Name: Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer hoe je hersentumorcellen transplanteert in zebravisembryo's voor langetermijnanalyse van tumorbiologie en drugrespons. Deze methode minimaliseert gastheertoxiciteit en ondersteunt in vivo onderzoek naar kinderkanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de twee recensenten voor uitstekende suggesties en verbeteringen aan het manuscript. We danken ook Huntsman Cancer Institute / University of Utah voor de veeteelt en onderhoud. Dit werk werd gefinancierd door de American Cancer Society (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), een NIH-subsidie ​​(P30 CA042014 CRR-programma), de Universiteit van Utah Seed Grant en de Huntsman Cancer Foundation.

Alle dierprocedures werden goedgekeurd en gevolgd door de richtlijnen voor dierenwelzijn van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Utah (IACUC # 16-03019). 1. Voorbereiding van de apparatuur voor de microinjectie <ol><li> De injectieplaat voorbereiden. <ol><li> Bereid een 50 ml oplossing van 1,2% agarose opgelost in ei water (0,6 g / L aquariumzout in omgekeerde osmose water + 0,01 mg / L methyleenblauw). Kook de oplossing tot de agarose oplost en vul vervolgens 0,05 mg / L methyleenblauw toe. Giet 25 ml van de uiteindelijke oplossing in een 10 cm Petri-schotel en laat het stollen. Plaats de resterende 25 ml agarose oplossing in een waterbad van 42 ° C tot u klaar bent voor stap 1.1.2. </li><li> Zet een beker van 2 inch in het midden van het gestolde oppervlak en giet de resterende 25 ml van 1,2% agarose. OPMERKING: dit creëert een injectieoppervlak op de rand van de plaat en een kern in het midden, welkeBiedt een gebied om de naaldgrootte en de suspensie van de tumor te testen. <ol><li> Bewaar de injectieplaat bij 28 ° C gedurende tenminste 30 minuten voor injectie of bij 4 ° C voor langdurige opslag. </li></ol></li></ol></li><li> Injectie naalden voorbereiden. <ol><li> Doe de naalden door 10 cm capillairen te trekken met een buitenafmeting van 1,2 mm en een binnenafmeting van 0,9 mm (zonder filament) in twee naalden op een naaldtrekker. OPMERKING: Elke naald moet 6 cm in totale lengte meten, waar ongeveer 1,5 cm van het uiteinde afneemt. </li><li> Plaats de naald voorzichtig op een microscoopglijbaan verpakt in plastic paraffine film. Gebruik een scheermesje om het uiteinde van de naald in een hoek van 45 ° te snijden om een ​​naald te creëren met een opening aan de punt. OPMERKING: Typisch wordt 0,1 mm tot 0,3 mm van het uiteinde van de naald verwijderd. Een afgeschuinde tip is niet nodig om de injecties uit te voeren. </li></ol></li><li> Bereid de microinjectie opstelling voor. <ol> &lt;Li&gt; Regel een standaard microinjectie setup, inclusief een stereomicroscoop, een manipulator en een microinjector voor de transplantatie. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van embryo&#39;s voor transplantatie <ol><li> Verzamel tot 500 mitfa w2 embryo&#39;s 44 (of embryo&#39;s van alle andere zebravis genotypen zoals gedefinieerd door de gebruiker) zoals beschreven 45 en onderhoud in een 28 ° C incubator. </li><li> Dekker de embryo&#39;s bij 24 pkf door 100 μL 10 mg / ml protease cocktailoplossing te verdunnen, verdund in ei water en roer voor ongeveer 20 minuten zachtjes. Spoel de embryo&#39;s 3 keer met vers ei water om het resterende protease te verwijderen. </li><li> Scherm de embryo&#39;s bij 48 pkf voor het passende ontwikkelingsfase, zoals gedefinieerd in de standaardcriteria voor de 45 kaders. Opmerking: alleen correcte en morfologisch normale embryo&#39;s dienen te worden gebruikt voor de transplantatie. </li><li> VerdovenOngeveer 20 48 pk embryo&#39;s in eiwit die 0,002% Tricaine-S bevatten in een petrischaal. Bevestig de juiste anesthesie door de beëindiging van de beweging in acht te nemen. </li></ol> 3. Tumor Cell Suspensie maken OPMERKING: Zebravis hersentumormodellen kunnen gegenereerd worden door genetische techniek combinaties van oncogenen en tumor suppressor genen 17 , 46 , 47 . Hier werd de sox10 promotor- aangedreven NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET zebravismodel gebruikt, zoals onlangs beschreven 17 . <ol><li> Euthanize een hersentumorende vis waarvan de tumorlast ongeveer 20% van de totale lichaamsgrootte is met behulp van een overdosis van 0,4% Tricaine-S, gevolgd door onderdompeling in ijswater volgens IACUC-goedgekeurde protocollen. </li><li> Dissect de fluorescent gelabelde tumor met een scheermesje en pincet onder een fluorescentieMicroscoop met behulp van steriele techniek en plaats deze in 5 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Exacte dissectiemethoden worden door gebruikers gedefinieerd en afhankelijk van het type tumor en weefsel. Zie de genoemde referenties voor gedetailleerde procedures voor de dissectie van verschillende zebravisorganen en hersentumoren 17 , 48 . </li><li> Manueel verstormen de tumormassa met behulp van een p1000 pipet tot een uniforme, bewolkte oplossing ontstaat. Verwijder grote deeltjes met een pipettip of gebruik een 40 μm celfilter (dit is afhankelijk van de tumor). Centrifugeer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 290 xg en verwijder het supernatant. Opmerking: Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) wordt niet uitgevoerd om tumorcellen te isoleren. Dit zorgt voor de transplantatie van een heterogene populatie van stromale, immuun- en tumorcellen. </li><li> Resuspendeer de tumorcelpellet in 100 μL steriele PBS en overbreng deze naar een 1,5 ml microCentrifuge buis. Neem 5 μL van de cel suspensie en verdun het in 250 μl PBS. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij 290 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in steriele PBS om de gewenste celconcentratie te verkrijgen. OPMERKING: cellen die resuspendeerd zijn in 30-40 μL steriele PBS geven gewoonlijk een oplossing die viscous en ondoorzichtig is (celconcentratie ≥100 cellen / nL) en de neiging om de meest succesvolle transplantaties te genereren. Cell levensvatbaarheid wordt niet beoordeeld. </li><li> Bewaar de tumor suspensie op een warmteblok van 28 ° C tijdens de transplantatie procedure. </li></ol> 4. Injectie van de Tumorsuspensie in de Vierde Ventrikel van een 2-dpf Embryo <ol><li> Vervoer 10-20 verdoofde embryo&#39;s (van stap 2.4) naar de periferie van de injectieplaat met behulp van een transferpipet; De embryo&#39;s zouden lateraal op de injectieplaat vallen, met de ventrikels duidelijk zichtbaar en toegankelijk. Gebruik een hoekige sonde om de embryo&#39;s zo nodig aan te passen en weg te plaatsen van de buitenkant van de injectieplaat. </li><li> Laad 1-2 μL van de tumorcel suspensie in de injectienaald met behulp van gel-laadpipetpunten en plaats de naald in de manipulator. </li><li> Handmatig de manipulator verlagen, met de naald in een hoek van 45 °. Stel de knoppen op de micromanipulator in de x, y en z richtingen aan tot de naald net boven en ongeveer 5 mm rechts van de embryo kop is. Kijk door de oculairen van de stereomicroscoop en stel de micromanipulator langzaam in de x-richting aan totdat de naald de vierde ventrikel van het embryo doorsteekt. Laat de naald niet door het hart of de dooier doorbreken. <ol><li> Duw het voetpedaal aan de microinjector vast om de tumorcel suspensie te injecteren. OPMERKING: De injectiedruk en de tijd zullen variëren op basis van de naaldboorgrootte, maar een goed beginpunt is 5 - 10 PSI en 50 - 100 ms.Het volume geïnjecteerde tumorcellen kan worden beoordeeld met standaard oliedruppeltegnieken door injectie in minerale olie, indien gewenst 49 . Injecties van 500 pL met een druppeldiameter van 0,1 mm geven meestal de beste resultaten. </li></ol></li><li> Spoel de geïnjecteerde embryo&#39;s voorzichtig uit de injectieplaat en in een petrischaal met vers ei water. Bewaar de embryo&#39;s in ei water voor de resterende procedures of totdat ze in tanks worden geteeld (zoals beschreven in stap 4.9.1). </li><li> Controleer de geïnjecteerde embryo&#39;s onder een fluorescentie stereomicroscoop. Bevestig dat de injectiedruk, de hoek, de naaldgrootte en de celverzettingsviscositeit resulteren in tumorcellen die 25-50% van de ventrikelruimte vullen. Pas deze parameters aan indien nodig. </li><li> Herhaal stap 4.1-4.5 voor eventuele resterende embryo&#39;s. Anesthetiseer de extra embryo&#39;s als nodig (beschreven in stap 2.4). OPMERKING: een ervaren gebruiker kan gedurende maximaal 3-4 uur tot 300 embryo&#39;s injecteren. </li><li> Plaats de embryo&#39;s weer inDe 28 ° C incubator &#39;s nachts. </li><li> De volgende dag beoordelen embryo-overleving door morfologische en fysiologische kenmerken te onderzoeken, zoals normale hart- en hersenontwikkeling, zoals beschreven 45 . </li><li> Voor het screenen verdoving van de embryo&#39;s, zoals beschreven in stap 2.4, op 1 dag na transplantatie (dpt). <ol><li> Gebruik een transferpipet om 4% methylcellulose op het midden van een petri schotel toe te voegen en voeg de embryo&#39;s toe aan de methylcellulose druppel. Richt de embryo&#39;s (ventrale zijde naar de lichtbron) met behulp van een hoekige sonde en scherm voor een consistente ingrijpingsgrootte met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Verwijder embryo&#39;s met tumorcellen die niet beperkt zijn tot de ventrikel of die die tumorcellen bevatten die minder dan 25% van de ventrikelruimte bevatten. Opmerking: Consistent engraftment wordt gedefinieerd als embryo&#39;s met een enkele tumormassa die 25-50% van de ventrikelruimte 17 omvat . Gebruik voor het screenen een fluorescentie sTereomicroscoop met een 1X