Name: Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer de optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian tubuli met de genetisch-gecodeerde indicator pHerry. Deze methode meet basolateraal protontransport in intact epitheelweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH DK092408 en DK100227 naar MFR. AJR werd gesteund door T32-DK007013. De auteurs bedank Dr. Julian A.T. Dow voor de CapaR-GAL4 en c724-GAL4 Drosophila voorraden. Wij danken ook Jacob B. Anderson voor bijstand behoud van experimentele vliegen kruisen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het succes van kwantificering van pHik in Drosophila MTs hangt volledig af van de gezondheid van uitgepakte MTs en de kwaliteit van de montage en dissectie (Figuur A - C). De zorgvuldige behandeling van weefsel als is beschreven dus noodzakelijk. Dia's vers gecoat in PLL aanzienlijk steun MT montage als ze de neiging om veel meer lijm dan dia's die eerder zijn blootgesteld aan oplossing. Zorgvuldige montage zal ook helpen bij de identificatie van de...

Het doel van dit protocol is kwantificering van intracellulaire pH (pHi) met behulp van een genetisch-gecodeerde pH-Indicator (GEpHI) beschrijven en demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen basolaterale H+ vervoer in een model insect (overleden melanogaster) renale structuur, de Malpighian zaadvormende (MT). MTs dienen als de uitscheidingsmechanisme organen van de fruitvlieg en functioneel vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nefronen in enkele belangrijke opzichten1. MTs zijn gerangschikt als 2 paar tubuli (anterior en posterior) in de borstkas en de buik van de vlieg. De eencellige epitheliale buis voor elke MT is samengesteld uit metabolisch actief belangrijkste cellen met verschillende apicale (luminal) en basolaterale (hemocoel) polariteit evenals tussenliggende Notti cellen. Anterior MTs zijn samengesteld uit 3 morfologisch, functioneel, en ontwikkelingsachterstand afzonderlijke segmenten, met name de aanvankelijke uitgezet segment, overgangs segment en secretoire belangrijkste segment, die naar de urineleider2. Op de cellulaire schaal trans-epitheliale ion vervoer in het lumen wordt bereikt door een apicaal plasmamembraan V-ATPase-3 , evenals een alkali-metalen/H+ -wisselaar en een basolaterale nb+-K+-ATPase4, actieve veredeling-gelijkrichter K+ kanalen5, nb+-gedreven Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6en nb+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, terwijl Notti cellen Cl- bemiddelen en water transport8,9. Dit complexe maar toegankelijk fysiologische systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor onderzoek van endogene ion vervoer mechanismen in combinatie met de diverse genetische en gedragsmatige toolsets van Drosophila.
De reden voor dit protocol was in het beschrijven van een genetisch smeedbaar systeem voor het bestuderen van epitheliale ion vervoer met potentieel voor de integratie van cel tot gedrag en uitvoer van hulpprogramma's voor andere modelsystemen. Uitdrukking van pHerry10, een GEpHI die zijn afgeleid uit een fusie van groene pH-gevoelige super ecliptica pHluorin11,12 (SEpH) en rode pH-ongevoelig mCherry13, in MTs toelaat kwantificering in vervoermiddelen H+ afzonderlijke MT cellen tot en met de hoge K+/nigericin kalibratie techniek14. Zoals vele ion transporters H+ -equivalenten verplaatsen, dient kwantificering van intracellulaire pHik als een functionele weergave van ion verkeer via diverse transporteurs. Het systeem van Drosophila MT model biedt ook krachtige genetische hulpmiddelen in weefsel-specifieke transgenic15 en RNA interferentie (RNAi)16 expressie, die kan worden gecombineerd met cellulaire beeldvorming en geheel-orgel testen17 , 18 , 19 van zaadvormende functie voor het maken van een robuuste toolset met verticale integratie van moleculen tot gedrag. Dit staat in contrast met veel andere protocollen voor de beoordeling van epitheliale biologie, zoals historisch dergelijke metingen hebben vertrouwd op ingewikkeld en ontmoedigend micro-dissectie, verfijnde ion-Ionselectieve electroden20,21, en dure pH-gevoelige kleurstoffen22 met beperkende laden eisen en arme cellulaire specificiteit in heterogene weefsels. GEpHIs werden gebruikt voor het meten van pHik in een verscheidenheid van cel typen23uitgebreid. Vroege werk benut de inherente pH-gevoeligheid van groen Fluorescent proteïne (GFP) volgen pHik in gekweekte epitheliale cellen24 maar de afgelopen twee decennia heb gezien GEpHIs gebruikt in neuronen25, glia26, schimmels27 , en28van de cellen van de plant. De combinatie van het potentieel voor cellulaire targeting van genetische constructies door middel van de GAL4/UAS expressie systeem15 en de fysiologische toegankelijkheid van de Drosophila MT maken dit een ideale voorbereiding voor onderzoek van de pHik verordening en epitheliale ion vervoer.
