Name: Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een In Vitro Screening Tool in Hearing Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer de neonatale murine cochleaire explanttechniek voor gehooronderzoek met immunokleuring en microscopische analyse. Deze methode versnelt het screenen van therapeutische verbindingen voor behandeling van gehoorverlies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Nationale Instituut voor Doofheid en Andere Communicatie Stoornissen, subsidies R01DC015824 (KMS) en T32DC00038 (SD ondersteunend), het ministerie van Defensie-subsidie ​​W81XWH-15-1-0472 (KMS), de Bertarelli Foundation (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) en het Lauder Tinnitus Research Center (KMS). Wij danken Jessica E. Sagers, BA voor inzichtige opmerkingen over het manuscript.

Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Massachusetts Eye and Ear. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Code of Ethics van de World Medical Association. 1. De Dissection voorbereiden <ol><li> Het voorbereiden van de chirurgische tafel <ol><li> Gebruik 70% ethanol om de chirurgische tafel te desinfecteren. </li><li> Plaats twee nonsteriele prep pads naast de microscoop. </li><li> Bereid de instrumentenlade voor, met inbegrip van warmte-gesteriliseerde bedieningsschaar, een scalpel handvat, een micromes en tang (twee elk van # 4 &amp; # 55). Plaats de instrumentenlade en een 50 mm, opgeruimde, glasbodemde petrischaal op een niet-steriele paneel. </li><li> Verkrijg een steriele # 15 scalpel blade; Een afdichtbare plastic zak of container (om de karkassen in overeenstemming te brengen met de institutionele richtlijnen); Ijs in een emmer; En koude, steriele Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Plaats deze items op deAnder nonsteriel pad. </li><li> Breng de HBSS in een 50 ml plastic laboratoriumbuis en zet het op ijs. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de cultuur <ol><li> Bereid alle materialen in een laminaire stroomkap. Voor elke vier monsters plaatst u vier geautoclaveerde 10 mm ronde glazen deksels in de vier inlays van de petroleumschotel met 35 mm 4-putjes. </li><li> Voor elke 4 monsters meng een totaal volume van 300 μL bestaande uit het volgende in een microcentrifugebuis: 10 μl weefsellijm, 285 μL NaHC03 en 5 μL NaOH. </li><li> Zet 45 μL van de resulterende oplossing op elke afdekkap en laat het gedurende minstens 20 minuten bij RT liggen; Deze oplossing kan enkele uren op de deklaag liggen, maar kan niet overblijven O / N. </li><li> Plaats een of twee 35 mm 4-putjes petrienschotels in een 10 cm Petri-schotel om twee barrières tegen verontreiniging te creëren. </li><li> Bereid kweekmedium dat 98% van Dulbecco&#39;s gemodificeerde adelaar bevat (98%)DMEM), 1% N-2 en 1% ampicilline (65 μl per putje in een (micro) centrifugebuis). Verwarm de oplossing tot 25 ° C voor gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Murine Cochlear Explant Dissection <ol><li> Ontsteking van de neonatale muis <ol><li> Verkrijg een 60 mm plastic petri schotel en spuit 70% ethanol in het deksel zodat het oppervlak nat is. </li><li> Giet koude HBSS uit de plastic laboratoriumbuis in het onderste gedeelte van de 60 mm kunststof en de 50 mm schuine, glasbodemende petrischaal. Bewaar de plastic laboratoriumbuis en beide petrischalen op ijs om het weefsel koud te houden wanneer het niet wordt gescheiden. </li><li> Plaats een P3-P5-verouderde neonatale muis op ijs in een snijvinger van een latexhandschoen en wacht tot de hypothermie een bewusteloosheid veroorzaakt (ongeveer 1-3 minuten). </li><li> Ontdek de muis snel met een werkende schaar en verwijder het lichaam in de afdichtbare plastic zak. Zet het gescheurde neonate hoofd in de70% ethanol in het deksel van de 60 mm plastic petri schotel. </li></ol></li><li> Macroscopische dissectie van het temporale bot <ol><li> Verwijder de huid van de schedel door middel van een oppervlakkige