Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis
3 augustus 2017
Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.
Het algemene doel van deze procedure is om epitheelcellen te isoleren uit de rattepididymis en de elektrische eigenschappen van deze primair gedissocieerde cellen te meten met behulp van de whole-cell patch-clamp-methode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van reproductieve biologie, zoals de functie van de epididymis, die belangrijk is voor de rijping van sperma en de overerving van vaderlijke eigenschappen. Deze techniek stelt de gebruiker in staat om de elektrische eigenschappen van geïsoleerde epididymale epitheelcellen te kauteren, zodat de onbekende fysiologische functie van deze cellen vervolgens kan worden geïllustreerd.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Bao Li Zhang, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium. Om de procedure te beginnen, desinfecteert u de dissectiewerktuigen door ze onder te dompelen in 70% ethanol. Laat ze vervolgens aan de lucht drogen.
Maak vervolgens de volledige IMDM klaar. Maak daarna aliquots van 50 ml in aseptische omstandigheden, verzegel met Parafilm en bewaar deze op vier graden Celsius. Bereid vervolgens een collageenzym-oplosmiddel voor door collageenase type I en collageenase type II op te lossen in RPMI, resulterend in één milligram per milliliter van elk collageenase in de oplossing.
Filter de oplossing door een 0,22 micrometer membraan. Markeer het vervolgens als collageenase-oplossing en bewaar de oplossing op kamertemperatuur tot gebruik. Pas vervolgens het volume van de enzymoplossing aan op basis van het gewicht van het enzym.
Het minimale volume dat vereist is voor beide cauda epididymides van een enkele rat is twee milliliter. Om de ratte cauda epididymides te dissecteren, offert u het dier op door natriumpentobarbital te gebruiken via IP-injectie of door een isofluraankamer te gebruiken totdat het dier niet meer reageert op staartprikstimulatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Desinfecteer vervolgens de onderbuik door deze af te vegen met 70% ethanol.
Duwt voorzichtig de twee testikels naar de onderbuik en open vervolgens de onderbuik nabij het scrotum. Verwijder vervolgens het epididymale vet en dissecteren alle voortplantingsorganen. Breng ze vervolgens over naar de schaal met RPMI.
In een schone, luchtstroom gecontroleerde werkruimte, dissecteren de cauda epididymides uit het bind- en vetweefsel en de epididymale capsule. Plaats een epididymis met 0,2 milliliter collageenase-oplossing in een buisje van 1,5 milliliter. Om enkele cellen van de cauda epididymides te dissociëren, snijdt u de epididymis in de collageenase-oplossing met fijne schaar totdat het weefsel een pasta-achtige vloeistof wordt.
Spoel vervolgens de schaar voorzichtig af met de rest van de enzymoplossing in het buisje. Plaats het buisje vervolgens op een metalen thermo-mixer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met een schudsnelheid van 1.000 tpm. Centrifugeer vervolgens het enzymweefselmengsel bij kamertemperatuur gedurende drie minuten.
Decanteer daarna de kleverige supernatant die voornamelijk sperma bevat. Resuspendeer vervolgens het pellet in één milliliter volledige IMDM om alle enzymatische activiteit te doven. Breng vervolgens de celsuspensie over in een buisje van 50 milliliter met 49 milliliter RPMI.
Centrifugeer de celmixtuur en decanteer de supernatant. Resuspendeer het pellet in één milliliter volledige IMDM met zachte trituratie gedurende ten minste vijf minuten om enkele cellen te dissociëren van de enzymatisch behandelde epididymale weefselmixtuur. Scheid de epitheelcellen van andere cellen onder aseptische omstandigheden en kweek de celsuspensie op een 10 centimeter Petri-schaal met volledige IMDM gedurende ten minste acht uur of overnacht in een incubator bij 32 graden Celsius.
De volgende ochtend, bereid de steriele dekselglasjes voor door ze onder te dompelen in 100% alcohol. Laat ze aan de lucht drogen en dompel ze vervolgens in een kleine hoeveelheid kweekmedium. Plaats vervolgens de dekselglasjes in zes centimeter kweekschalen of in enkele putjes van een 24-putjesplaat.
Verzamel nu de gedissocieerde epitheelcellen door voorzichtig het cellensuspensie van de Petri-schaal te verzamelen, die voornamelijk uit epitheelcellen bestaat. Centrifugeer de cellensuspensie bij 30 keer G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en decanteer vervolgens de supernatant. Resuspendeer vervolgens het cellenpellet in twee milliliter volledige IMDM.
Zaai 0,2 milliliter van de geoogste cellensuspensie op het centrum van elk steriele dekselglasje. Laat de cellensuspensie ten minste 10 minuten in de vloeistofdruppel bezinken om de cellen losjes aan de glazen dekselglasjes te laten hechten. Voeg vervolgens voorzichtig één milliliter volledige IMDM toe aan de rand van een zes centimeter schaal of 0,3 milliliter volledige IMDM in elke put van een 24-putjesplaat, zonder de cellen te verstoren.
Bewaar de geïsoleerde enkele cellen op dekselglasjes in de incubator bij 32 graden Celsius tot de patch-clamp-experimenten. Op de dag van het patch-clamp-experiment, ontdooi één aliquot van de intracellulaire oplossing op ijs en houd het gekoeld tijdens het patch-clamp-experiment om degradatie te voorkomen. Breng vervolgens de gekweekte epitheelcellen op het glazen dekselglasje over naar de opnamekamer gevuld met standaard PSS bij kamertemperatuur.