objectief, een 0,15 numerieke diafragma, een vergroting variërend van 0,7-1,6X en een belichtingstijd van 50 ms tot 1 s. Voor alle afbeeldingen, gebruik het heldere veldkanaal naast het GFP- of RFP-kanaal. </li><li> Voor het onderhoud van tumoren, plaats de getransplanteerde embryo&#39;s in tanks 45 bij 8 dpf (6 dpt). </li></ol></li></ol> 5. Imaging Transplanted Embryo&#39;s voor Cellulaire Gedrag <ol><li> Verdoof de embryo&#39;s bij 3-8 dpf (1-6 dpt) en plaats de dorsale zijde tegen de deklaag in 1,2% laagsmelt agarose. Voer tijdloperbeelden van de gemonteerde embryo&#39;s uit door gebruik te maken van een laser-scan-confocale microscoop voor de gewenste tijdsperiode om cellulaire gedragingen, zoals migratie, celverdeling of cel-cel interacties, zoals nodig 38 , 43 , 53 te visualiseren. OPMERKING: gebruik een aspect ratio van 1.024 x 1.024, een scansnelheid van 8 &amp; #181; s / pixel. Gebruik scan gemiddelde en bepaal de z-diepte afmetingen om de volledige tumormassa (1000-1.500 μm) te waarborgen. Voer bovendien 4-h time-lapse experimenten uit, waarbij u elke 10-15 minuten een afbeelding krijgt met een 40x doel, om invasieve gedrag te controleren. De detector gevoeligheid zal variëren afhankelijk van de intensiteit van de tumor massa, en de laser vermogen zal afhankelijk zijn van microscoop, maar het wordt algemeen aanbevolen om tussen 15 en 40% te zijn. </li><li> Zodra de beeldvorming is voltooid, bevrijd het gemonteerde embryo uit de agarose met behulp van een hoekige sonde en plaats het op een petri schotel met vers ei water. </li></ol> 6. Drug Administration naar Transplanted Embryos en de Beoordeling van Tumor Burden 17 <ol><li> Verdoof embryo&#39;s bij 3 dpf en geef ze in 4% methylcellulose, met de ventrale zijde naar de lichtbron gericht. Afbeelding van de voorbehandeling embryo&#39;s met behulp van een fluorescentiemicroscoop 17 . </li><li> PlaCe de getransplanteerde embryo&#39;s bij 3 dpf in een 12-putje plaat, met 10 embryo&#39;s per putje in 0,5 ml ei water. Voeg de juiste hoeveelheid geneesmiddel toe om de gewenste eindconcentratie te verkrijgen ( bijv. 50 μM MEK-remmer) en retour de embryo&#39;s naar een 28 ° C incubator. De volgende dag, verwijder het behandelde eiwand met een dunboring transferpipet en voeg de nieuwe behandeling toe. Herhaal dit dagelijks tot de embryo&#39;s 8 dpf bereiken. </li><li> Bij 8 dpf verwijder de embryo&#39;s uit de behandeling en plaats ze in vers ei water. Verdoof de embryo&#39;s en oriëntatie (ventrale zijde naar de lichtbron) in 4% methylcellulose. Beeldembryo&#39;s na behandeling met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Kwantificeer het tumorgebied met behulp van geschikte software, zoals beschreven 17 . </li><li> Scheep de embryo&#39;s per behandeling en plaats ze in tanks om te groeien. Na 4-9 weken anesthetiseren de vis en beoordelen ze voor de totale tumorbelasting met behulp van een standaard fluorescentie stereomicroscoop, zoals d17 afgesloten. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte transplantatie-analyse die de injectie van zebravistumoren in de hartslag van een 2-dpf-embryo omvat die een volledig bevochtig immuunsysteem zal ontwikkelen. Tot nu toe zijn zebravis CNS-PNET 17 en melanoom (data niet getoond) succesvol getransplanteerd voor langetermijnstudies van tumorcelgedrag en invasie. De kritische stappen van dit protocol omvatten het waarborgen van de juiste naaldboorgrootte en de juiste tumorcel-suspensie en adequaat verdoving van gastheerembryo&#39;s. Voor elke individuele onderzoeker kan verdere optimalisatie van deze techniek de aanpassing van de tumorcelconcentratie, injectiedruk en embryo-oriëntatie omvatten. Bovendien kan er heterogeniteit zijn in de viscositeit van suspensies die afkomstig zijn van verschillende tumoren, zodat verschillende tumortypen nauwelijks moeilijk kunnen worden opschort en transplanteren. Door echter de naaldboorgrootte aan te passen en diffe te gebruikenHuurverdunningen van de tumor suspensie, het is mogelijk om problemen die verband houden met tumorviscositeiten te overwinnen. In onze ervaring zijn de meest voorkomende redenen voor dunne cellen / inconsistente celmassa&#39;s in de ventrikel als volgt: 1) de tumorcel suspensie is te verdund; 2) de naaldboorgrootte is te klein; 3) de injectietijd en de druk zijn te laag; En / of 4) overgebleven weefsel werden niet van de tumor gefiltreerd en in de naald geplaatst. Wanneer de tumorcel suspensie na de injectie uit de ventrikel loopt, is het waarschijnlijk het gevolg van: 1) de plaatsing van de naald tegen de vloer van de ventrikel; 2) een hoge injectiedruk en tijd; En / of 3) een te grote boorgrootte. Lage overleving van getransplanteerde embryo&#39;s kan worden veroorzaakt door: 1) verdovende embryo&#39;s gedurende een langere periode; 2) het verlaten van embryo&#39;s op de injectieplaat om te drogen; 3) de injectie van luchtbellen in de ventrikel; En / of 4) piercing vitale organen, zoals de hersenen enHart, omdat de naald door de ventrikel ging. Eerdere methoden van tumortransplantatie in de volwassen of embryonale zebravisbrein zijn afhankelijk van immunosuppressie bij volwassenen (genetisch, farmacologisch of via straling) of zijn beperkt tot korte termijn studies van menselijke of muiscellen in embryo&#39;s 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Bijvoorbeeld, muishersen tumoren kunnen intranasaal worden geïnjecteerd in dexamethason-immuun-onderdrukte, 30-dpf, jeugdige zebravissen voor gebruik in korte termijn (~ 2 dagen) preklinische geneesmiddelanalyses 54 . De injectieplaats in deze experimenten wordt echter door de schedel- en hersenweefsel verduisterd en resulteert waarschijnlijk in schade aan normaal hersenweefsel, waardoor de levensvatbaarheid van de gastheer en de ingrijpingsefficiëntie wordt verminderd. Een andere recent beschreven werkwijze omvat de injectie van menselijke gliobLastoma cellijnen in de midbrain regio van zebravis embryo&#39;s, waardoor de korte termijn analyse van groei, invasie en drug reactie 43 mogelijk gemaakt . Nogmaals, de precieze plaats van de injectieplaats is variabel en beschadigt normaliter normaal weefsel. Zo hebben vroegere methoden van embryonale hersentransplantaties vaak de levensvatbaarheid van de gastheren in gevaar gebracht, waardoor deze studies beperkt zijn tot een korte termijnanalyse ( dwz 2 tot 14 dagen), waardoor de variatie tussen individuele injecties veroorzaakt wordt door de verduisterde injectieplaatsen, waardoor de long- Termijnanalyse van celgedrag en drugresponsen of van transplantatie over meerdere generaties. De hier beschreven werkwijze richt zich op de huidige beperkingen in zebravis embryonale en immuun-gecompromitteerde transplantatietechnieken door onderzoekers in staat te stellen: 1) reproduceerbaar op dezelfde locatie te injecteren, met minimale schade aan het omliggende weefsel; 2) de plaats van injectie direct visualiseren om te maximaliserenEngraftment efficiency; 3) honderden embryo&#39;s per dag transplanteren; 4) tumoren laten groeien in immuun-competente dieren; 5) het mogelijk maken om het gedrag van tumorcellen en duurzame geneesmiddelenreacties over het leven van de zebravis te monitoren; En 6) de re-transplantatie van tumoren over vele generaties mogelijk maken voor mogelijke studies over tumor evolutie of drug terugval mechanismen. Bovendien stelt dit protocol onderzoekers in staat om elk zebravisgenotype te gebruiken voor de beoordeling van gastheerrespons, inclusief verschillende immuunpopulaties. Deze eigenschappen maken deze methode gemakkelijk aan te passen door een lab dat al standaard microinjecties in zebravis uitvoert. Tenslotte, hoewel deze methode ideaal is voor orthotopische injecties van zebravis hersentumoren bij het transplanteren van andere tumortypen, zoals lever of pancreas, kan de orthotopische plaats belangrijker zijn dan immuuncompetentie ( bijv. Als een onderzoeker de effecten van de stromale Micro-omgeving op tumorgroei). In dit scenario, deNieuw ontwikkelde immuun-deficiënte zebravismodellen kunnen meer geschikt zijn voor het uitvoeren van orthotopische tumortransplantaties 11 . Dit protocol is gebruikt om tumorcelcompetitiebepalingen uit te voeren en dubbelgemerkte tumoren te injecteren. Een mogelijke behandelingsstrategie voor de beoordeling van de effectiviteit van chemische verbindingen op tumorigenese, waarbij de behandeling van embryo&#39;s na transplantatie via de toevoeging van het geneesmiddel naar water wordt behandeld, werd ook besproken. Een werkwijze voor de ex vivo behandeling van tumorcellen voorafgaand aan transplantatie werd ook eerder gemeld 17 . Daarnaast zijn getransplanteerde tumoren samengevoegd voor meerdere ronden van re-transplantatie, die gunstig zullen zijn voor studies van tumor evolutie en chemoresistentie 17 . Momenteel zijn preklinische studies afhankelijk van muizen xenografen om de werkzaamheid van potentiële verbindingen te beoordelen. Deze studies zijn echter tijdrovendEn kostbaar. Gezien de hoge mate van instandhouding van oncogene signaleringsbanen tussen zebravis en mensen 28 , kan men verwachten dat deze methode de conventionele muis- en menselijke celstudies zal aanvullen om de snellere identificatie van effectieve verbindingen in preklinische en klinische proeven mogelijk te maken. Uiteindelijk kan deze methode nuttig zijn voor de snelle chemische screening van primaire patiënttumoren, die het gepersonaliseerde initiatief verder kunnen voortzetten. De voorwaarden voor de langetermijngroei van menselijke cellen in zebravis (volwassen of embryo) moeten echter nog worden geïdentificeerd.

