Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit
9 juni 2017
Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om neurale stamcellen, afgeleid van humane geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies, te differentiëren in gemengde culturen van neuronale en gliale cellen. Dit model is geschikt voor het screenen van geneesmiddelen en chemische toxiciteit. Dit in vitro-model kan worden toegepast voor het beoordelen van door chemicaliën geïnduceerde verstoringen van signaalroutes die worden geactiveerd tijdens het proces van neuronale en gliale differentiatie.
Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat het een humaan model gebruikt dat is afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen en dat een alternatief vormt voor traditioneel gebruikte kankercellen en primaire dierlijke culturen en het mogelijk maakt om neurotoxiciteit te bestuderen in een gemengde populatie van neuronale en gliale cellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Francesca Pistollato, onze post-doc, en Carolina Nunes, een afgestudeerde student van ons lab. Begin met het passeren van de hiPSC-kolonies.
Werk onder een stereoscopische microscoop bij een vergroting van vier X in een laminaire stroomkast, gebruik een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge. Snijd de stamcelkolonies in vierkanten van ongeveer 200 micrometer bij 200 micrometer. Het uitknippen van de kolonies vereist goede handmatige vaardigheden om fragmenten van gelijke grootte te verkrijgen.
Het gebruik van commercieel verkrijgbare snijgereedschappen kan helpen. Gebruik vervolgens een pipet van 200 microliter om de koloniefragmenten los te maken van het oppervlak van de schaal door voorzichtig te pipetten onder het medium om de stukken op te tillen. Breng ongeveer 100 koloniefragmenten over naar een gekwalificeerde matrix DMEM F12-gecoate 60 millimeter schaal gevuld met vier milliliter compleet hiPSC-medium.
Vervolgens incubeer de nieuwe schaal bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voer elke dag een totale mediumverversing uit en inspecteer de morfologie van de kolonies met behulp van een fasecontrastmicroscoop bij vier X en 10X vergroting. Op dag nul van de differentiatieprocedure ververst u het hiPSC-medium door drie milliliter medium toe te voegen per 60 millimeter petrischaal.
Snijd en demonteer vervolgens de fragmenten van 200 micrometer zoals eerder. Pipet de losgemaakte fragmenten en het medium in een buis van 15 milliliter. Spoel de schaal met twee milliliter compleet hiPSC-medium en herstel alle fragmenten.
Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 112 keer G. Na centrifugatie aspireert u het supernatant en suspendeert u de fragmenten voorzichtig in vijf milliliter compleet hiPSC EB-medium. Plateer het volledige volume in een 60 millimeter ultra laag aanhechtings weefselkweekschaal.
Incubeer de schaal een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag controleert u de cellen met de omgekeerde microscoop. De embryoïde lichamen op dag één zouden er rond en onderling verschillend uit moeten zien zoals hier te zien is.
Pipet vervolgens de embryoïde lichamen en het medium uit de schaal en breng ze over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de embryoïde lichamen gedurende één minuut bij 112 keer G. Op dag twee aspireert u de standaard matrix coating oplossing uit een eerder voorbereide 60 millimeter schaal en voegt u vijf milliliter compleet neuroepitheliale inductiemedium, of NRI, toe aan de schaal.
Werk onder de stereoscopische microscoop bij een vergroting van vier X en gebruik een pipet van 200 microliter om ongeveer 50 zwevende embryoïde lichamen te verzamelen en over te brengen naar een gecoate schaal. Vervolgens incubeer de schaal bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag, dag drie van de differentiatieprocedure, controleert u de schaal onder de microscoop bij 10X vergroting om ervoor te zorgen dat de embryoïde lichamen allemaal zijn bevestigd.
Voer vervolgens voorzichtig een totale mediumverversing uit met compleet NRI-medium. Ververs het NRI-medium om de andere dag tot dag zeven wanneer roosvormige neuroepitheliale aggregaten zichtbaar zouden moeten zijn. Op dag zeven bekleedt u een 96-well plate door 100 microliter standaard matrix gediluteerd in kweekmedium in elke put te pipetten.
Op dag acht snijdt u de roosvormige aggregaten in fragmenten onder een stereoscopische microscoop bij 10X vergroting in steriele omstandigheden. Merk op dat de roosjes zich gemakkelijk losmaken van de schaal wanneer ze worden aangeraakt met de naald. In dit geval, disaggregeer de losgemaakte roosjes gedeeltelijk met de naaldpunt.
Als de roosjes gedeeltelijk bevestigd blijven, gebruik dan een pipet van 200 microliter om de afscheiding van de roosjes te voltooien. Roosjes vereisen goede handmatige vaardigheden en precisie om te voorkomen dat er geen neurexitodermale derivaten worden gesneden. Verzamel vervolgens de roosjesfragmenten en hun medium in een kegelbuis van 15 milliliter.
Spoel de schaal met twee milliliter NRI-medium om alle fragmenten te herstellen. Centrifugeer vervolgens de roosjesfragmenten gedurende één of twee minuten bij 112 keer G. Na het aspireren van het supernatant, suspendeert u het pellet voorzichtig in één milliliter voorverwarmde een X DPBS zonder calcium en magnesium.
