Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van side population-cellen uit een zebravismodel van myc-geïnduceerde acute lymfoblastische leukemie van T-cellen. De side population-assay is gebruikt om stamcel- en progenitorcelpopulaties te identificeren in veel normale weefsels en kankerweefsels. Deze is echter nog niet toegepast op zebrafish-kankermodellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de prospectieve isolatie mogelijk maakt van een populatie cellen in zebrafish T-ALL die verrijkt kan zijn voor kankerstamcelactiviteit. Hoewel de methode die we hier beschrijven brede toepassingen heeft in het onderzoek naar leukemie bij zebrafish, kan deze mogelijk ook worden toegepast op andere maligne en non-maligne zebrafish-celtypen. Personen die niet bekend zijn met deze methode kunnen hinder ondervinden omdat de methode gevoelig is voor subtiele veranderingen.

Hoewel de methode eenvoudig lijkt, is optimalisatie vereist voor elk getest celtype. Bereid 20 milliliters van 10 procent hitte-geïnactiveerd FBS in 0,9x PBS voor. Voeg één milliliter van de FBS/PBS-oplossing toe aan een vial met natriumzout van heparine dat 300 units van het anticoagulans bevat.

Select vervolgens met behulp van een epifluorescentiemicroscoop vissen waarbij tumorcellen 50 procent van het lichaam hebben geïnvadeerd, of vissen die moeite hebben met eten of zwemmen. Euthanaseer de vis door deze over te brengen naar een oplossing van één tot twee milligram per milliliter tricaine in viswater. Observeer het dier op kieuwbeweging en hartslag om de euthanasie te bevestigen.

Nadat de kop van de vis is verwijderd, injecteert u met een pipet 100 µL heparine-oplossing in de lichaamsholte om overtollige rode bloedcellen te verwijderen. Zuig alle uitstromende vloeistof op en pipetteer deze in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Was vervolgens, met gebruik van nieuwe pipetpunten, de lichaamsholte nog twee keer of totdat de wasoplossing geen bloed meer bevat, en gooi de vloeistof van alle wasbeurten weg.

Om leukemiecellen te verzamelen, injecteert u 100 µL FBS/PBS-oplossing in de vooraf gewassen lichaamsholte. Oefen onder een dissectiemicroscoop met de tip van een pipet zachte druk uit op het lichaam van de vis om de tumorcellen naar buiten te persen. Verzamel de vrijgekomen vloeistof in een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.

Herhaal de isolatie totdat de meeste tumorcellen zijn geoogst. Verzamel alle cellen in dezelfde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar de verkregen suspensie bij kamertemperatuur. Meng vervolgens de geïsoleerde tumorcellen door voorzichtig te pipetteren om celklonten te dissociëren.

Filter de celconcentratie door een 40 micrometer mesh-filter. Was het filter één tot twee keer met 100 microliters FBS/PBS. Bewaar de cellen na filtratie bij kamertemperatuur.

Meng tot slot in een nieuwe buis twee µL van de celsuspensie met 18 µL steriele Trypan Blue-oplossing van 0,04 procent. Breng 10 µL van de verkregen suspensie aan op een hemocytometer en tel de levensvatbare fluorescerende tumorcellen. Het is belangrijk om een schoon monster T-ALL-cellen te verzamelen.

De concentratie van Hoechst 33342 die hier wordt gebruikt, is gebaseerd op het aantal verzamelde levende tumorcellen. Aanvullig cellulair debris of niet-tumorkleuren kunnen de assay beïnvloeden. Verdun vóór de celkleuring de Hoechst-kleurstof in nucleasevrij water om een werkingsoplossing van 1 mg/mL te verkrijgen.

Bewaar de bereide oplossing afgedekt met aluminiumfolie bij vier graden Celsius. Los vervolgens 49,1 milligram verapamil op in één milliliter DMSO om een remmeroplossing van 100 micromolair te verkrijgen. Bereid daarna het monster voor door FBS/PBS, 2,5 microliter DMSO, 15 microliter Hoechst-kleurstof van één milligram per milliliter en 10 tot de macht zes tumorcellen toe te voegen aan een fax-buisje tot een eindvolume van één milliliter.

Om de controle voor te bereiden, voegt u 2,5 µL verapamil (100 mM) en 15 µL Hoechst-kleurstof (1 mg/mL) toe aan FBS/PBS, en voegt u dit toe aan 10^6 tumorcellen tot een eindvolume van 1 mL. Incubeer het monster en de controle in een waterbad van 28 °C in het donker gedurende 120 minuten. Plaats de cellen na de incubatie onmiddellijk op ijs en bewaar ze in het donker.

Centrifugeer de cellen bij 300 ×g bij 4 °C gedurende zes minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en was de cellen met 1 mL FBS/PBS. Centrifugeer de cellen nogmaals bij 300 ×g bij 4 °C gedurende zes minuten.

Zodra de cellen zijn gepelletteerd, wordt het supernatant verwijderd en worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in één milliliter FBS/PBS. Bewaar de monsters bij vier graden Celsius tot aan de cellensortering. Voeg 15 minuten voor de cellensortering twee microliters van een propidiumjodium-stamploplossing van één milligram per milliliter toe per elke ene milliliter celluspendensie.

Vortex vervolgens de monsters goed. Analyseer de gekleurde zebrafish T-ALL-cel-suspensies met behulp van een fluorescence activated cell sorter. Exciteer de monsters met een UV-laser voor de analyse van de Hoechst-kleurstof en een 488 nanometer laser voor de detectie van propidiumjodide- of GFP-positieve T-ALL-cellen.

Het aantal cellen, de kleurstofconcentratie, de incubatietemperatuur en de incubatieduur moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor elk verschillend gebruikt celtype. Veranderingen in elk van deze condities kunnen de resultaten van de assay drastisch beïnvloeden. Om de side population te identificeren onder T-ALL-cellen geïsoleerd uit zebravissen, worden eerst celresten en celklonten uitgesloten.

De opname van propidiumjodide en de GFP-expressie in een enkele celpopulatie worden vervolgens geanalyseerd om levende tumorcellen te identificeren. Om de side population te visualiseren, worden vervolgens de blauwe en rode emissies van de Hoechst-kleurstof vergeleken. De side population verschijnt als een zwakke staart van cellen die zich vanaf de linkerkant van de hoofdcelpopulatie uitstrekt naar de as van de blauwe fluorescentie.

Hier worden de resultaten gepresenteerd van de side population-analyse die is uitgevoerd voor twee verschillende tumorcelmonsters. In beide monsters werd een side population geïdentificeerd. De verschillende tumorstalen bevatten echter variërende aantallen side population-cellen.

Ongeacht het geanalyseerde tumoronderzoek resulteerde behandeling van het monster met de effluxremmer verapamil in het verdwijnen van het signaal dat bij de eerder geïdentificeerde cellen werd waargenomen, wat het fenotype van de side population verder bevestigt. Zodra de techniek onder de knie is, kan de side population-analyse bij een zebravis T-ALL in minder dan vier uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd zoals we hier hebben gepresenteerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de stappen te onthouden die zijn geoptimaliseerd voor zebravis T-ALL, zoals de incubatietemperatuur en -tijd, de kleurstofconcentratie en de effluxremmer.

Deze kunnen mogelijk moeten worden aangepast voor verschillende experimentele systemen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-isolatie of in vivo transplantatie-assays, worden uitgevoerd met gesorteerde side population-cellen om vragen over de functionaliteit en de genregulatie van de side population-cellen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de side population van cellen uit zebrafish T-cel acute lymfoblastische leukemie kunt isoleren.