De transplantatie van tumorcellen in immuun-gecompromitteerde dieren, in het bijzonder muis xenografen, is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om mechanismen te bestuderen die kankercelsproliferatie 1 , 2 , overleving, invasie en metastase 3 , 4 bestrijden en een platform bieden Voor het screenen van drugs 5 , 6 , 7 . Meer recent is de transplantatie van primaire tumormonsters in immuun-gecompromitteerde muizen gebruikt om patiëntgerelateerde xenograftmodellen (PDX) te genereren voor diagnostische en preklinische drugscreeningsdoeleinden en is de ruggengraat van het gepersonaliseerde medicijninitiatief 8 , 9 , 10 , 11 . Echter, significante bewijzen blijkt dat het moduleren van het immuunsysteemStam kan een dramatische invloed hebben op tumorgedrag en patiëntuitkomst 12 , 13 . Dit heeft de herontwerp van xenograft-gebaseerde technieken aangedreven om &quot;gehumaniseerde&quot; muizen te omvatten, waarin het immuunsysteem van de muis wordt gereconstitueerd door co-transplantatie van menselijke immuuncellen met tumorcellen. Deze aanpak is echter technisch uitdagend, met variabele reproduceerbaarheid en toxiciteiten die verband houden met de techniek, naast de significante kosten 14 , 15 . Zo zijn nieuwe transplantatietechnieken in immuunvaardige dieren nodig om de ontdekking van immuun- en tumor-specifieke mechanismen van kankerprogressie en drugrespons te versnellen. Zebravis zijn een alternatief diermodel voor de studie van menselijke kanker, met meer dan 20 kankermodellen die nu 16 zijn , waaronder zeer kwaadaardige hersenen 17 , mela<html> Noma 18 , 19 , 20 en pancreaskanker 21 , 22 , evenals veel leukemieën 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Twee eigenschappen van het zebravissysteem maken het bijzonder vatbaar voor kankeronderzoek: 1) de optische helderheid van doorschijnende dieren zorgt voor een directe visualisatie van kankercelgedrag ( dwz proliferatie, overleving, invasie en verspreiding) met behulp van eenvoudige microscopietheorieën en 2) Vrouwelijke zebravis kan tot 200 embryo&#39;s per dag produceren, waardoor de dierencijfers snel worden verlaagd voor genetische of drugscreening tegen lage kosten. Daarnaast zijn de kankergenomen van zebravis en mensen sterk bewaard (waaronder oncogenes en tumor-suppressorgenen)F &quot;&gt; 28, waardoor mechanistische en drug ontdekkingen snel vertaald kunnen worden naar zoogdier systemen. Deze eigenschappen maken ook de zebravis een ideaal diermodel voor transplantatietechnieken, die gebruik maken van de beeldvorming, schaalbaarheid en lage kosten van het systeem. Vorige onderzoeken over tumortransplantatie bij immuun-gecompromitteerde zebravis hebben de identificatie van zelfvernieuwende vermogens, tumor maligniteit en invasie / verspreiding 11 , 29 vergemakkelijkt. Korte termijn studies van tumorcel gedrag kunnen worden uitgevoerd na transplantatie in γ-bestraalde volwassenen, wier immuunsysteem effectief wordt onderdrukt voor ~ 20 dagen 11 , 30 . De behandeling van volwassen zebravis met dexamethason vermindert B- en T-cellen gedurende maximaal 30 dagen voordat de afwijzing plaatsvindt 31 . Een andere minder voorkomende strategie maakt gebruik van clonale zebravisstammenDie langdurige onderzoeken mogelijk maken in een immuuncompetente gastheer 32 . Echter, slechts een beperkt aantal clonale stammen zijn gegenereerd en zijn moeilijk te handhaven door lage fecunditeit. Daarnaast worden de meeste van de gevestigde zebravistumormodellen gegenereerd in andere genetische achtergronden, zodat deze tumoren niet in de klonistammen kunnen worden getransplanteerd zonder het immuunsysteem 11 , 33 , 34 te onderdrukken. Meer recente benaderingen om transplantatieonderzoeken te verbeteren, zijn onder meer de ontwikkeling van de mutagene lijn van rag2 E450fs , met gecompromitteerde B- en T-celfuncties, die gebruikt zijn om succesvol meerdere kankers 35 , 36 te transplanteren. Om de eis van clonale zebravislijnen of een immuungemeneerde gastheer te omzeilen, hebben een aantal groepen vroege embryo&#39;s gebruikt ( dwz &gt; 72 pkOste-bevruchting (hpf)) voor humane tumorceltransplantatie, aangezien deze embryo&#39;s nog niet een adaptief immuunsysteem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 volledig hebben ontwikkeld. Deze methoden zijn echter beperkt tot de korte termijn analyse van tumorcelgedrag of drugrespons (meestal minder dan 2 weken) omdat de menselijke kankercellen of de transplantatietechniek zelf de gastheer doden, langetermijnstudies en hertransplantatie voorkomen. Dit protocol beschrijft een gewijzigde embryonale transplantatie methode in het lumen van de vierde ventrikel van een 2-dagen post-fertilisatie (dpf) embryo hersenen. Het minimaliseert toxiciteit aan de gastheer en kan gecombineerd worden met zebravis hersentumormodellen voor de langetermijngroepering van tumorcellen. Aldus, deze techniek alLaagtepunten voor de hertransplantatie van tumorcellen in nieuwe gastheren over vele generaties, waardoor toekomstige studies over tumor heterogeniteit, gastheer / immuunrespons, drugrespons of metastatisch potentieel worden vergemakkelijkt. Deze methode is ook eenvoudig, efficiënt en schaalbaar, aangezien maximaal 300 transplantaties kunnen worden uitgevoerd door een enkele gebruiker per dag, met maximaal 90% engraftment. Dit zorgt voor de snelle voortplanting van enkele primaire tumoren in honderden embryo&#39;s bij 2 dpf voor genetische of drugscreeningsprojecten of om het gedrag van hersentumorcel in verschillende gastachtergronden over meerdere maanden direct te visualiseren.