Verander voorzichtig de badende PSS ten minste twee keer met behulp van een pipet voordat u met patch-clamp-experimenten begint. Om de whole-cell configuratie te vestigen, dompelt u de pipet onder in de badoplossing met de hoogste snelheid van de micromanipulator. Zoek de pipettip op het scherm dat is verbonden met de digitale camera.
Verlaag vervolgens de snelheid van de micromanipulator naar de medium-hoge modus. Controleer snel de weerstand van de micropipet met behulp van de data-acquisitie-interface-opdracht door een spanningsstap toe te passen die is gegenereerd door de computergestuurde versterker. Vervang de micropipet als de weerstand significant buiten dit bereik ligt.
En stel het liquid junction potentiaal tussen de pipet en de badoplossing op nul met behulp van de pipetoffset-opdracht in de commander-interface van de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie van epitheelcellen uit de bijbal (epididymis) van de rat en het meten van hun elektrische eigenschappen met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek. Deze methode is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische rollen van deze cellen bij de rijping van sperma.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Reproductieve biologie
- Celphysiologie
Achtergrond
- De epididymis speelt een essentiële rol bij de rijping van sperma.
- Inzicht in de elektrische eigenschappen van epitheelcellen kan leiden tot een beter begrip van hun fysiologische functies.
- Deze studie maakt gebruik van whole-cell patch-clamp registratie om deze eigenschappen te onderzoeken.
- De isolatie van primaire cellen is noodzakelijk voor nauwkeurige metingen.
Doel van het onderzoek
- Om epitheelcellen uit de bijbalok van de rat te isoleren.
- Om de elektrische eigenschappen van deze cellen te meten.
- Om de fysiologische rol van de bijbalok in de reproductieve biologie te verhelderen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van primaire epitheelcellen uit de cauda epididymides van ratten.
- Whole-cell patch-clamp registratietechniek.
- Desinfectie van dissectie-instrumenten met 70% ethanol.
- Aan de lucht drogen van instrumenten voor gebruik.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van primaire epitheelcellen uit de epididymis.
- Meting van elektrische eigenschappen met behulp van de patch-clamptechniek.
- Inzichten in de fysiologische functies van deze cellen.
- Demonstratie van de procedure door een promovendus.
Conclusies
- Het protocol maakt een gedetailleerd onderzoek van epididymale epitheelcellen mogelijk.
- Inzicht in deze cellen draagt bij aan de kennis over de reproductieve biologie.
- Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de rijping van sperma.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Inzicht in de elektrofysiologische eigenschappen van epididymale epitheelcellen biedt mechanistische inzichten in de spermarijping en de reproductieve gezondheid, wat bijdraagt aan de validatie van targets in de reproductieve biologie. Whole-cell patch-clamp opnames van primaire geïsoleerde cellen maken een kwantitatieve beoordeling van de ionkanaalactiviteit en membraaneigenschappen mogelijk, wat de ontdekking van biomarkers en pathway-analyses faciliteert. Deze benadering helpt bij het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen door cellulaire fysiologie te koppelen aan functionele uitkomsten in de spermaontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de functie van epitheelcellen bij de rijping van sperma mogelijk door directe meting van elektrische eigenschappen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor het isoleren en karakteriseren van primaire epitheelcellen uit de cauda epididymides van ratten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het testen van hypothesen over de rol van ionkanalen bij de regulatie van de epididymale micro-omgeving.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Stelt een gestandaardiseerd protocol vast voor het voorbereiden van geïsoleerde epitheelcellen die geschikt zijn voor elektrofysiologische screening.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare parameters zoals de rustmembraanpotentiaal en stroom-spanningsrelaties voor comparatieve analyse.
- Reproduceerbaarheid: Bevat gedefinieerde stappen voor celisolatie, cultuur en patch-clamp opstelling om consistente resultaten over verschillende experimenten te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Verbindt de elektrofysiologie van epitheliale cellen met de rijping van zaadcellen, een sleutelproces in de reproductieve gezondheid.
- Mechanische risicoreductie: Maakt het mogelijk om te beoordelen hoe genetische of farmacologische verstoringen de functie van epitheliale cellen beïnvloeden.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de overgang van ontdekking naar preklinische modellen door cellulaire fenotypes in primair weefsel te valideren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in de discovery biology door functionele karakterisering van primaire epitheelcellen mogelijk te maken, wat bijdraagt aan targetselectie en pathway-validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar de bijdrage van ionkanalen aan de fysiologie van epididymale epitheelcellen.
- Analyse: Levert kwantitatieve elektrofysiologische resultaten op, zoals ingangsweerstand, seal-weerstand en stroomamplitudes onder voltage-clamp.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cellulaire elektrische eigenschappen met fysiologische functies die relevant zijn voor de rijping van sperma en de overdracht van vaderlijke eigenschappen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van de epitheelcelfunctie in reproductieve weefsels bij verschillende soorten of ziektemodellen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door directe metingen van de elektrische activiteit van epitheelcellen te verschaft.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerde, schaalbare workflow voor het isoleren van primaire cellen en het uitvoeren van patch-clamp-metingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie door elektrofysiologische fenotypes te koppelen aan biologische functies.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele gegevens van inheemse epitheelcellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celisolatie, enzymatische digestie en patch-clamp elektrofysiologie.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder een micromanipulator, versterker en gegevensacquisitiesysteem voor whole-cell registratie.
- Vereist aseptische technieken en gecontroleerde incubatie bij 32°C voor epitheelcelkweek.
- Omvat optimalisatie van de enzymconcentratie en de digestietijd om overdigestie te voorkomen en een opbrengst aan levensvatbare cellen te garanderen.
- Vereist zorgvuldige hantering om de integriteit van de seal te behouden en contaminatie tijdens overdracht naar de registratiekamer te vermijden.
