Name: Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Leer hoe je humane geïnduceerde pluripotente stamcellen differentieert naar gemengde culturen van neuronen en glia. Dit protocol biedt een betrouwbaar in vitro model voor neurotoxiciteitstesten en geneesmiddelscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrijk) bedanken voor de IMR90-hiPSC&#39;s; Dr. Giovanna Lazzari en Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italië); Dr. Simone Haupt (Universiteit van Bonn, Duitsland); Dr. Tiziana Santini (Italiaans Instituut voor Technologie, Rome), voor het verstrekken van advies over immunofluorescentiefleuring evaluatie; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo en Dr. Luca Persano (Universiteit van Padua, Italië) voor hun bijdragen aan de RPPA analyse en antilichaam validatie. Financiering: dit werk werd ondersteund door het door de EU gefinancierde project &quot;SCR &amp; Tox&quot; (subsidieovereenkomst nr. 266753).

<ol><li>NRC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+possibilities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li>
<li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity%3A+effects+of+CREB+pathway+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li>
<li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from:
	 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li>
<li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552(2010).</li>
<li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li>
<li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li>
<li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2+cell+defence+pathway%3A+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li>
<li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2%2FARE+Pathway%3A+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082(2011).</li>
<li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Nrf2%2Fsmall+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2%2FARE+pathway+activation%2C+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K%2FAKT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li>
<li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li>
<li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li>
<li>Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm">http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm</a> (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li>
<li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495(2015).</li>
<li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li>
<li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273(2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853(2010).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+MPP%2B+toxicity+and+GDNF+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li>
<li>Urbán, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain%3A+same+regulators%2C+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396(2014).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li>
<li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li>
<li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functions+in+astrocytes%3A+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li>
<li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation%3A+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li>
<li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+toxicology%3A+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit werk beschrijft een robuust en relatief snel protocol voor de differentiatie van IMR90-hiPSC&#39;s in postmittotische neuronen en glialcellen. Voorheen gepubliceerde neuronale differentiatieprotocollen op basis van hESCs en hiPSCs geven gewoonlijk hoge percentages neurale precursors 25 , 26 en een significant aantal neuronale doelcellen 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analoog is het hier beschreven hier beschreven differentiatieprotocol geschikt om heterogene kulturen van GABAergische, glutamatergische en dopaminergische neuronale cellen te genereren, samen met glia en een discreet aandeel van nestin + cellen. De aanwezigheid van glutamatergische (~ 35-42%) en GABAergic (~ 15-20%) neurale cellen suggereert datDeze cultuur bezit voorhoofd, corticale eigenschappen, en de aanwezigheid van een discreet aantal dopaminerge neuronen (~ 13-20%) kan ook de middelste hersenen specificiteit aanduiden. Bovendien kan de duur van een bescheiden deel van nestin + cellen blijken geschikt te zijn voor de studie van neurogenese en de mogelijke effecten van chemicaliën op NSC&#39;s, die