<table><tbody><tr><td>Eiwater</td><td>in huis</td><td></td><td>onderhoud embryo's, het maken van injectieplaat&nbsp;</td></tr><tr><td>Methyleenblauw&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>toevoegen aan eiwater om schimmelgroei te voorkomen</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z&nbsp;</td><td>huisvesting embryo's, het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>50 mL&nbsp; beker (2 inch diameter)</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>Glazen container</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>tumor dissectie</td></tr><tr><td>Vleesmes</td><td>Thermo Fisher</td><td>12640</td><td>naaldvoorbereiding, tumor dissectie</td></tr><tr><td>Glazen plaatje omwikkeld met parafilm</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>naaldvoorbereiding</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing 1x, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>Celzeef, 40 &micro;m</td><td>Corning Falcon</td><td>352340</td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>1.000 &micro;L filtertips</td><td>elk commercieel merk</td><td></td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>100 &micro;L filtertips</td><td>elk commercieel merk</td><td></td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>50 mL conische buisjes</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-108</td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>15 mL conische buisjes</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-103&nbsp;</td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>1,7 mL microbuisjes</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-281</td><td>tumor resuspendering</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>tumor resuspendering en transplantatie</td></tr><tr><td>Glazen capillair (geen filament)</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp;TW120-4</td><td>tumortransplantatie</td></tr><tr><td>Naaldtrekker</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>tumortransplantatie</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>tumortransplantatie</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-90</td><td>tumortransplantatie</td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>TRS1</td><td>tumortransplantatie, anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Hoekige sonde</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-02</td><td>embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Transfer pijpje</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>embryo manipulatie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>vereist tijdens tumor resuspendering</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>vereist tijdens tumor resuspendering</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>tumortransplantatie</td></tr><tr><td>Fluorescentie stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>beeldvorming van tumortransplantaten</td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Olympus</td><td>DP-72</td><td>beeldvorming van tumortransplantaten</td></tr><tr><td>Methylcellulose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td>beeldvorming van tumortransplantaten</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>onderhoud embryo's, opwarmen injectieplaat</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>het maken van injectieplaat</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>alle aspecten van het protocol</td></tr><tr><td>Low Melt Agar-agar</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>confocale beeldvorming van embryo's</td></tr><tr><td>Glazen bodemschaal</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td>confocale beeldvorming van embryo's</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FLUOVIEW FV1200</td><td>confocale beeldvorming van embryo's</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11459643001</td><td>dechorioneerde embryo's</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>resuspendering tumor/tumorcellen</td></tr><tr><td>12-wells plaat</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>geneesmiddelbehandeling van embryo's</td></tr><tr><td>Fijne transferpijpjes</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>geneesmiddelbehandeling van embryo's</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>Voor het tellen van tumorcellen in suspensie</td></tr><tr><td>N2</td><td>Elk commercieel merk</td><td></td><td>Voor de opstelling van microinjector</td></tr></tbody></table>

transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumorceltransplantatie is een belangrijke techniek om de mechanismen te bepalen die kankercelgroei, migratie en gastrespons bepalen, evenals potentiële patiëntenrespons op de therapie beoordelen. Huidige methoden zijn grotendeels afhankelijk van het gebruik van syngeneen- of immuun-gecompromitteerde dieren om afwijzing van het tumorgraft te vermijden. Dergelijke methoden vereisen het gebruik van specifieke genetische stammen die vaak de analyse van immuun-tumorcelinteracties voorkomen en / of zijn beperkt tot specifieke genetische achtergronden. Een alternatieve methode bij zebravis maakt gebruik van een onvoltooid ontwikkeld immuunsysteem in de embryonale hersenen voor 3 dagen, waarbij tumorcellen worden getransplanteerd voor gebruik bij korte analyses ( dwz 3 tot 10 dagen). Deze methoden veroorzaken echter gastvrijheid, die de langetermijnstudie van tumorcelgedrag en drugrespons voorkomt. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de langdurige orthotopische transplantatie van zebravis hersentumorweefsel inNaar de vierde ventrikel van een 2-daagse immuun-competente zebravis. Deze methode maakt het mogelijk om: 1) langdurige studie van tumorcelgedrag, zoals invasie en verspreiding; 2) duurzaam tumorrespons op drugs; En 3) re-transplantatie van tumoren voor de studie van tumor evolutie en / of de impact van verschillende gastheergenetische achtergronden. Kortom, deze techniek stelt kankeronderzoekers in staat om engraftment, invasie en groei op afgelegen plaatsen te beoordelen, evenals chemische schermen en celcompetitieonderzoeken gedurende vele maanden. Dit protocol kan uitgebreid worden naar studies van andere tumortypen en kunnen gebruikt worden om mechanismen van chemoresistentie en metastase te verhelderen.