snede van het voorste naar het achterste uiteinde (direct boven de sagittale hechting) met behulp van het schelpblad. </li><li> Snijd beide externe auditieve kanalen met het scalpelblad en vouw de huid voorkant om het hele cranium bloot te leggen. OPMERKING: Hoewel er geen dissectiemicroscoop voor deze stap nodig is, kan deze worden gebruikt voor verbeterde visualisatie. </li><li> Open het kranium langs de sagittale hechting met behulp van het # 15 scalpelblad. Zorg ervoor dat u het krans snijdt door het mes voorzichtig naar achteren omhoog en omlaag te verplaatsen om compressie van de cochleae te vermijden. OPMERKING: Het cranium mag op deze leeftijd niet worden vergiftigd en zou gemakkelijk moeten snijden. </li><li> Verwijder en verwijder de snuit door een verticale snede rechtstreeks achter de banden te maken met behulp van de # 15 scalpelblad. OPMERKING: Het achterste gedeelte van de schedel moet nog steeds de hersenen en cochleae bevatten. </li><li> Verwijder het voorhoofd, cerebellum en hersenstam door middel van stompe dissectie met # 4 tang. </li></ol></li><li> Microscopische extractie van de cochleae <ol><li> Pas de microscoop (6.5X vergroting) en lichtbron aan door middel van tangen onder het bereik en optimalisatie van de verlichting en focus. </li><li> Plaats de twee helften van het kraan in de 60 mm plastic petri schaal, gevuld met koude HBSS. </li><li> Stel de cochlea / e volledig bloot aan de nabijheid van de omliggende stapediale arterie (een kronkelende slagader binnen het temporale bot) en scheid het orgaan los van het temporale bot met behulp van # 4 tang. </li><li> Breng de cochlea over in de 50 mm, schuine, glasbodemende petrischaal en plaats de schotel onder de microscoop. </li><li> Plaats de 60 mm plastic petri schotel met de andere helft van het kranium op ijs. </li&gt; <li> Verwijder de cochlea uit het vestibulaire systeem en dissel de cochleaire otic capsule (typisch kraakbeenachtig op deze leeftijd) zorgvuldig op met # 4 tang. Gebruik # 55 tang voor alle verdere stappen. </li></ol></li><li> Laatste stappen van weefselverwerking <ol><li> Ga door met de verwerking van het binnenoorweefsel door het spiraalvormige ligament aan te sluiten dat aan het orgaan van Corti is gekoppeld van de rest van de cochlea en de modiolus met behulp van het micromes of twee tang. <ol><li> Snijd in het donkerder doorzichtige gebied in de spleet tussen het spiraalvormige ligament en het haarcelgebied en ga door naar de daaropvolgende verwijdering van het spiraalvormige ligament door het op het meest basale aspect te grijpen en het voorzichtig af te wikkelen terwijl u apic beweegt. </li></ol></li><li> Plaats het monster om een ​​longitudinale, sagittale weergave van de cochlea te krijgen en snijd de cochlea in twee tot drie secties met behulp van het micromes, waarbij deze secties worden ingedeeld als de apicale, middelste en bAsale bochten. Verwijder het weefsel superieur en inferieur aan de werkelijke laag van haarcellen en neurieten om een ​​cochleair explant stuk te verkrijgen dat horizontaal op de petrischaal kan liggen. OPMERKING: een passende grootte voor stabiele hechting aan de kweekschotel is ongeveer de helft van een cochleaire draai. </li><li> Verwijder het tectoriale membraan, een zeer dunne doorschijnende laag die onmiddellijk superieur is aan het orgaan van Corti, door het voorzichtig af te plakken met tang. </li><li> Verwijder het membraan van Reissner, onmiddellijk superieur aan de SGN&#39;s, door het aan te pakken met pincet aan beide kanten en af ​​te plakken. OPMERKING: Verwijder eventuele zijdelingse beschadigde haarcellen, door ze met het micromes weg te snijden. </li></ol></li></ol> 3. Overdracht van specimens naar de cultuurplaten <ol><li> Verwijder de 45 μL weefselkleefstofoplossing van de vier deklagen. Was elke deklaag met 50 μL steriele H 2 O. Was het water aan. </li><li> Pak de 1 ml pipet op. Vet de pipettip met ongeveer 120 μL DMEM om te