hoofdzakelijk beperkt zijn tot zowel de hippocampus als de subventriculaire zone (SVZ) van het voorhoofd 34 . Verdere immunocytochemische en genexpressie-analyses zouden helpen om de regionale specificiteit van de gedifferentieerde celderivaten beter te definiëren. De twee meest kritische stappen in het differentiatieprotocol beschreven in dit document zijn: (i) het snijden van hiPSC-kolonies in homogene fragmenten (die van cruciaal belang is voor de generatie van EB&#39;s met homogene afmetingen) en (ii) het snijden van neuroectodermale structuren (rozetten ) Voor NSC-differentiatie, die een aanzienlijke handvaardigheid vereistEn precisie om te voorkomen dat mesodermale en endodermale cellen worden verzameld die de verhoudingen van neuronen en glialcellen die worden verkregen bij differentiatie, kunnen verminderen. Het is van cruciaal belang om de fenotypen van de cellen tijdens expansie te karakteriseren (als ongedifferentieerde kolonies of NSC&#39;s) en tijdens alle differentiatie stappen. In het bijzonder zouden de gen- en eiwituitdrukkingsprofielen van de neuronale / gliale celderivaten upregulatie en activatie van neurongerelateerde signaleringswegen moeten tonen, terwijl de expressie van pluripotentiemarkers moet worden verlaagd. De generatie van EB&#39;s en neuroectodermale derivaten (rozetten) kan manueel uitdagend en vatbaar zijn voor variabiliteit. Om deze reden hebben we een protocol ontwikkeld voor de uitbreiding van rosette-afgeleide NSC&#39;s en hun verdere differentiatie in neuronale / gliale cellen. Mogelijke beperkingen van dit differentiatieprotocol zijn voornamelijk (i) het relatief lage percentage dGerelateerde glialderivaten en (ii) het gebrek aan volwassen neuronale netwerkfuncties (zoals blijkt uit het gebrek aan barsten). Bovendien kunnen specifieke subpopulaties van astrocyten functioneren als primaire stamvogens of NSC&#39;s 35 . Terwijl nestine / GFAP dubbel-positieve cellen niet in deze gedifferentieerde celkweek werden waargenomen (data niet getoond), wordt verondersteld dat de GFAP + -cellen in deze gemengde culturen astrocytische stamvaders en astrocyten zijn. Het is aannemelijk dat door het verlengen van de tijd van differentiatie het aantal astrocyten kunnen toenemen, en hun morfologie kan volwassen worden, zoals reeds aangegeven door de vorige werken van Zhang&#39;s groep 36 , 37 . In het nieuwe toxiciteits testparadigma is kennis over chemisch geïnduceerde verstoringen van biologische wegen van het grootste belang bij het beoordelen van chemische tegenstrijdigheid. Daarom moeten in vitro testsystemen kunnenNegatieve effecten op versteurings van signaalwegen veroorzaken, volgens het concept van de ongunstige uitkomstweg (AOP). Als bewijs van concept kan rotenon gebruikt worden om de activatie van de Nrf2-weg te beoordelen, die betrokken is bij de cellulaire verdediging tegen oxidatieve of elektrofile stress 38 en oxidatieve stress is een belangrijk en algemeen belangrijk gebeurtenis in verschillende AOP&#39;s die relevant zijn voor Ontwikkelings- en volwassen neurotoxiciteit 39 . Rotenon zou de activatie van de Nrf2-weg moeten ontlokken, die kan worden aangetoond door Nrf2 proteïne nucleaire translocatie en verhoogde expressie van Nrf2-doel enzymen, waaronder NQO1 en SRXN1. Er is gebleken dat rotenon een dosisafhankelijke toename van GFAP-eiwitgehalten induceert, indicatief voor astrocytactivering 40 , 41 . Rotenon vermindert ook het aantal dopaminerge (TH + ) cellen, die in overeenstemming is met previIn vitro en in vivo onderzoeken die rotenonafhankelijke dopaminergische celdood zien, aangezien dit type neuron bijzonder gevoelig is voor oxidatieve stress 21 , 22 , 23 . Ten slotte is dit hiPSC-afgeleide neuronale en gliale celcultuurmodel een waardevol hulpmiddel om de neurotoxische effecten van chemicaliën die oxidatieve stress oplevert, te leiden tot de activering van Nrf2-pathologie. Aangezien dit differentiatieprotocol zorgt voor de opwekking van gemengde culturen van neuronale cellen (GABAergische, dopaminergische en glutamatergische neuronen) en astrocyten, kan het wellicht geschikt zijn om de kruisvorming tussen neuronen en glia in fysiologische en pathologische aandoeningen te bestuderen, zoals bij neurodegeneratieve ziekten ( Bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson). Bovendien kan de aanwezigheid van een significant deel van NSC&#39;s helpen bij het beoordelen van de mogelijke effecten van chemicaliën op neurale progEnitors, die bekend zijn als het hoofddoel van chemisch geïnduceerde mutaties of virale infecties 42 .