pHik verordening decennialang is onderzocht en is essentieel voor leven. De MT-voorbereiding biedt een robuust model om te leren van de Fysiologie van pHik verordening maar ook uitvoeren geavanceerde onderzoeken bij pHi verordening ex vivo en in vivo. Dit protocol beschrijft kwantificering van H+ verkeer over het basolaterale membraan van de epitheliale cellen van de Drosophila MT met behulp van de NH-4Cl pulse zuur laden techniek21, maar als pH-indicator is genetisch gecodeerd, kunnen deze methoden en hun theoretisch kader worden toegepast op elk preparaat vatbaar voor Transgenese en live-imaging.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL) Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Opslaan bij 4 °C, kan worden hergebruikt.</td></tr><tr><td>Nigericin Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>VOORZICHT: Hanteren met handschoenen. Bewaar als aliquoten van 20 mM stockoplossing in DMSO bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, kleefmaat 1 mm, kamerdiameter × dikte 9 mm × 0,9 mm, poortendiameter 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Kan worden vervangen zoals nodig om overeen te komen met perfusiesysteem.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Helping Hands Soldering Stands</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Open Gravity-fed Perfusion System met klepregelaar, 8 tot 1 manifold en reservoirs</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Elk vergelijkbaar perfusiesysteem kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Flow Regulator</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Kan worden vervangen zoals nodig om overeen te komen met perfusiesysteem.</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td>Opslaan bij 4 °C in steriele aliquoten.</td></tr><tr><td>#5 Inox Steel Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Kan worden vervangen op basis van comfort van de experimenteerder.</td></tr><tr><td>35 x 10 mm polystyreen petrischaal</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>Exact merk en maat zijn onbelangrijk.</td></tr><tr><td>75 x 25 mm microscoopglazen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>Exact merk en maat kunnen variëren zolang perfusieputjes compatibel zijn.</td></tr><tr><td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, dikte 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment niet noodzakelijk, glas kan worden vervangen om overeen te komen met perfusiebuis en perfusieputjes.</td></tr><tr><td>Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", dikte 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers, kan worden vervangen om overeen te komen met perfusiesysteem.</td></tr><tr><td>Vacuum Silicone Grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Plastic Flow Control Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers, steriliteit niet vereist</td></tr><tr><td>Glazen staven, 5 mm diameter</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>Exacte grootte is persoonlijke voorkeur, meerdere leveranciers beschikbaar</td></tr><tr><td>PAP Hydrophobic Pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Sealing Film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>10X/0.45 Air Objective</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Vergelijkbare objectieven kunnen worden vervangen. 40X objectieven kunnen worden gebruikt voor beeldvorming van enkele cellen.</td></tr><tr><td>Dissecting Stereoscope</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>Elk dissectiesteroscoop kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry transgenische Drosophila melagnogaster</td><td>Beschikbaar van Romero Lab</td><td></td><td>Eerste publicatie: Citatie 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Beschikbaar van Romero Lab</td><td></td><td>Eerste publicatie: Citatie 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Beschikbaar van Romero Lab</td><td></td><td>Eerste publicatie: Citatie 2</td></tr><tr><td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>Exact merk en model kunnen variëren, kan worden vervangen door elke monochrome hoge gevoeligheidscamera die geschikt is voor live cellulaire beeldvorming.