voorkomen dat het monster aan de binnenkant van de punt hecht. </li><li> Breng de monsters afzonderlijk over met de 1 ml pipet. Pipet maximaal 70 μL van de HBSS-gevulde, kleine, weggebroken, glasbodemende petrischaaltje en plaats het monster samen met de vloeistof op een van de 4 inlays (bereid met deksels) in de 4-putjes petrischotel . </li><li> Controleer onder de microscoop (50X vergroting) dat het exemplaar in de juiste richting staat. Zorg ervoor dat het gebied van haarcellen waaruit het tectoriale membraan is verwijderd, naar boven gericht is. Zorg ervoor dat het basilair membraan, samen met het getrimde, basale deel van de modiolus, naar beneden gericht wordt en vasthoudt aan de deklaag. <ol><li> Als het monster ondersteboven wordt georiënteerd, dient u de HBSS in te stellen die in de pipetstip in de inleg blijft, en verplaats het stuk totdat het correct is georiënteerd. NEETE: Dit voorkomt dat haarcellen zweven in kweekmedium zonder structurele ondersteuning van de deklaag, wat kan leiden tot degeneratie. </li></ol></li><li> Aspireren overmaat HBSS met behulp van de 1 ml pipet. Wacht tot 15 s. </li><li> Pipetteer 60 μl van het bereid warm kweekmedium (98% DMEM, 1% N-2 en 1% ampicilline) direct op het monster. Zorg ervoor dat u het monster niet met de pipet aanraakt. Vervang de binnen- en buitenste petri-schaaldeksels en incubeer O / N bij 37 ° C. </li><li> Zet alle voorraadoplossingen terug op hun goede plaatsen, verwijder karkassen en restafval, ontleed de chirurgische tafel volgens de institutionele richtlijnen ( bv. Met ethanol of hypochloriet), reinig de instrumenten en autoklaaf de scharen in de juiste container . </li></ol> 4. Het toevoegen van definitieve cultuurmedia en belangstellende stoffen OPMERKING: Cochleaire explantaten zijn klaar voor gebruik 10-16 uur later. <ol><li> Bereid een mengsel voor1% N-2 en 1% ampicilline (65 μL per putje in een microcentrifuge-buis, 97% DMEM, 1% foetaal runderserum, 1% N-2, en verwarm de oplossing tot 25 ° C voor gebruik). </li><li> Voeg andere stoffen toe die interessant zijn voor de oplossingen voor de respectieve behandelingsgroepen. Als fluorescerende stoffen worden toegevoegd ( bijv. Groene fluorescerende eiwitten (GFP) -uitdrukkende virussen. In een recente publicatie werd een concentratie van 10 10 GC Adeno-Geassocieerde Virussen (AAV&#39;s) gedurende 48 uur in 50 μl gebruikt) 18 , beschermen tegen licht. </li><li> Breng de cochleaire explanthoudende petrischalen uit de incubator over en plaats ze onder de laminarstromkap. </li><li> Aspireer het oude kweekmedium (w / o FBS) met de pipet uit de inlays. </li><li> Voeg 60 μl per putje toe van het bereid warmtecultuur (behandelingsmedium) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicilline en de stoffen van belang). </li><li> Plaats de petrischaal terug in de incubator (37 ° C). </li><li> Bekijk rEgulair onder de microscoop om tekenen van verontreiniging, cellulaire migratie of loslating van de cochleaire explant te identificeren en kleur na maximaal 7 dagen uit te voeren. </li></ol> 5. Immunofluorescentie - Dag 1 <ol><li> Bereid blokkerende oplossing (94% fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal geiten- of paardserum (NGS / NHS, afhankelijk van de secundaire antilichamen) en 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (zie de Tabel van Materialen ) Antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionische oppervlakteactieve stof met de respectieve antilichamen). OPMERKING: Antilichamen omvatten konijn anti-Myo7A in een concentratie van 1: 400+ (myosine 7A, voor binnen- en buitenhaarcellen) en anti-TuJ1 1: 200+ (p-tubulin, voor SGN&#39;s) of muis anti-TuJ1 -CtBP2 1: 200+ (post-epileptische dichtheid voor postsynaps) en kip anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, Voor SGN&#39;s en zenuwvezels). &quot;+&quot; MeaNs &quot;of hoger.