Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een

Het algemene doel van deze procedure is de preparatie, cultuur, behandeling en immunokleuring van neonatale muis-cochleaire explantaten om te worden gebruikt als in vitro screeningsinstrument in gehooronderzoek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het gehooronderzoek, zoals het mogelijk maken van de gelijktijdige studie van cochleaire haarcellen, synapsen, neurieten en neuronen in een ex vivo model, en het bieden van inzicht in de werkingsmechanismen van moleculen die nieuw zijn voor het slakkenhuis, inclusief factoren die in menselijke secreties worden aangetroffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het screeningsproces van potentiële therapeutische verbindingen kan worden versneld voorafgaand aan de in vivo testen.

Begin met een vers verzamelde kop van een neonatus, bewaard in 70% ethanol in het deksel van een Petrischaal. Gebruik een scalpellamesje om een oppervlakkige incisie in de huid te maken van het anterieure naar het posterieure uiteinde van de schedel. Snijd vervolgens beide externe gehoorgangen door en vouw de huid naar voren om het gehele cranium bloot te leggen.

Open vervolgens het schedeldak langs de sagitturale naad door het scalpelblad voorzichtig in een op-en-neergaande beweging van anterieur naar posterieur te bewegen om compressie van het slakkenhuis te voorkomen. Verwijder de snuit en gooi deze weg door een verticale snede direct posterieur aan de oogkassen te maken. Het posterieure deel van de schedel moet het brein en het slakkenhuis nog bevatten.

Gebruik vervolgens een pincet om de telencephalon, het cerebellum en de hersenstam bot te dissekeren en te verwijderen. Plaats de twee helften van het cranium in een plastic Petrischaal van 60 millimeter gevuld met koud HBSS. Gebruik vervolgens een pincet om de cochlea, die zich naast de omliggende arteria stapedialis bevindt, volledig bloot te leggen en scheid het orgaan bot van het os temporale.

Breng de cochlea over naar een glazen Petri-schaal met een transparante wand van 50 millimeter die HBSS bevat en plaats de schaal onder de microscoop. Plaats de plastic Petri-schaal van 60 millimeter met de andere helft van het schedeldak op ijs. Gebruik vervolgens 4 pincetten om de otische capsule van de cochlea zorgvuldig te dissekeren.

Gebruik nu een micronmes of twee 55 pincetten om het spiraalligament, dat aan het Corti-orgaan vastzit, voorzichtig te scheiden van de rest van de cochlea en de medialis. Dit kan worden gedaan door het spiraalligament bij het meest basale aspect vast te pakken en het voorzichtig af te wikkelen terwijl u zich apicaal beweegt. Nadat het spiraalligament is verwijderd, positioneert u het preparaat om een longitudinale sagittale weergave van de cochlea te verkrijgen.

Snijd vervolgens de cochlea met het micronmes in twee of drie secties, waarbij deze secties worden geclassificeerd als de apicale en basale windingen. Verwijder het weefsel superieur voor het meer apicale stuk en inferieur voor het meer basale stuk, tot aan de eigenlijke laag haarcellen en neurieten, zodat het cochleaire explantaat horizontaal op de Petrischaal kan liggen. Gebruik daarna een pincet om het tectoriaal membraan, een zeer dunne doorschijnende laag direct superieur aan het Corti-orgaan, voorzichtig vast te pakken en weg te pellen.

De technisch meest uitdagende stap is waarschijnlijk het verwijderen van het dunne, doorschijnende tectoriale membraan, aangezien de onderliggende haarcellen gemakkelijk beschadigd kunnen raken. Door aan de randen van het weefsel te beginnen, blijven de haarcellen over de gehele lengte van het explantaat behouden, behalve aan de uiterste rand waar het afpellen van het tectoriale membraan begon. Verwijder tot slot het membraan van Reissner, dat zich direct boven de neuronen van het spiraalganglion bevindt, door het aan beide zijden met een pincet aan te raken en weg te pellen.

Het cochleaire preparaat is nu klaar voor cultivering nadat eventuele beschadigde zones aan de randen zijn verwijderd. Begin de cultuurprocedure door de tip van een pipet van 1 mL te bevochtigen met ongeveer 120 µL DMEM om te voorkomen dat het explantaat aan de binnenkant van de tip hecht. Gebruik vervolgens de voorbevochtigte tip om maximaal 70 µL uit de Petri-schaal met glazen bodem op te zuigen en plaats het preparaat samen met de vloeistof in een van de vier inlays van de Petri-schaal met vier putjes.

Controleer onder de microscoop of het explantaat in de juiste oriëntatie ligt. Zorg ervoor dat het gebied met haarcellen waarvan het tectoriaal membraan is verwijderd naar boven is gericht en dat het basilaire membraan samen met het getrimde basale deel van de medialis naar beneden is gericht en hecht aan de inleg van het dekglas. Als het preparaat bij inspectie ondersteboven georiënteerd is, zoals hier wordt getoond, voeg dan HBSS toe vanuit de pipetpunt en herpositioneer het stuk tot het correct is georiënteerd.

Zodra het explantaat correct is georiënteerd, zuigt u het overtollige HBSS af en wacht u 15 seconden. Pipetteer nu 60 µL warm kweekmedium direct op het specimen, waarbij u er zorg voor draagt dat u het specimen niet met de pipet aanraakt. Plaats de binnen- en buitendeksels van de Petrischaal terug en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C.

Breng de volgende dag de Petri-schalen met de cochleaire explantaten over van de incubator naar de laminaire flowkast. Aspireer het oude cultuurmedium zonder FBS uit de inlay. Voeg 60 µL per well van het voorbereide warme behandelmedium toe.

Plaats de Petrischaal terug in de incubator tot de culturen na maximaal zeven dagen worden gekleurd. Zoals te zien is in deze confocale afbeelding, behoudt deze techniek de anatomie van de gehele cochleaire winding, inclusief de neuronen van het spiraalganglion of SGNs, waardoor analyse van de effecten van de behandeling op de neurieten en somata van SGNs mogelijk is, naast het Corti-orgaan. Zoals hier te zien is, kunnen deze explantaten worden gebruikt om na immunofluorescente kleuring het effect van de behandeling op de apicale en basale windingen gelijktijdig te vergelijken.

Haarcellen zijn in het groen weergegeven en neuronale structuren verschijnen in het rood. Intacte synapsen kunnen worden beoordeeld door presynaptische eiwitten (weergegeven in het rood) en postsynaptische eiwitten (weergegeven in het groen) samen met de kleuring van neuronale structuren in het blauw te labelen. Deze figuur toont representatieve beelden van apicale en basale cochleaire explantaten na zeven dagen in kweek met respectievelijk 3% FBS (links) of 1% FBS (rechts).

Cellen die worden geïncubeerd in 3% FBS beginnen tussen dag vier en vijf te migreren, zoals aangegeven door de lichtgrijze pijlen voor haarcellen en de rode pijlen voor neurieten. Explantaten in 1% FBS behouden hun organisatorische integriteit tot dag zeven. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om visueel te controleren of de structurele integriteit en oriëntatie van het cochleaweefsel correct zijn voordat het uiteindelijke kweekmedium en de betreffende stoffen worden toegevoegd.

Na deze procedure kan een 3D-reconstructie worden uitgevoerd om de celtype-specifieke lokalisatie van GFP-expresserende cellen binnen de medialis te bevestigen.