</td></tr><tr><td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Elke GFP/FITC filter set kan worden vervangen.</td></tr><tr><td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>Elke GFP/FITC filter set kan worden vervangen.</td></tr><tr><td>Inverted Epifluoescent Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Elk vergelijkbaar microscoop met gemotoriseerde filterswitching kan worden gebruikt. Rechtopstaande microscopen kunnen worden gebruikt met open perfusiebaden en water-immersie-objectieven.</td></tr><tr><td>Statistische analysesoftware</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Elke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Elke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Beeldverwervingssoftware</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Elke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen</td></tr><tr><td>Eénzijdig koolstofstaal scheermes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71960</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Microscoopslide map</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Bunsen-brander</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Polystrene Drosophila-kweekbuisjes met vleugels</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Vergelijkbare items kunnen worden vervangen.</td></tr><tr><td>2,5 L laboratorium ijsemmer</td>

optische kwantificering van intracellulaire ph in drosophila melanogaster malpighian zaadvormende epithelen met een ph van fluorescerende genetisch-gecodeerde indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epitheliale ion vervoer is essentieel voor systemische ion homeostase evenals onderhoud van essentiële cellulaire elektrochemische verlopen. Intracellulaire pH (pHik) wordt beïnvloed door vele ion vervoerders en dus controle pHik is een nuttig instrument voor de beoordeling van de activiteit van de vervoerder. Moderne genetisch gecodeerd pH-indicatoren (GEpHIs) een optische kwantificering pHik in onbeschadigde cellen op een cellulaire en subcellular schaal. Dit protocol beschrijft real-time kwantificering van cellulaire pHik regulering in Malpighian tubuli (MTs) van Drosophila melanogaster via ex vivo wonen-imaging van pHerry, een pseudo-ratiometric-GEpHI met een pKeen geschikt voor pH wijzigingen bijhouden in het cytosol. Uitgepakte volwassen vliegen MTs zijn samengesteld uit morfologisch en functioneel verschillende secties van eencellige laag epitheel, en kunnen dienen als een model voor toegankelijk en genetisch hanteerbare voor onderzoek van epitheliale vervoer. GEpHIs bieden verschillende voordelen ten opzichte conventionele pH-gevoelige fluorescente kleurstoffen en ion-Ionselectieve electroden. GEpHIs kan verschillende cel populaties label mits passende promotor elementen beschikbaar zijn. Deze etikettering is vooral handig in ex vivo, in vivoen in situ preparaten, die intrinsiek heterogeen. GEpHIs ook de kwantificering van pHi in intact weefsels na verloop van tijd zonder de behoefte aan herhaalde kleurstof behandeling of weefsel externalization toestaan. Het primaire nadeel van de huidige GEpHIs is de neiging om aggregaat in cytosolische inclusies in reactie op weefselbeschadiging en overmatige expressie op te bouwen. Deze tekortkomingen, hun oplossingen, en de inherente voordelen van GEpHIs zijn in dit protocol door evaluatie van de basolaterale proton (H+) vervoer in functioneel verschillende hoofd- en Notti cellen van uitgepakte vlieg MTs gedemonstreerd. De technieken en analyse beschreven zijn gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala aan gewervelde en ongewervelde preparaten, en de verfijning van de bepaling van het onderwijs labs voor ingewikkelde bepaling van ion flux via specifieke vervoerders kan worden geschaald.

Gezonde weefsels en correcte identificatie van anterior MTs zijn essentieel voor het succes van dit protocol. Tijdens de dissectie, moet worden gewaakt om niet direct touch de MTs en enige greep zal hen door de ureter als aangrijpend de MTs rechtstreeks leiden tot breuk (figuur 4Avan- B). Bij MTs zijn geveegd plat op de dia, de tubuli moeten zo weinig mogelijk worden aangeraakt en overtollige beweging vermeden als dit zal sc...