&quot; </li><li> Aspireer het kweekmedium met behulp van een pipet. Zorg ervoor dat u het monster niet aanraakt. </li><li> Spoel de cochleairexplanten tweemaal met steriele PBS onder de laminaire stromende kap, waarbij de exemplaren 5 minuten na elke was op een shaker worden geplaatst. </li><li> Fix het weefsel in 4% paraformaldehyde (PFA - CAUTION) gedurende 20 minuten op de shaker (onder de kap). Aspireer de PFA. </li><li> Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x. </li><li> Plaats de cochleairexplants in de voorbereide blokkeringsoplossing (94% PBS, 5% NHS en 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) gedurende 30 minuten op een shaker. </li><li> Plaats de cochleairexplants in een voorbereide voorraad antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) met de respectieve primaire antilichamen (vortex voor gebruik) O / N op een teller bij RT. OPMERKING: Pak de petrischalen met vochtige papieren handdoeken in plastic wrap (of aluminiumfolie als de toegevoegde oplossingIonen bevat fluorescerende materialen zoals GFP-expressieve virussen) om de afwasmiddelen vochtig te houden en om verdamping van de antilichaamoplossing O / N te voorkomen. </li></ol> 6. Immunofluorescentie - Dag 2 <ol><li> Bereid de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) vlek (300 nM) op en gebruik de voorraad antilichaamoplossing om de juiste secundaire antilichaammengsels te verkrijgen, die complementair zijn met de primaire antilichamen in stap 5.1. ( Bijv . Geiten-anti-konijn 488 1: 200+ en geiten-anti-muis 568 1: 200+ OF geiten-anti-muis (IgG1) 568 1: 1000+, geit anti-muis (IgG2a) 488 1: 500+, En geitenkip 647 1: 200+ OF Phalloidin 568 1: 200+ (voor binnen- en buitenhaarcellen)). </li><li> Aspireer de primaire antilichaamoplossing. </li><li> Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x. </li><li> Plaats de cochleairexplants in een voorbereide voorraad antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) met de resPectieve secundaire antilichamen (vortex voor gebruik) gedurende 1,5 uur op een teller en tegen licht beschermen. </li><li> Aspireer de secundaire antilichaamoplossing en spoel de cochleairexplanteren met een DAPI-vlek (plaats 1 shaker op 1 minuut en laat daarna aspireren). </li><li> Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x. </li><li> Gebruik pincet om de dekglazen te verwijderen met specimens van de 4-putjesplaat, doe ze in een ontvanger gevuld met gedestilleerde H 2 O, en droog de dekglazen door verticaal in contact te brengen met papieren handdoeken. </li><li> Plaats een druppel antifade montagemedium op de microscoopschuif en draai de deklipjes omlaag om het naar beneden gericht weefsel in het medium te onderdompelen. </li><li> Verzegel de deklip met behulp van duidelijke nagellak om de rand om de rand te omringen (zonder het specimen onder het glas te verpletteren). Laat de glijbanen vlak in een overdekt gebied liggen, weg van het licht gedurende 15 - 20 minuten tot droog en thEn plaats ze in een doos of onder de confocale microscoop. OPMERKING: Fluorescerende kleuring wordt het best bewaard door de glijbanen op 4 of -20 ° C op te slaan. </li></ol> 7. Confocal Imaging <ol><li> Verkrijg een overzicht en ingezoomde foto&#39;s voor het orgaan van Corti-regio, inclusief neurieten en SGN&#39;s. OPMERKING: Standaardinstellingen voor het beeldvormingsproces: Formaat van 1.024 x 1.024 pixels, snelheid van 400 Hz, kadergemiddelde van 3, 20% totale laserintensiteit, en meestal 20X en 63X lens met olieonderdompeling (mogelijk gecombineerd met 2X digitale zoom). Channel instellingen voor het DAPI, Myo7A en TuJ1 kleuring protocol zijn hierboven beschreven: 405 5% DAPI, Smart Gain 766.8V, Smart Offset 0,0% - 488 15% Fluoresceïne Isothiocyanaat (FITC), Smart Gain 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% tetramethylrhomadine isothiocyanaat (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Voeg de afbeeldingen samen in een z-stack met behulp van deSoftware om een ​​z-as projectie te verkrijgen. </li></ol>