Het rapport van de nationale onderzoeksraad van de VS 1 beschouwde een nieuw toxiciteits testparadigma waarin regulatoire toxiciteitstesten verschoven zouden worden van een aanpak die afhankelijk is van fenotypische veranderingen waargenomen bij dieren, naar een aanpak die zich concentreert op mechanistische in vitro analyses met behulp van menselijke cellen. Pluripotente stamcellen (PSC) derivaten kunnen alternatieven voor kankercelmodellen vertegenwoordigen, aangezien de verkregen cellen meer lijken op de fysiologische omstandigheden van menselijk weefsel en meer relevante hulpmiddelen bieden om chemisch geïnduceerde nadelige effecten te bestuderen. De twee belangrijkste soorten PSC-culturen die het meestbelovend zijn voor toxiciteitstesten zijn menselijke embryonale stamcellen (hESC&#39;s) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC&#39;s), die op dit moment veel gebruikt worden op het gebied van basisonderzoek en regeneratieve geneeskunde 2 , 3 . Deze expertise kan nu worden gebruikt voor de ontwikkeling van een nieuwe klasse toxicoloIn vitro onderzoeken gericht op het identificeren van de verstoorde fysiologische pathways die betrokken zijn bij de ontwikkeling van bijwerkingen in vivo . Testmethoden voor regelgevende veiligheidsbeoordelingen op basis van hESC&#39;s zouden echter onwaarschijnlijk door alle EU-lidstaten en landen wereldwijd worden aanvaard wegens mogelijke ethische problemen en diverse nationale wetgevingsbeleid die het gebruik van embryo-afgeleide cellen regelt. HiPSCs delen kenmerken vergelijkbaar met hESCs 4 , 5 en hebben een groot potentieel voor in vitro methoden, zowel ter identificatie van therapeutische doelen als voor veiligheidsbeoordelingen. Daarnaast vermindert hiPSC-technologie de beperkingen van een beperkt donorpool en de ethische problemen die verband houden met embryo afgeleide cellen. Een belangrijke uitdaging voor hiPSCs is de demonstratie dat deze cellen reproduceerbaar een significant aantal toxicologisch relevante cellederivaten kunnen genereren,Met kenmerken en reacties die typerend zijn voor menselijke weefsels. Vooraf gedefinieerde niveaus van de geselecteerde markers worden meestal gebruikt om celbevolkingen na het differentiatieproces te karakteriseren en inzicht te geven in de stabiliteit van het differentiatieproces. Eerdere werken hebben de geschiktheid van hiPSCs geëvalueerd om gemengde culturen van neuronale en gliale cellen te genereren en de effecten van rotenon, een remmer van mitochondriale ademhalingskomplex I, te beoordelen bij de activatie van het Nrf2-pad, een belangrijke regelaar voor anti-oxidantverdedigingsmechanismen in Veel celtypes 6 , 7 . Dit werk beschrijft een protocol dat wordt gebruikt voor de differentiatie van hiPSC&#39;s in gemengde neuronale en gliale culturen, waarbij details worden gegeven over de signaalwegen (gen- en eiwitniveau) die geactiveerd worden bij neuronale / gliale differentiatie. Bovendien toont het werk representatieve resultaten die aantonen hoe ditHiPSC-afgeleide neuronale en gliale celmodellen kunnen gebruikt worden om Nrf2-signaleringsactivatie geïnduceerd door acute (24-h) behandeling met rotenon te beoordelen, zodat de oxidatieve stressinductie kan worden beoordeeld. IMR90 fibroblasten werden opnieuw in de hiPSCs bij I-Stem (Frankrijk) geprogrammeerd door de virale transductie van 2 transcriptiefactoren (Oct4 en Sox2) onder gebruikmaking van pMIG vectoren 6 . Analoge hiPSC modellen kunnen ook worden toegepast. De hieronder beschreven protocollen samenvatten alle fasen van differentiatie van hiPSCs in neurale stamcellen (NSC&#39;s) en verder in gemengde culturen van post-mitotische neuronen en gliale cellen (stap 1 en 2, zie ook de EURL ECVAM DBALM website voor een gedetailleerde beschrijving van Het protocol) 8 . Een extra protocol voor de isolatie, uitbreiding, cryopreservering en verdere differentiatie van NSC&#39;s in gemengde neuronen en glialcellen wordt gedetailleerd beschreven in stap 3 en 4 (verwijzen ook naar de EURL ECVAM DBALM weBsite voor een gedetailleerde beschrijving van dit protocol) 9 . Stap 5 beschrijft de analyses die kunnen worden gedaan om de fenotypische identiteit van de cellen te beoordelen tijdens de verschillende fasen van inzet en differentiatie.

