvormingssysteem aan en open vervolgens de beeldvormingssoftware.

Kijk door de oogstukken en pas handmatig de focus aan tot het lumen van de antes duidelijk zichtbaar is onder het doorgelaten licht. Klik vervolgens op het tabblad acquisitie en selecteer 2x2 in het menu met dimmen, in het gedeelte met acquisitiebelasting. Plaats een 5% neutraal dichtheidsfilter in de lichtbaan om het verlichtingslicht te verminderen en fotobleken te minimaliseren.

Klik op het GFP-kanaal in het kanalenmenu en klik vervolgens op live om het fluorescerende signaal via de camera te observeren. Pas vervolgens de tijdschuifaanwijzer aan om de belichtingstijd in te stellen, zodat de helderste pixelwaarden in de intensiteitshistogram ongeveer 40% van de maximumwaarde zijn. Klik vervolgens op stop om de verlichting te stoppen.

Herhaal de procedures in het RFP-kanaal en bevestig de aanwezigheid van het verwijde beginsegment van de voorste ante en de afwezigheid van cytosolid m-kerrie-aggregaten, wat wijst op weefselbeschadiging of overexpressie. Schakel vervolgens een timelapse-beeldvormingsprotocol in door op het selectievakje tijdreeks te klikken. Pas de duur in het menu met opties aan, in de sectie tijdreeks, naar 10 minuten en de intervalschuif naar nul, om de totale opnametijd in te stellen met de maximale beeldacquisitie.

Controleer vervolgens zowel de GFP- als RFP-vakjes in het kanaalgedeelte. Open de IPBS-lijn van het overvloedssysteem door de juiste klepcontroller te activeren en start het beeldvormingsprotocol door op experiment starten te klikken. Schakel na een minuut over naar ammoniumchloride-postoplossing gedurende 20 seconden door de juiste klep te openen en de IPBS-lijn te sluiten.

Keer vervolgens terug naar IPBS door de ammoniumchloridelijn te sluiten en de IPBS-klep te heropenen. Om een tweede-puntskalibratie uit te voeren, verwijdert u de putscheider door deze van de onderliggende schuif af te pellen en verwijdert u de overvloedskapillaren in klemmen uit de beeldvormingsput. Breng vervolgens 200 microliter kalibratie-IPBS-buffer aan op pH 7,4.

Verwijder vervolgens de oplossing uit de beeldvormingsput en vervang deze door een andere 200 microliter kalibratie-op