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onderzoekers moeten de dissectietechniek perfect maken voordat ze experimenten uitvoeren met cochleaire explanteren. Haarcellen worden doorgaans beschadigd tijdens dissecties die vroeger in de leercurve worden uitgevoerd. Een bijzonder problematisch moment voor hun integriteit is het verwijderen van het tectoriale membraan, dat vaste handen, juiste gereedschappen en ervaring vereist. Om tijd en middelen te besparen, dient een visuele controle onder de dissectiemicroscoop te worden uitgevoerd en moet eventueel beschadigd...

Sensorineurale gehoorverlies (SNHL) weerspiegelt schade aan het binnenoor of oplopende auditieve weg. Terwijl gehoorverlies het meest voorkomende sensorische tekort bij mensen 1 is , zijn er nog geen genezende therapieën 2 . Hoewel cochleaire of auditieve hersenstamimplantaten een zekere mate van gehoor kunnen herstellen voor patiënten met ernstige tot diepgaande SNHL, is de gehoor die door deze apparaten wordt geleverd nog steeds heel anders dan &#39;natuurlijk&#39; gehoor, vooral tijdens pogingen om spraak in geluid te begrijpen of muziek te luisteren. Hoewel de degeneratie van de haarcellen al lang is beschouwd als het belangrijkste gevolg van traumatische auditieve gebeurtenissen ( bijv. Blootstelling aan luid geluid), is er steeds meer bewijs dat de synaptes die informatie overdragen van haarcellen naar de auditieve zenuw ten minste zo kwetsbaar zijn voor akoestisch trauma 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Aangezien menselijke audiometrische drempels, de huidige gouden standaard voor de evaluatie van de gehoorfunctie, geen specifieke cellulaire schade in het binnenoor voorspellen, zijn er meer verfijnde gereedschappen nodig om de degeneratie van de cel zo snel mogelijk te detecteren en adequate behandeling te starten 7 . Veelbelovende farmaceutische behandelingen voor gehoorverlies worden vaak getest op homogene celculturen in vitro , maar dergelijke systemen passen de cochleaire micro-omgeving niet nauwkeurig aan. Cochleaire cellen zijn bekend om trofische factoren te scheiden die andere celtypen binnen de cochlea 8 , 9 beïnvloeden, een cruciaal in vivo proces dat verloren gaat wanneer het orgaan van Corti 10 , 11 of Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 afzonderlijk wordt gekweekt of wanneer Moleculaire markers worden geanalyseerdEf &quot;&gt; 13. In vivo studies die nodig zijn voor de validatie van in vitro data om nieuwe, gepersonaliseerde behandelingen voor gehoorverlies in het nastreven van&quot; precisie geneeskunde &quot;te ontwikkelen, vereisen echter aanzienlijke middelen en tijd. Dit is vooral relevant bij het overwegen van Hoeveel inspanning nodig is om de middenoor- of ronde-venstermembraaninjecties te perfectioneren en uit te voeren met gehoorproeven en de daaropvolgende dissectie van cochleaire full-mounts. De efficiënte screening van veelbelovende verbindingen in organotypische ex vivo culturen, bekend als cochleaire explantanten, biedt een economisch en betrouwbaar alternatief 14 , 15 , 16 , 17 . In dit artikel wordt een protocol beschreven waarmee u behandelde cochleairexplants kan genereren, onderhouden en evalueren. Specifieke toepassingen voor dit model worden benadrukt, inclusief het gebruik ervan bij het screenenVan potentieel therapeutische verbindingen en de vergelijkende evaluatie van virale vectoren voor gentherapie. Een ex vivo explantieve benadering laat onderzoekers toe om de effecten van een gegeven behandeling op verschillende celpopulaties in situ te visualiseren, waardoor de identificatie van celltypespecifieke mechanismen en de daaropvolgende verfijning van gerichte therapeutica wordt vergemakkelijkt. Over het geheel genomen biedt deze techniek een model om de cochlea ex vivo te bestuderen, terwijl vitale kruisbesprekingen tussen de veel verschillende celsoorten die in de cochlea bestaan, behouden blijven.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H antibody, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&reg;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, &ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Aliquot in 50 mL tubes and store in -20&deg;C freezer</td></tr><tr><td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (dissecting) knife &ndash; angled 30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Prep Pad, Non Sterile&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatale murine cochlear explantietechniek als een<em&gt; in vitro</em&gt; screening tool in hearing research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Hoewel er in de afgelopen decennia merkwaardige vooruitgang is geweest bij het horen van onderzoek, is er nog steeds geen remedie voor Sensorineural Hearing Loss (SNHL), een aandoening die typisch schade aan of verlies van de delicate mechanosensorische structuren van het binnenoor meebrengt. Geavanceerde in vitro en ex vivo assays zijn in de afgelopen jaren opgetreden, waardoor het mogelijk is om een ​​steeds groter aantal potentiële therapeutische verbindingen te screenen, terwijl de middelen minder worden en de inspanningen om SNHL te ontwikkelen, worden versneld. Hoewel homogene culturen van bepaalde celtypes een belangrijke rol spelen in het huidige onderzoek, zijn veel wetenschappers nu gebaseerd op complexere organotypische culturen van muizen innerlijke oren, ook wel cochleaire explanteren genoemd. Het behoud van georganiseerde cellulaire structuren in het binnenoor vergemakkelijkt de in-situ evaluatie van verschillende componenten van de cochleaire infrastructuur, met inbegrip van binnen- en buitenhaarcellen, spirale ganglionneuronen, neurItes en ondersteunende cellen. Hier presenteren wij de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten. De zorgvuldige voorbereiding van deze explanteren vergemakkelijkt de identificatie van mechanismen die bijdragen aan SNHL en vormen een waardevol hulpmiddel voor de gehooronderzoeksgemeenschap.