<table><tbody><tr><td>Complete hiPSC medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05851</td><td>(Stap 1.2.6). Complete mTeSR1 is stabiel wanneer bewaard bij 2 - 8 &deg;C gedurende maximaal 2 weken. 5x Supplements kunnen worden verdeeld in werkende aliquots en bewaard bij -20 &deg;C. Gevroren aliquots binnen 3 maanden gebruiken.</td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Supplements</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05852</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>1:100 (Stap 1.1). Ontdooi Matrigel op ijs, bereid 200 &mu;L aliquots voor en bewaar deze in -80 &deg;C. Voor coating, verdun 200 &mu;L aliquot in 20 mL van DMEM/F12 medium.</td></tr><tr><td>CryoStem Freezing Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0013-50</td><td>Vries ~ 100 fragmenten/250 &mu;L/vial (Stap 1.2.1)</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>hiPSC EB medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10829-018</td><td>(Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KOSR)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10828-028</td><td>20% uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>(Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM Solution</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2 mM uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31350-010</td><td>50 &micro;M uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Complete neuroepithelial inductiemedium (NRI):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td><td>(Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>(Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>(Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>Heparine Grade I-A, &ge;180 USP eenheden/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &micro;g/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>20 ng/mL uiteindelijke concentratie toegevoegd voor gebruik (Stap 2.3.1)</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>1:100 (Stap 2.2). Ontdooi Matrigel op ijs, bereid 200 &mu;L aliquots voor en bewaar deze in -80 &deg;C. Voor coating, verdun 200 &mu;L aliquot in 20 mL van koud DMEM/F12 medium.</td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>1:100 (Stap 2.2). Verdun in PBS 1x.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Complete Neuronal Differentiatiemedium (ND):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21103049</td><td>(Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>B-27 Supplements (50x)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>(Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>(Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7045</td><td>1 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik. (Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7074</td><td>2.5 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik. (Stap 2.4.11)</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Neural inductiemedium (NI):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td><td>(Stap 3.3)</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>(Stap 3.3)</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>(Stap 3.3)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)</td></tr><tr><td>Heparine Grade I-A, &ge;180 USP eenheden/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &micro;g/mL uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamine A</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12587010</td><td>(Stap 3.3)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM Solution</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2 mM uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>10 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik (Stap 3

protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Menselijke pluripotente stamcellen kunnen onderscheiden in verschillende celsoorten die toegepast kunnen worden op in vitro toxiciteitsbepalingen op humane wijze. Een belangrijk voordeel is dat de herprogrammering van somatische cellen om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC&#39;s) te produceren, de ethische en wetgevende problemen in verband met het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESC&#39;s) vermijdt. HiPSCs kunnen uitgebreid worden en efficiënt gedifferentieerd worden in verschillende soorten neuronale en gliale cellen, die dienen als testsystemen voor toxiciteitstesten en in het bijzonder voor de beoordeling van verschillende pathways betrokken bij neurotoxiciteit. Dit werk beschrijft een protocol voor de differentiatie van hiPSCs in gemengde culturen van neuronale en gliale cellen. De signaalwegen die zijn gereguleerd en / of geactiveerd door neuronale differentiatie worden gedefinieerd. Deze informatie is van cruciaal belang voor de toepassing van het celmodel op het nieuwe toxiciteits testparadigma, waarin chemicaliën worden beoordeeld op basis van hun vermogen om te pezenRturb biologische wegen. Als bewijs van het concept werd rotenon, een remmer van mitochondriale ademhalingskomplex I, gebruikt om de activatie van de Nrf2-signaleringsweg te beoordelen, een sleutelregelaar van het anti-oxidant-respons-element (ARE) -gedreven celverdedigingsmechanisme tegen oxidatieve stress .