Tumor transplantatie en engraftment Een schematische omtrek van de procedure is weergegeven in figuur 1 . Fluorescente gemerkte tumorcellen worden geëxtraheerd uit de primaire orgaanplaats en een enkelcelsuspensie wordt gegenereerd voor transplantatie in de vierde ventrikel van 2-dpf mitfa w2 zebravis embryo&#39;s 44 . Figuur 2 toont de representatieve resultaten voor deze methode met behulp van een zebravismodel van primitieve neurale ectodermale tumor (CNS-PNET) van het centraal zenuwstelsel, waarbij de sox10 promotor expressie van wildtype NRAS of geactiveerde NRAS versmelt met mCherry in p53- deficiënte oligonale precursorcellen 17 . De mitfa w2 zebravis 44 mutant, die geen melanophoren heeft, werden gebruikt om gemakkelijker te visualiserenDe tumorcellen na transplantatie en / of volwassenheid. Andere pigmentmutanten zouden ook kunnen worden gebruikt om extra beeldhelderheid te verschaffen, zoals Casper 50 . Al vanaf 24 uur na transplantatie kunnen tumorcellen worden gezien in het omringende hersenweefsel ( Figuur 2A , 3 dpf, pijlen). Tumortransplantaten blijven de komende week groeien in de ventrikel en het omringende hersenweefsel ( Figuur 2A , 8 dpf). Op dit moment kan fluorescentie ook in het gebied van de nieren waargenomen worden ( Figuur 2A , sterretjes). Dit kan het gevolg zijn van de nieren die de cellulaire rommel filteren van de transplantatie, die consistent is met eerdere studies die fluorescerende kleurstoffen gebruiken als een test om nierfunctie 51 te evalueren. Tumorcellen blijven prolifereren en invallen, dus bij 28 dpf kan een tumormassa door de zebravis hersenen worden gezien ( Figuur 2A , 28 dpf). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Deze techniek zorgt voor de snelle transplantatie van tumorcellen in honderden embryo&#39;s met reproduceerbare consistentie, omdat de injectieplaats nauwkeurig kan worden getoetst met minimale schade aan de gastheer. Een representatieve groep embryo&#39;s die met mCherry-gemerkte hersentumorcellen zijn getransplanteerd, wordt getoond in het bovenste paneel van Figuur 2B . Tumor engraftment wordt typisch bereikt in 80-90% embryo&#39;s, en tumor transplantaties blijven volwassen tot volwassenheid; Drie representatieve voorbeelden worden getoond in de onderste panelen van figuur 2B . Dit zorgt ervoor dat de tumortransplantaties over meerdere generaties worden geoogst en bevroren of opnieuw getransplanteerd. Tumor invasie en drug reacties Figuur 3A toont een co-transplantatie schema waarin twee verschillende tumoren gemerkt met ofwel GFP (Tumor A) of mCherry (Tumor B) worden geoogst door heel-inchOf dissociatie (let op dat FACS hier niet wordt gebruikt, maar FACS-gesorteerd tumorcellen kunnen indien nodig gebruikt worden). Tumor A en B kunnen van verschillende locaties komen, geïnduceerd met verschillende oncogenen, of geïnduceerd in verschillende genetische achtergronden. Elke tumor wordt verwerkt tot een enkelcelsuspensie, en tumorcellen worden dan gemengd bij een 1: 1 verhouding en getransplanteerd in het 2-dpf embryo. Tumor eigenschappen, zoals engraftment, groei, invasie en verspreiding van Tumor A versus Tumor B kunnen dan in dezelfde gastheer waargenomen worden die interne controles voor de techniek en genetische achtergrond toelaten. In Figuur 3B werden een NRAS-gedreven , mCherry-gemarkeerd zebravis-CNS-PNET uit het optische tectum en een GFP-gemerkt CNS-PNET uit het cerebellum geoogst en verwerkt tot enkel-cel suspensies. Cellen werden geteld en een gelijk aantal cellen uit elke tumor werden gemengd en getransplanteerd in 2-dpf embryo&#39;s. Vier dNa de transplantatie werden de embryo&#39;s afgebeeld met confocale microscopie. Getoond is een representatief embryo dat aantoont dat de tectum tumorcellen (rood) meer uitgebreid migreren naar de gastheerbrein (pijlen) dan de cerebellaire tumor. Embryo&#39;s die getransplanteerd zijn met fluorescente gelabelde tumorcellen kunnen gebruikt worden in geneesmiddelenbehandelingsregimes om verbindingen te identificeren die tumorgroei remmen. Figuur 3C is een typische tijdlijn voor het behandelen en imaging van tumortransplantaties. 24 uur na de transplantatie worden embryo&#39;s toegankelijk voor consistente engraftment grootte en verdeeld in behandelingsgroepen. In het voorbeeld worden embryo&#39;s getransplanteerd met NRAS-gedreven , mCherry-gemarkeerde zebravis CNS-PNETs behandeld met 50 μM dimethylsulfoxide (DMSO) of MEK-remmer (AZD6244). Embryo&#39;s worden 5 dagen behandeld en afgebeeld bij 8 dpf, zoals omschreven in figuur 3C . Figuur 3D (linkspanelen) toont representatief<html> E dieren uit de twee behandelingsgroepen. MEK-remmerbehandelde embryo&#39;s hebben een significant lagere hoeveelheid fluorescentie dan die welke werden behandeld met DMSO, zoals beschreven 17 . Nadat de dieren zijn afgebeeld, worden ze overgebracht naar tanks zonder drugs en gedurende twee maanden gecontroleerd op tumorgroei. In het voorbeeld verschaft de MEK-remmerbehandeling een duurzame respons in de volwassen vis ( Figuur 3D , rechterpanelen). Voor nadere details over de behandeling van geneesmiddelen, beeldvorming en kwantificering, zie referentie 17 . <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig1.jpg" /> Figuur 1: Schematisch protocol van tumorcellertransplantatie in de vierde ventrikel van 2-dpf Zebrafish embryo&#39;s. Algemeen schema van secties 3 tot en met 4 van het protocol inclusief alternatieve eindpuntanalyses (secties 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig2.jpg" /> Figuur 2: Tumor Engraftment en Progressie. (A) Zebravis primaire CNS-PNET 17 tumorcellen gemerkt met mCherry werden getransplanteerd in de vierde ventrikel van 2-dpf embryo&#39;s. Bij 3 dpf worden tumorcellen gezien in het omringende hersenweefsel (pijlen). Bij 8 dpf groeien tumorcellen in de ventrikel; Rode tumorcellen zijn ook aanwezig in het omringende hersenweefsel en nieren (asterisken). Bij 28 dpf hebben tumorencellen de gehele gastheerbrein binnengevallen en groeien. (B) Bovenste paneel. Zeven 3-dpf embryo&#39;s getransplanteerd met mCherry-gemarkeerde zebravis hersentumorencellen. Tumorcellen kunnen consistent worden getransplanteerd in honderden embryo&#39;s, met een hoge engraftment rate ( dwz typisch 85/100 embryo&#39;s). Midden enBodempanelen. Drie representatieve volwassen vis met getransplanteerde tumoren 4-8 weken na bevruchting (wpf). Tumoren kunnen worden weergegeven door middel van fluorescentiemicroscopie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig3.jpg" /> Figuur 3: Tumor Invasie en Drugrespons vergelijken. ( A ) CNS-PNETs 17 van het optische tectum of cerebellum zijn geëtiketteerd met respectievelijk mCherry of GFP, verwerkt in een enkelcelsuspensie, gemengd bij een verhouding van 1: 1 en gecombineerd in 2-dpf embryo&#39;s. ( B ) Een 6-dpf-embryo dat gecombineerd is met een gemengde suspensie van GFP-gemerkte cerebellaire tumorcellen en mCherry-gemerkte tumorcellen uit het optische tectum. Verschillen in de invasieve eigenschappen van elke tumor in tHij zelfde ontvanger kan worden waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie. In dit voorbeeld migreren mCherry-gemarkeerde tumorcellen meer uitgebreid dan die gemarkeerd met GFP (pijlen). ( C ) Tijdlijn voor geneesmiddelbehandeling op embryo&#39;s getransplanteerd met tumorcellen. ( D ) Beelden van representatieve dieren aan het einde van het behandelingsregime (8 dpf) en 8 weken na behandeling (8 wpf), met ofwel een DMSO controle of een 50 μM MEK inhibitor. Tumorlast kan worden gemeten door fluorescentie te kwantificeren, zoals beschreven 17 . In dit experiment wordt de groei van mCherry-gemarkeerde tumorcellen gereduceerd in MEK-remmerbehandelde embryo&#39;s en vertaalt zich in een duurzame respons bij de volwassenen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo&#39;s voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Het algemene doel van deze procedure is om langdurige beoordeling van het gedrag van tumorcellen, zoals invasie en verspreiding, mogelijk te maken en potentiële therapieën te testen in een immuuncompetente diergastheer. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van pediatrische hersenkanker, waaronder de duur van een medicijnrespons en de mechanismen die invasie en verspreiding aansturen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de toxiciteit voor de gastheer minimaliseert, wat een blijvende transplantatie van tumorcellen en daarmee langetermijnstudies naar de biologie van hersenkanker mogelijk maakt.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hersenkanker, omdat de tumorlast in vivo direct kan worden beoordeeld na medicamenteuze behandeling. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode problemen ondervinden als de tumorcel-suspensie te geconcentreerd of te verdunt is, waardoor het moeilijk wordt om consistente hoeveelheden in het vierde ventrikel te injecteren. Begin met het bereiden van een oplossing van 50 milliliter 1,2% agarose opgelost in egg water.Kook de oplossing totdat de agarose is opgelost en vul deze vervolgens aan door 05 milligram per liter methyleenblauw toe te voegen. Giet 25 milliliter van de uiteindelijke oplossing in een petri-schaal van 10 centimeter en laat deze stollen. Plaats de resterende 25 milliliter agarose-oplossing in een waterbad van 42 °C.Plaats vervolgens een bekerglas met een diameter van twee inch in het midden van het gestolde oppervlak en giet de resterende 25 milliliters 1,2% agarose over de vorige laag. Houd de injectieplaat op 28 graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan de injectie, of op vier graden Celsius voor langdurige bewaring. Maak de naalden door met een naaldtrekker capillairen van 10 centimeter te trekken met een buitenmaat van 1,2 millimeters en een binnenmaat van 0,9 millimeters.Plaats de naald voorzichtig op een microscoopglas dat is omwikkeld met plastic paraffinefolie. Gebruik vervolgens een scheermesje om het uiteinde van de naald in een hoek van 45 graden af te snijden, zodat er een naald ontstaat met een opening aan de punt. Nadat een vis met een hersentumor is geëuthanaseerd en de tumor volgens het tekstprotocol is gedissekeerd, wordt een P1000 handmatig gebruikt om de tumormassa te homogeniseren totdat er een uniforme, troebele oplossing ontstaat.Gebruik een pipet of een cellzeef van 40 micron om grote partikels te verwijderen. Centrifugeer de suspensie vervolgens bij 290 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de tumorcelpellet in 100 µL steriele PBS en breng deze over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.Gebruik 250 µL PBS om vijf µL van de celsuspensie te verdunnen. Gebruik vervolgens een hemocytometer om het aantal cellen te tellen. Centrifugeer de suspensie bij 290 ×g gedurende drie minuten.Verwijder het supernatant en gebruik steriele PBS om de pellet opnieuw te suspenderen om de gewenste celconcentratie te verkrijgen. Bewaar de tumorsuspensie op een warmteblok van 28 °C tijdens de transplantatieprocedure. Breng met een transferpipet 10 tot 20 geanestheseerde embryo's over naar de rand van de injectieplaat.De embryo's moeten zijwaarts vallen, waarbij de ventrikels duidelijk zichtbaar en toegankelijk zijn. Gebruik een geknikte probe om de embryo's naar behoefte aan te passen en positioneer ze weg van de buitenrand van de injectieplaat. Gebruik vervolgens een gel-laadpunt om één tot twee µL van de tumorcel-suspensie in de injectienaald te laden en plaats de naald in de manipulator.Laat vervolgens de manipulator handmatig zakken, terwijl de naald in een hoek van 45 graden wordt gehouden. Pas de knoppen van de micromanipulator in de x-, y- en z-richting aan totdat de naald zich net boven en ongeveer vijf millimeter rechts van de kop van het embryo bevindt. Pas met behulp van een stereomicroscoop de micromanipulator langzaam in de x-richting aan totdat de naald het vierde ventrikel van het embryo doorboort.Zorg dat de naald het hart of de dooier niet doorboort. Voor consistente injecties moeten de embryo's worden geanestheseerd, moet de tumor correct worden gedissocieerd tot een cellsuspensie, en moet de naald het vierde ventrikel doorboren zonder door te lopen tot in het hart. Druk op het voetpedaal van de micro-injector om de tumorcelsuspensie te injecteren.Wanneer de injectie is voltooid, gebruik dan vers eiwater om de geïnjecteerde embryo's voorzichtig van de injectieplaat af te spoelen naar een petrischaal. Inspecteer de geïnjecteerde embryo's vervolgens onder een fluorescent stereomicroscoop in een donkere kamer. Bevestig dat de injectiedruk, de hoek, de naaldgrootte en de viscositeit van de celsuspensie ertoe leiden dat tumorcellen 25 tot 50% van de ventrikelruimte vullen.Plaats de embryo's gedurende de nacht terug in de incubator op 28 graden Celsius. Beoordeel de volgende dag de overleving van de embryo's door morfologische en fysiologische kenmerken te onderzoeken, zoals een normale hart- en hersenontwikkeling, zoals eerder beschreven. Gebruik een transferpipet om 4% methylcellulose in het midden van een petrischaal aan te brengen en voeg de geanestheseerde embryo's toe aan de druppel methylcellulose.Gebruik een schuine probe om de embryo's te oriënteren en screen onder de fluorescentiemicroscoop op een consistente grootte van de transplantatie. Voor het onderhoud van de tumoren: zodra de embryo's acht dagen na bevruchting hebben bereikt, plaatst u de getransplanteerde embryo's in tanks om verder te groeien. Maak beelden en voer aanvullende studies uit volgens het tekstprotocol.In dit experiment werden primitieve neurale ectodermale tumorcellen van het centrale zenuwstelsel getransplanteerd in de mitfa-zebravismutant die melanoforen mist. Al vanaf 24 uur na transplantatie is te zien dat tumorcellen het omliggende hersenweefsel binnendringen. De tumorgraften blijven gedurende de volgende week groeien in het ventrikel en het omliggende hersenweefsel, en fluorescentie kan ook worden waargenomen in de regio van de nieren.Tumorcellen blijven prolifereren en invaderen, waardoor er tegen 28 dagen na de bevruchting een tumormassa in het gehele brein van de zebravis zichtbaar is. In deze figuur wordt een representatieve groep zebravissen getoond die zijn getransplanteerd met mCherry-gelabelde hersentumorcellen. De transplantatie van tumorcellen slaagt doorgaans bij 80 tot 90% van de zebravissen, en de tumortransplantaten blijven behouden tot in de volwassen fase.In dit experiment werden een NRAS-gedreven, mCherry-gelabelde zebrafish CNS-PNET uit het optic tectum en een GFP-gelabelde CNS-PNET uit het cerebellum geoogst door middel van volledige tumordissociatie, verwerkt tot een single-cell suspensie en vervolgens in een een-op-een verhouding gemengd vóór transplantatie. Dit representatieve embryo, dat vier dagen na transplantatie werd afgebeeld, laat zien dat de tumorcellen uit het optic tectum, in het rood, uitgebreider migreren in de hersenen van de gastheer dan de cerebellaire tumor. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen ongeveer 300 embryo's in drie tot vier uur worden geïnjecteerd.Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals live-imaging bij dieren en toediening van geneesmiddelen, worden uitgevoerd om extra vragen te beantwoorden over tumorcelbiologie, medicijnrespons en chemoristentie. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van zebraviskanker-modellering om nieuwe remmers te onderzoeken voor de behandeling van pediatrische hersenkankers.