Pipet voorzichtig de roosjesfragmenten op en neer om ze gedeeltelijk te disaggregeren. Voeg vervolgens vier milliliter compleet NRI-medium toe en tel de cellen met behulp van trypanblauw en een geautomatiseerde celteller. Aspireer vervolgens de standaard matrix coating oplossing uit de 96-well plate en deponeer de cellen in de putjes met een dichtheid van ongeveer 15.000 cellen per vierkante centimeter in NRI-medium.
Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Op dag 10 voert u een totale mediumverversing uit met compleet neuronaal differentiatiemedium. Deze representatieve afbeelding toont roosjes na 12 dagen in vitro gekleurd voor nestine in groen en beta drie tubuline in rood.
Hier zijn cellen die 28 dagen in vitro zijn gekweekt gekleurd voor beta drie tubuline in rood en NF200 in groen. Deze representatieve afbeelding toont neuronale cellen gedifferentieerd
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het differentiëren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) in gemengde culturen van neuronale en gliale cellen. Dit in vitro model is bijzonder nuttig voor het screenen van geneesmiddelen en chemische toxiciteit, inclusief neurotoxiciteitsbeoordelingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcellenbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) zijn een veelzijdig hulpmiddel voor het modelleren van menselijke ziekten.
- Ze bieden een alternatief voor traditionele kankercellijnen en diermodellen.
- Het begrijpen van neurotoxiciteit is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en veiligheidstesten.
- Dit protocol heeft als doel een gemengde cultuur van neuronen en gliale cellen te creëren voor onderzoeksdoeleinden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar in vitro model te vestigen voor het beoordelen van neurotoxiciteit.
- Om hiPSC's effectief in neuronale en gliale cellen te differentiëren.
- Om geneesmiddelen en chemisch screening te faciliteren met behulp van humaan-afgeleide cellen.
Gebruikte methoden
- Het passeren van hiPSC-kolonies en het voorbereiden voor differentiatie.
- Het gebruik van specifiek medium voor neuroepitheliale inductie en neuronale differentiatie.
- Het gebruik van microscopie om de celmorfologie en differentiatievoortgang te controleren.
- Het kwantificeren van gedifferentieerde celtypen met behulp van immunokleuringstechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van hiPSC's in neuronale en gliale cellen werd bereikt.
- Er werden duidelijke morfologische veranderingen waargenomen tijdens het differentiatieproces.
- Kwantitatieve analyse toonde de aanwezigheid van verschillende neuronale markers aan.
- Het model toonde potentieel voor toepassingen in toxiciteitsscreening.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor het genereren van gemengde neuronale en gliale culturen van hiPSC's.
- Het ontwikkelde model kan worden gebruikt voor het bestuderen van neurotoxiciteit en geneesmiddeleffecten.
- Toekomstige studies kunnen dit model uitbreiden om verschillende neurotoxische agentia te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables the generation of human-derived mixed neuronal and glial cultures from hiPSCs, providing a physiologically relevant in vitro system for neurotoxicity testing. By modeling human-specific pathway perturbations—such as Nrf2 activation in response to mitochondrial inhibitors like rotenone—the assay supports mechanistic de-risking in early discovery. The system aligns with pathway-based toxicity paradigms, improving predictive confidence for chemical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing chemical perturbation of differentiation-associated signaling pathways.
- Operational Value: Provides a renewable human cell source that reduces reliance on animal models and cancer cell lines for target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable outputs (e.g., marker expression via immunostaining, qPCR) for screening compound effects on neuronal and glial phenotypes.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined differentiation stages and reproducible morphometric readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by modeling human neuroglial interactions and pathway-level responses to toxicants.
- Operational Value: Enables continuity in testing cascades from hit identification to lead optimization using a consistent human-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling downstream lead identification via pathway-specific readouts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on neurotoxic mechanisms by monitoring glial and neuronal marker dynamics during differentiation.
- Screening: Delivers assay-ready mixed cultures with defined neuronal (e.g., βIII-tubulin, NF200) and glial (e.g., GFAP) populations for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative data (e.g., marker-positive cell counts, pathway activation) to compare treatment conditions and assess biological relevance.
- Translational Research: Models human neuroglial co-culture responses, supporting extrapolation to preclinical safety profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, bankable differentiation protocol applicable across multiple neurotoxicant screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurotoxicity pathways through human-relevant models.
- Operational Value: Promotes reproducibility via standardized fragmentation, plating, and medium transition steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early insight into pathway-based liabilities, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to perturb conserved neurodifferentiation signaling cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, sterile technique, and microscopy-based morphology assessment.
- Dependent on access to defined media (hiPSC, NRI, neuronal differentiation), extracellular matrix coatings, and low-attachment cultureware.
- Necessitates cross-team standardization for fragment size, plating density, and differentiation timing to ensure batch consistency.
- Adaptation to alternative hiPSC lines may require optimization of dissociation and plating parameters.
- Practical limitations include manual dexterity demands during colony cutting and rosette fragmentation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Expansion
7:53
Conclusion
6:36
Results: Differentiation of IMR90-hiPSCs into Mixed Cultures of Neurons and Glia
2:20
HiPSC Differentiation into Mixed Neurons and Glia: Generation of Embryoid Bodies
3:41
Generation of Neuropithelial Aggragates
4:53
Aggregate Dissociation and Neuronal Differentiation