Terwijl veel protocollen zich richten op organs van Corti-explanteren, probeert deze techniek de anatomie van de gehele cochleaire beurt te behouden, inclusief de SGN&#39;s. Dit geeft onderzoekers de mogelijkheid om, naast het orgaan van Corti, de effecten van een bepaalde behandeling op neurieten en somata van SGN&#39;s te analyseren. Het uitvoeren van een dissectie die een deel van de modiolus behoudt, zoals hier beschreven, is meer technisch uitdagend dan het expliceren van het orgaan...

Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Het algemene doel van deze procedure is de preparatie, cultuur, behandeling en immunokleuring van neonatale muis-cochleaire explantaten om te worden gebruikt als in vitro screeningsinstrument in gehooronderzoek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het gehooronderzoek, zoals het mogelijk maken van de gelijktijdige studie van cochleaire haarcellen, synapsen, neurieten en neuronen in een ex vivo model, en het bieden van inzicht in de werkingsmechanismen van moleculen die nieuw zijn voor het slakkenhuis, inclusief factoren die in menselijke secreties worden aangetroffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het screeningsproces van potentiële therapeutische verbindingen kan worden versneld voorafgaand aan de in vivo testen.Begin met een vers verzamelde kop van een neonatus, bewaard in 70% ethanol in het deksel van een Petrischaal. Gebruik een scalpellamesje om een oppervlakkige incisie in de huid te maken van het anterieure naar het posterieure uiteinde van de schedel. Snijd vervolgens beide externe gehoorgangen door en vouw de huid naar voren om het gehele cranium bloot te leggen.Open vervolgens het schedeldak langs de sagitturale naad door het scalpelblad voorzichtig in een op-en-neergaande beweging van anterieur naar posterieur te bewegen om compressie van het slakkenhuis te voorkomen. Verwijder de snuit en gooi deze weg door een verticale snede direct posterieur aan de oogkassen te maken. Het posterieure deel van de schedel moet het brein en het slakkenhuis nog bevatten.Gebruik vervolgens een pincet om de telencephalon, het cerebellum en de hersenstam bot te dissekeren en te verwijderen. Plaats de twee helften van het cranium in een plastic Petrischaal van 60 millimeter gevuld met koud HBSS. Gebruik vervolgens een pincet om de cochlea, die zich naast de omliggende arteria stapedialis bevindt, volledig bloot te leggen en scheid het orgaan bot van het os temporale.Breng de cochlea over naar een glazen Petri-schaal met een transparante wand van 50 millimeter die HBSS bevat en plaats de schaal onder de microscoop. Plaats de plastic Petri-schaal van 60 millimeter met de andere helft van het schedeldak op ijs. Gebruik vervolgens 4 pincetten om de otische capsule van de cochlea zorgvuldig te dissekeren.Gebruik nu een micronmes of twee 55 pincetten om het spiraalligament, dat aan het Corti-orgaan vastzit, voorzichtig te scheiden van de rest van de cochlea en de medialis. Dit kan worden gedaan door het spiraalligament bij het meest basale aspect vast te pakken en het voorzichtig af te wikkelen terwijl u zich apicaal beweegt. Nadat het spiraalligament is verwijderd, positioneert u het preparaat om een longitudinale sagittale weergave van de cochlea te verkrijgen.Snijd vervolgens de cochlea met het micronmes in twee of drie secties, waarbij deze secties worden geclassificeerd als de apicale en basale windingen. Verwijder het weefsel superieur voor het meer apicale stuk en inferieur voor het meer basale stuk, tot aan de eigenlijke laag haarcellen en neurieten, zodat het cochleaire explantaat horizontaal op de Petrischaal kan liggen. Gebruik daarna een pincet om het tectoriaal membraan, een zeer dunne doorschijnende laag direct superieur aan het Corti-orgaan, voorzichtig vast te pakken en weg te pellen.De technisch meest uitdagende stap is waarschijnlijk