transplantation-zebrafish-pediatric-brain-tumors-into-immune

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor cells into the fourth ventricle of an immunocompetent zebrafish embryo. This procedure allows for the long-term study of tumor cell invasion and behavior.

Long-term Orthotopic Transplantation of Tumor Cells into Zebrafish Embryos: An Efficient Method to Deliver Tumor Cells into the Fourth Ventricle of Zebrafish Embryos for Long-term Analysis of Tumor Cell Behavior

Hier presenteren we een protocol voor celtransplantatie van zebravis skeletspier en embryonaal rabdomyosarcoom (ERMS) in volwassen immuungecompromitteerde rag2E450fs homozygoot mutante zebravissen. Dit protocol maakt een efficiënte analyse van regeneratie en maligne transformatie van spiercellen mogelijk.

Normale en maligne Muscle Cell Transplantation in immuungecompromiteerde Adult zebravis

Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.

Zebravismodel van neuroblastoommetastase

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

We gebruikten celproliferatiekleuring om slapende cellen te identificeren in het zebravis T-acute lymfoblastische leukemiemodel. De kleuring wordt vastgehouden in niet-delende cellen en verminderd tijdens celproliferatie, waardoor slapende cellen kunnen worden geselecteerd voor verder onderzoek. Dit protocol biedt een functioneel hulpmiddel om zelfvernieuwing te bestuderen in de context van cellulaire rust.

Identificatie van slapende cellen in een zebravis T-cel acute lymfoblastische leukemiemodel met behulp van celproliferatiekleuring 

Hier presenteren we een protocol voor het transplanteren van cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie in zebravisembryo's en -larven in elk stadium tussen ten minste 1 en 7 dagen na de bevruchting.

Celtransplantatie met hoge resolutie bij embryonale en larvale zebravissen

Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het genereren en oplossen van problemen met xenotransplantaten voor acute lymfatische leukemie (ALL) bij de mens uit cellijnen en vers patiëntenmateriaal in kortstondig immunosuppressie-zebravisembryo's, samen met richtlijnen voor de beoordeling van de geneesmiddelrespons met behulp van flowcytometrie. De experimentele pijplijn kan ook worden aangepast voor solide tumoren.

Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's

Hier presenteren we een geoptimaliseerd en effectief protocol voor de intraveneuze injectie van cellen of farmacologische middelen in volwassen zebravissen, wat resulteert in verbeterde celtransplantatie en verhoogde overlevingskansen van de behandelde zebravissen.

Geoptimaliseerde intraveneuze injectie bij volwassen zebravissen

Leer hoe je hersentumorcellen transplanteert in zebravisembryo's voor langetermijnanalyse van tumorbiologie en drugrespons. Deze methode minimaliseert gastheertoxiciteit en ondersteunt in vivo onderzoek naar kinderkanker.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons (Video) | JoVE Journal

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Meer video's verkennen