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Het algemene doel van dit beeldvormingsprotocol is om de kwantificering van de intracellulaire pH te beschrijven met behulp van een genetisch gecodeerde pH-indicator en om aan te tonen hoe deze methode kan worden gebruikt om het basolaterale protonentransport in een insectenmodel van een renale structuur, de malpighische buisjes, te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van cellulair transport, zoals de manier waarop specifieke transporteiwitten bijdragen aan de epitheliale protonenverplaatsing bij de regulatie van de intracellulaire pH. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellulair transport snel en gemakkelijk kan worden beoordeeld over meerdere functioneel verschillende zones van intact epitheel.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de pH-regulatie en het insectenepitheel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het mammale nefron en epitheelcellen in cultuur. Om deze procedure te starten, plaatst u twee sets soldeerhulpen met klemmen op de tafel van de beeldvormingsmicroscoop, met één klem aan elke zijde. Plaats vervolgens de respectievelijke gebogen glazen capillairen, de instroomlijn en de vacuümverbonden uitstroomlijn.Monteer ze vervolgens in de hulphanden en richt ze uit met de beeldvormingstabel van de microscoop. Breng vacuümvet aan op de plafondtape en druk de adhesieve perfusieput-scheider op de tape om de onderkant met vet te coaten. Trek de adhesieve perfusieput-scheider los en plaats deze met de vetzijde naar beneden op een met poly-L-lysine gecoate objectglas.Verwijder vervolgens de verdeling van de perfusieputjes, zodat er individuele specifieke putjes overblijven die zijn afgetekend met hydrofoob vet. Plaats daarna 200 µL IPBS bij kamertemperatuur (insect phosphate buffer saline) in het vetom圈de putje op de met poly-L-lysine gecoate slide. Plaats de slide vervolgens onder het stereomicroscoop, giet ijskoud Schneider's medium in de dissectieschaal en breng één enkel geanestheseerde vrouwelijke vlieg hierin over.Houd de vlieg bij het thorax vast met een pincet en gebruik het andere pincet om het achterste gedeelte van het abdomen voorzichtig vast te pakken. Trek het achterste uiteinde van de vlieg open met korte, bewuste bewegingen. Zodra de hind gut zichtbaar is, pak dan het distale uiteinde vast en maak de darm en antes los van de onderliggende tracheales door de hind gut met herhaalde korte rukjes van het lichaam weg te trekken.Knijp vervolgens met een fijne pincet de anterieure antes van de ureter af, zodra de tweede set antes is losgemaakt van het abdomen. Pak de vrije anterieure antes op met de glazen staaf door de staaf onder de ureter te schuiven, zodat de tubuli naar beide zijden vallen. Til de antes daarna recht omhoog uit de oplossing en draai vervolgens de glazen staaf zodanig dat de antes en de ureter aan de onderzijde van de staaf hechten.Laat de urineleider recht naar beneden op het objectglas zakken, fixeer de urineleider vervolgens en sluit de distale uiteinden van de antes af door de urineleider verder op het objectglas te drukken. Gebruik het fijne uiteinde van de glazen staaf om elke tubulus voorzichtig over het oppervlak van het objectglas te strijken. Laat de staaf over het objectglas scheren om te voorkomen dat de tubulus wordt geplet, en schuif de staaf over de bovenkant van de tubulus, bewegend van distaal naar proximaal, om de volledige lengte van elke tubulus aan het oppervlak van het met poly-L-lysine gecoate objectglas te bevestigen.Het succes van deze techniek hangt volledig af van de nauwkeurige identificatie en zorgvuldige behandeling van de anterieure malpighische buisjes. Beschadigde buisjes zullen inconsistente resultaten opleveren. Plaats vervolgens de klevende profusion-well-verdeler terug op de objectglas om een kleine, met vloeistof gevulde put boven het gemonteerde buisje te