het verwijderen van het dunne, doorschijnende tectoriale membraan, aangezien de onderliggende haarcellen gemakkelijk beschadigd kunnen raken. Door aan de randen van het weefsel te beginnen, blijven de haarcellen over de gehele lengte van het explantaat behouden, behalve aan de uiterste rand waar het afpellen van het tectoriale membraan begon. Verwijder tot slot het membraan van Reissner, dat zich direct boven de neuronen van het spiraalganglion bevindt, door het aan beide zijden met een pincet aan te raken en weg te pellen.Het cochleaire preparaat is nu klaar voor cultivering nadat eventuele beschadigde zones aan de randen zijn verwijderd. Begin de cultuurprocedure door de tip van een pipet van 1 mL te bevochtigen met ongeveer 120 µL DMEM om te voorkomen dat het explantaat aan de binnenkant van de tip hecht. Gebruik vervolgens de voorbevochtigte tip om maximaal 70 µL uit de Petri-schaal met glazen bodem op te zuigen en plaats het preparaat samen met de vloeistof in een van de vier inlays van de Petri-schaal met vier putjes.Controleer onder de microscoop of het explantaat in de juiste oriëntatie ligt. Zorg ervoor dat het gebied met haarcellen waarvan het tectoriaal membraan is verwijderd naar boven is gericht en dat het basilaire membraan samen met het getrimde basale deel van de medialis naar beneden is gericht en hecht aan de inleg van het dekglas. Als het preparaat bij inspectie ondersteboven georiënteerd is, zoals hier wordt getoond, voeg dan HBSS toe vanuit de pipetpunt en herpositioneer het stuk tot het correct is georiënteerd.Zodra het explantaat correct is georiënteerd, zuigt u het overtollige HBSS af en wacht u 15 seconden. Pipetteer nu 60 µL warm kweekmedium direct op het specimen, waarbij u er zorg voor draagt dat u het specimen niet met de pipet aanraakt. Plaats de binnen- en buitendeksels van de Petrischaal terug en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C.Breng de volgende dag de Petri-schalen met de cochleaire explantaten over van de incubator naar de laminaire flowkast. Aspireer het oude cultuurmedium zonder FBS uit de inlay. Voeg 60 µL per well van het voorbereide warme behandelmedium toe.Plaats de Petrischaal terug in de incubator tot de culturen na maximaal zeven dagen worden gekleurd. Zoals te zien is in deze confocale afbeelding, behoudt deze techniek de anatomie van de gehele cochleaire winding, inclusief de neuronen van het spiraalganglion of SGNs, waardoor analyse van de effecten van de behandeling op de neurieten en somata van SGNs mogelijk is, naast het Corti-orgaan. Zoals hier te zien is, kunnen deze explantaten worden gebruikt om na immunofluorescente kleuring het effect van de behandeling op de apicale en basale windingen gelijktijdig te vergelijken.Haarcellen zijn in het groen weergegeven en neuronale structuren verschijnen in het rood. Intacte synapsen kunnen worden beoordeeld door presynaptische eiwitten (weergegeven in het rood) en postsynaptische eiwitten (weergegeven in het groen) samen met de kleuring van neuronale structuren in het blauw te labelen. Deze figuur toont representatieve beelden van apicale en basale cochleaire explantaten na zeven dagen in kweek met respectievelijk 3% FBS (links) of 1% FBS (rechts).Cellen die worden geïncubeerd in 3% FBS beginnen tussen dag vier en vijf te migreren, zoals aangegeven door de lichtgrijze pijlen voor haarcellen en de rode pijlen voor neurieten. Explantaten in 1% FBS behouden hun organisatorische integriteit tot dag zeven. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om visueel te controleren of de structurele integriteit en oriëntatie van het cochleaweefsel correct zijn voordat het uiteindelijke kweekmedium en de betreffende stoffen worden toegevoegd.Na deze procedure kan een 3D-reconstructie worden uitgevoerd om de celtype-specifieke lokalisatie van GFP-expresserende cellen binnen de medialis te bevestigen.