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Het algemene doel van deze procedure is om neurale stamcellen, afgeleid van kolonies van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, te differentiëren tot gemengde culturen van neuronale en gliale cellen. Dit model is geschikt voor screening op drug- en chemische toxiciteit. Dit in vitro-model kan worden toegepast voor het beoordelen van chemisch geïnduceerde verstoringen van signaleringspaden die worden geactiveerd tijdens het proces van neuronale en gliale differentiatie.Het belangrijkste voordeel van dit systeem is het gebruik van een menselijk model afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen, dat een alternatief biedt voor traditioneel gebruikte kankercellen en primaire dierkleuren en het mogelijk maakt om neurotoxiciteit te bestuderen in een gemengde populatie van neuronale en gliale cellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Francesca Pistollato, onze postdoc, en Carolina Nunes, een promovendus uit ons laboratorium. Begin met het passeren van de hiPSC-koloniën.Werk onder een stereomicroscoop met een 4x vergroting in een laminaire flowkast en gebruik een spuit van 1 mL met een naald van 30 gauge. Snijd de stamcelkolonies in vierkantjes van ongeveer 200 microns bij 200 microns. Het uitsnijden van de kolonies vereist een goede handvaardigheid om fragmenten van gelijke grootte te verkrijgen.Het gebruik van commercieel verkrijgbare snijhulpmiddelen kan helpen. Gebruik vervolgens een pipette van 200 µL om de koloniefragmenten van het oppervlak van de schaal te scheiden door voorzichtig het medium eronder te pipetteren om de stukjes op te tillen. Breng ongeveer 100 koloniefragmenten over naar een geschikte, met DMEM F12 gecoate schaal van 60 mm, gevuld met vier milliliter compleet hiPSC-medium.Incubeer de nieuwe schaal vervolgens bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Voer elke dag een volledige mediumverversing uit en inspecteer de morfologie van de kolonies met een fasecontrastmicroscoop bij een vergroting van 4X en 10X. Voeg op dag nul van de differentiatieprocedure drie milliliter medium per petrischaal van 60 mm toe om het hiPSC-medium te verversen.Snijd vervolgens de fragmenten van 200 micron uit en detach deze zoals eerder beschreven. Pipetteer de gedetacheerde fragmenten en het medium in een buis van 15 milliliter. Spoel de schaal met twee milliliter compleet hiPSC-medium en verzamel alle fragmenten.Centrifuge vervolgens 1 minuut bij 112 ×g. Aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de fragmenten voorzichtig in vijf milliliter volledig hiPSC EB-medium. Plaats het volledige volume in een 60 millimeter ultra-low attachment weefselkweekschaal.Incubeer de schaal gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Controleer de volgende dag de cellen met de omgekeerde microscoop. De embryoid bodies van dag één moeten er rond uitzien en duidelijk van elkaar gescheiden zijn, zoals hier te zien is.Pipette vervolgens de embryoïde lichamen en het medium uit de schaal en breng deze over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de embryoïde lichamen bij 112 ×g gedurende één minuut. Zuig op dag twee de standaard matrix-coatingsoplossing uit een eerder voorbereide schaal van 60 millimeter en voeg vijf milliliter compleet neuro-epitheliaal inductiemedium, of NRI, toe aan de schaal.Verzamel onder een stereomicroscoop bij een 4X vergroting met een pipet van 200 µL ongeveer 50 drijvende embryoid bodies en breng deze over naar één gecoate schaal. Incubeer de schaal vervolgens bij 37 °C en 5% CO2. Controleer de volgende dag, dag drie van de differentiatieprocedure, de schaal onder de microscoop bij een 10X vergroting om te bevestigen dat alle embryoid bodies zijn gehecht.Voer vervolgens voorzichtig een volledige mediumverversing uit met compleet NRI-medium. Vers침 het NRI-medium om de dag tot dag zeven, wanneer rozetachtige neuro-epithele aggregaten zichtbaar zouden moeten zijn. Coat op dag zeven een 96-wells plaat door 100 microliters standaardmatrix, verdund in kweekmedium, in elke well te pipetteren.Snijd op dag acht de rozetachtige aggregaten in fragmenten onder een stereomicroscoop bij een 10X vergroting onder steriele omstandigheden. Let erop dat de rozetten bij aanraking met de naald gemakkelijk van de schaal loslaten. Ontvlecht in dat geval de losgekomen rozet gedeeltelijk met de naaldpunt.Als de rozetten gedeeltelijk bevestigd blijven, gebruik dan een 200 microliter pipette om de loskoppeling van de rosettefragmenten te voltooien. Het wegsnijden van rozetten vereist goede handvaardigheid en precisie om te voorkomen dat neuraxidermale derivaten worden doorgesneden. Verzamel vervolgens de rosettefragmenten en hun medium in een 15 milliliter conisch buisje.Spoel de schaal met twee milliliters NRI-medium om alle fragmenten te herstellen. Centrifugeer vervolgens de rozetfragmenten bij 112 ×g gedurende één of twee minuten. Na het aspireren van het supernatant wordt het pellet voorzichtig geresuspendeerd in één milliliter voorverwarmd 1X DPBS zonder calcium en magnesium.Pipetteer de rozetfragmenten voorzichtig op en neer om ze gedeeltelijk te dissociëren. Voeg vervolgens vier milliliter compleet NRI-medium toe en tel de cellen met trypaanblauw en een automatische celteller. Aspireer daarna de standaard matrix-coatingoplossing uit de 96-wells plaat en breng de cellen in de wells aan met een dichtheid van ongeveer 15.000 cellen per vierkante centimeter in NRI-medium.Incubeer de plaat overnight bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Voer op dag 10 een volledige mediumverversing uit met compleet neuronaal differentiatiemedium. Deze representatieve afbeelding toont rosettes na 12 dagen in vitro, gekleurd voor nestine in het groen en bèta-III-tubuline in het rood.Hier zijn cellen die 28 dagen in vitro zijn gekweekt, gekleurd voor bèta-drie tubuline in rood en NF200 in groen. Deze representatieve afbeelding toont neuronale cellen gedifferentieerd uit NSC's na 21 dagen in vitro, gekleurd voor NF200 in rood en tow in groen. Hier zijn gliacellen uit dezelfde cultuur gekleurd voor GFAP in rood.Dit histogram vergelijkt de kwantificering van nestine, MAP two, GFAP, gamma-aminoboterzuur, vesiculair glutamaattransporteur één en tyrosinehydroxylase-positieve cellen in IMR90 hiPSC-derivaten en cellen gedifferentieerd uit IMR90 hiPSC-afgeleide NSC's. Deze fasecontrastbeelden, genomen met een 10X objectief, tonen neurale stamcellen die gedurende 21 dagen differentiëren. Door deze procedures te volgen, kunnen andere read-outs, zoals kwantitatieve real-time PCR en multilaterale re-analyse, worden uitgevoerd om de fysiologie en het fenotype van neurale en gliale cellen te beoordelen en het effect van chemicaliën te evalueren.Vergeet niet dat het werken met chemische verbindingen uiterst gevaarlijk kan zijn. Daarom moeten de relevante voorzorgsmaatregelen altijd worden genomen door een veiligheidsbril, handschoenen of een masker te gebruiken onder de zuurkast, vooral bij het uitvoeren van chemische behandelingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een gemengde gedifferentieerde populatie van neuronen en gliacellen verkrijgt uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat een geschikt in vitro model vormt voor de ontwikkeling van neurotoxiciteitstesten.