vormen.Plaats daarna het preparaat op de objecttafel van de microscoop. Positioneer de in- en uitstroomcapillairen respectievelijk boven de inlaat- en uitlaatopening van de perfusieput. Schakel bij deze procedure de microscoop, de lichtbron en het beeldvormingssysteem in en open vervolgens de beeldvormingssoftware.Kijk door de oculairs en stel de focus handmatig bij totdat het lumen van de antes duidelijk zichtbaar is onder het doorgelaat licht. Klik vervolgens op het tabblad acquisitie en selecteer 2x2 in het uitklapmenu voor dimmen, in het gedeelte voor acquisitielading. Plaats een neutraal dichtheidsfilter van 5% in de lichtweg om het verlichtingslicht te verminderen en fotobleking te minimaliseren.Klik in het kanalenmenu op het GFP-kanaal en klik vervolgens op 'live' om het fluorescentiesignaal via de camera te observeren. Pas daarna de tijdsregelaar aan om de belichtingstijd in te stellen, zodanig dat de helderste pixelwaarden in het intensiteitshistogram ongeveer 40% van de maximale waarde bedragen. Klik vervolgens op 'stop' om de belichting te beëindigen.Herhaal de procedures in het RFP-kanaal en bevestig de aanwezigheid van het gedilateerde initiële segment van de anterior ante en de afwezigheid van cytosolische mCherry-aggregaten, wat zou duiden op weefselbeschadiging of overexpressie. Schakel daarna een timelapse-beeldvormingsprotocol in door het selectievakje voor de tijdserie aan te vinken. Pas in het uitklapmenu in de sectie tijdserie de duur aan naar 10 minuten en zet de schuifregelaar voor het interval op nul, om de totale opnametijd met de maximale beeldacquisitie in te stellen.Vink vervolgens zowel de GFP- als de RFP-vakjes aan in het kanaalsectie. Open de IPBS-lijn van het profusiesysteem door de bijbehorende klepbesturing te activeren en start het beeldvormingsprotocol door op "experiment starten" te klikken. Schakel na één minuut gedurende 20 seconden over op de ammoniumchloride-nabewerkingsoplossing door de betreffende klep te openen en de IPBS-lijn te sluiten.Keer vervolgens terug naar IPBS door de ammoniumchloridelijn te sluiten en het IPBS-ventiel opnieuw te openen. Verwijder voor het uitvoeren van een twee-puntskalibratie de well-scheider door deze van de onderliggende slide af te pellen en verwijder de profusiecapillaren in klemmen uit de imaging well. Breng daarna 200 µL kalibratie-IPBS-buffer met een pH van 7.4 aan.Verwijder vervolgens de oplossing uit de beeldvoeringsput en vervang deze door nogmaals 200 microliters kalibratieoplossing. Herhaal dit proces vier keer om een volledige uitwisseling van de oplossing te garanderen. Incubeer daarna het preparaat en de kalibratieoplossing 30 minuten voordat u begint met het maken van beelden.Herhaal het beeldvormingsprotocol met dezelfde parameters als eerder bepaald, met als enige aanpassing een beeldvastlegging van één minuut. Voeg vervolgens 200 µL kalibratie-IPBS-buffer bij pH 9 toe. Verwijder de oplossing uit de beeldvormingskuil en vervang deze door nog eens 200 µL kalibratieoplossing.Incubeer de preparatie vervolgens 10 minuten in de tweede kalibratieoplossing voordat u de beelden vastlegt en herhaal het beeldvormingsprotocol. Beoordeel daarna de vastgelegde beeldenstapel in de software voor beeldanalyse om te bevestigen dat er in geen van beide kanalen verzadigde pixels zijn door op MeanROI te klikken, en dat geen van de waarden in het intensiteitshistogram de maximale detecteerbare waarde heeft bereikt, terwijl u met de frame-schuifregelaar door de beeldenstapel scrolt. Analyseer vervolgens de beeldenstapel door de fluorescentie-intensiteit en de fluorescentieverhouding uit te zetten als functie van de tijd; hier zien we de verwachte fluorescentierespons op de ammoniumchloride-puls in de pH-gevoelige en pH-ongevoelige kanalen van de indicator.De verhouding tussen deze signalen onthult de transiënte intracellulaire pH. Om deze analyse uit te voeren, klikt u eerst