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een betrouwbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor.

Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis

Dierlijke modellen van cochleaire implantaten kunnen vooraf kennis van de technologische grondslagen voor de behandeling van permanente perceptief gehoorverlies met elektrische stimulatie. Deze studie geeft een chirurgische protocol voor acute oorverdovend en cochleaire implantatie van een elektrodenserie in muizen, alsmede de beoordeling van de functionele met auditieve brainstem response.

Cochleair implantaatchirurgie en elektrisch opgeroepen auditieve Brainstem Response opnamen in C57BL/6 muizen

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Miniatuurvarkens (minivarkens) zijn een ideaal groot diermodel voor onderzoek naar cochleaire implantaten. Cochleaire implantatiechirurgie bij minivarkens kan worden gebruikt om het eerste bewijs te leveren van de veiligheid en potentiële prestaties van nieuwe elektrode-arrays en chirurgische benaderingen in een levend systeem dat vergelijkbaar is met mensen.

Het miniatuurvarken: een groot diermodel voor onderzoek naar cochleaire implantaten

Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.

Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Leer de neonatale murine cochleaire explanttechniek voor gehooronderzoek met immunokleuring en microscopische analyse. Deze methode versnelt het screenen van therapeutische verbindingen voor behandeling van gehoorverlies.

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een

Meer video's verkennen