protocol-for-differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video showcases a technique for co-culturing glutamatergic neurons and pediatric high-grade glioma (pHGG) cells within a microfluidic device. Human induced pluripotent stem cells are introduced into the microfluidic system and incubated to promote their differentiation into mature cortical glutamatergic neurons. Following this, the pHGG cells are introduced onto the mature neurons, establishing a co-culture and enabling interactions between neurons and pHGG cells.

Co-culturing Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

This video demonstrates the process of differentiating embryoid bodies (EBs) into neuroepithelial aggregates and their subsequent division into neuronal and glial cells. This method allows the efficient generation of neuronal and glial cells in vitro, which serve as test systems for toxicity testing as well as assessment of different pathways involved in neurotoxicity.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Een aangepast protocol wordt beschreven om muis ES-cellen te differentiëren in gedefinieerde populaties van zeer zuivere neuronen die functionerende synapsen en opkomend netwerkgedrag vertonen. Elektrofysiologische analyse toont het verlies van synaptische transmissie aan na blootstelling aan botulinum neurotoxine serotypen /A-/G en tetanus neurotoxine.

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.

Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Leer hoe je humane geïnduceerde pluripotente stamcellen differentieert naar gemengde culturen van neuronen en glia. Dit protocol biedt een betrouwbaar in vitro model voor neurotoxiciteitstesten en geneesmiddelscreening.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit (Video) | JoVE Journal

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Meer video's verkennen