op meanROI en selecteert u het free form-instrument. Houd de linkermuisknop ingedrukt om een MT van 50 micrometer te omtrekken en klik met de rechtermuisknop om het tekenen van de ROI te voltooien.Herhaal dit vervolgens in een gebied naast de MT om de achtergrond ROI te definiëren. Klik daarna onder metingen op gemiddelde intensiteit, en maak een tabel met intensiteitswaarden door te klikken op exporteren, datatabel, maken. Klik op het configuratie-icoon in de vorm van een tandwiel en deselecteer alle parameters, behalve tijd en gemiddelde intensiteit.Klik met de rechtermuisknop op het tabblad van de nieuw aangemaakte datatabel, selecteer 'opslaan als' en exporteer de gegevens als een csv-bestand. Hier wordt een wide-field afbeelding getoond van super-elliptische fluorine-fluorescentie in principecellen van de anterior ante en stellaire cellen van de anterior ante. Let op dat stellaire cellen staafvormig zijn in het initiële segment, variabel in het transitionele segment en duidelijke cellulaire projecties vertonen in het hoofdsegment.Deze grafiek toont de gekalibreerde intercellulaire pH-veranderingen in reactie op een puls van 20 seconden, 40 millimolair ammoniumchloride in de regio's van interesse. Gestreepte curven geven enkelvoudige exponentiële fits aan die zijn toegepast op de fase van zuurherstel, volgend op het wegnemen van ammoniumchloride. Hieruit zijn de vervalkonstanten afgeleid.Deze grafiek toont de zuurextrusiesnelheid uitgezet als functie van de intracellulaire pH en deze grafiek toont de zuurflux uitgezet als functie van de intracellulaire pH, afgeleid van de exponentiële fits uit de vorige figuur. Eenmaal beheerst, kan de extractie van de malpighische klierbuis binnen 10 minuten worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het succes volledig afhangt van de kwaliteit van de dissectie en de nauwkeurige kalibratie van de pH-indicator.Deze preparatie kan worden gecombineerd met andere genetisch gecodeerde biosensoren, zoals fluorescerende calcium- en halide-indicatoren, om de beweging van opgeloste stoffen en intracellulaire signalering in epitheelcellen te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gezonde Malpighische buisjes van drosophila prepareert, een genetisch gecodeerde pH-indicator afbeeldt en protonbeweging in epitheelcellen kwantificeert. Houd er rekening mee dat het werken met nitroizene gevaarlijk kan zijn en preparaties kan beschadigen; daarom moeten er bij het uitvoeren van deze procedure voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat apparatuur die hergebruikt moet worden, besmet raakt.

optical-quantification-intracellular-ph-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Dit artikel beschrijft de dissectie van de voorste Malinese tubuli (MT) van een vrouwelijke Drosophila-vlieg en een voorbeeldprotocol van Rossano et al. (2017) waarin de MT's worden voorbereid op live beeldvorming in een perfusiekamer.

Malpighian Tubule Dissectie van een Volwassen Vlieg: Het isoleren van een Osmoregulatory en Excretory Orgaan

This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Wij bieden een protocol voor imaging intracellulaire pH van een geslacht epitheliale cel van de stam in levende Drosophila eierstokweefsel. We beschrijven de methoden voor het genereren van transgene vliegen uiten een pH biosensor, mCherry::pHluorin, image de biosensor met behulp van kwantitatieve fluorescentie imaging, standaard curven genereren en fluorescentie intensiteitswaarden omzetten in pH-waarden.

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Leer de optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian tubuli met de genetisch-gecodeerde indicator pHerry. Deze methode meet basolateraal protontransport in intact epitheelweefsel.

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator (Video) | JoVE Journal

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Meer video's verkennen