Name: Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer de dissectie en cultuur van metanefrische rudimenten uit muizenembryo's voor nierorganogenese. Deze methode maakt directe observatie van ureterale takvorming en congenitale afwijkingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Leif Oxburgh en Derek Adams om hun kennis, Leif Oxburgh, voor de handige opmerkingen over het manuscript te delen en Stefan Wölfl en Ulrike Müller voor hun technische ondersteuning en Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer en Viola Mayer voor hulp in de laboratorium. Dit werk werd ondersteund door Development, The Company of Biologists (aan CP).

Muizen werden gehandhaafd volgens de Zweedse regelgeving en de wetgeving van de Europese Unie (2010/63 / EU). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Zweedse Etiekkomitee (vergunningen C79 / 9, C248 / 11 en C135 / 14). Procedures bij de Universiteit van Heidelberg met betrekking tot diergeneeskunde zijn goedgekeurd door het Regierungspräsidium Karlsruhe en de dierenwelzijnsambtenaren aan de Universiteit van Heidelberg. 1. Bereiding van reagentia en materialen voor cultuur OPMERKING: Gebruik een laminaire afzuigkap om de vervuiling te minimaliseren. <ol><li> Op de dag van dissectie wordt pre-cluster menselijk Fc alleen of recombinant chimere ephrin eiwit gefuseerd aan humaan Fc door het te mengen met anti-humane Fc geit antilichamen bij een molverhouding van 1: 5 in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C 5 . </li><li> Bereid het kweekmedium door Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient aan te vullenMengsel F-12 (DMEM / F12) met 1% penicilline / streptomycine (v / v), 1% glutamine (v / v), 1% insuline transferrin selenium (v / v), 50 μg / ml humaan holo- Transferrine en 1,5 μg / ml amphotericine. OPMERKING: 10 ml medium is voldoende voor 16 embryo&#39;s. </li><li> Voeg clusterde recombinant ephrinoplossing toe bij een uiteindelijke concentratie van 20 μg / ml aan het kweekmedium. Gebruik geclusterde menselijke Fc als controle. </li><li> Bereid kweekplaten door 500 μl kweekmedium toe te voegen aan elke putje van een steriele, niet-beklede, platte bodem polystyreen 4-putjesplaat. </li><li> Met behulp van steriele tang, plaats een polycarbonaat membraanfilter met een poriegrootte van 5 μm per putje bovenop het medium. Breng de voorbereide plaat over naar de incubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Zorg ervoor dat het filter droog blijft op het bovenvlak en drijft. OPMERKING: Eén filter is voldoende voor twee nieranlagen. </li><li> Gebruik een scheermesje, snijd ongeveer 30 pipetjes (volume: 100 μL) bij benaderingY 1 mm van de punt om een ​​bredere opening te geven. Plaats de tips terug in een pipetstickrek. </li></ol> 2. Dissectie van Metanephric Rudiments in E11.5 <ol><li> Een timed-zwangere muis op E11.5 door cervicale dislocatie opofferen (of gebruik maken van een methode die is goedgekeurd door de lokale ethische commissie). </li><li> Verwijder de baarmoeder en de embryo&#39;s, zoals beschreven door Brown et al. 6 . Vanaf dit punt naar voren, werk onder een dissectiemicroscoop. </li><li> Snijd het embryo direct onder de voorbenen met behulp van nr. 5 horlogemaker. Gebruik een vers petri dish voor elk embryo. Verwijder de benen en de staart van het embryo. Om dit te doen, grijp het weefsel met een paar nr. 5 horlogemakerpincetjes en gebruik de tips van een tweede paar om te snijden. </li><li> Om de ventrale organenmassa te verwijderen, gebruik de tips van een paar tang om lateraal de lichaamswand van het embryo in een rostral-naar-caudale richting te openen. <ol><li> Snijd oppervlakkig, parallel aan tHij verdween aorta. Gebruik de bloedgevulde en dus zichtbare dorsale aorta voor oriëntatie. Zorg het ventrale deel van de lichaamswand voorzichtig van het dorsale gedeelte af met behulp van de uiteinden van de gesloten tang en draai het embryo om. Snijd de lichaamswand lateraal in een rostral-naar-caudale richting en gebruik de dorsale aorta voor oriëntatie, zoals voor de vorige kant. </li></ol></li><li> Zodra de ventrale lichaamswand is gescheiden van het dorsale lichaam, pak het met een paar tang en trek het zorgvuldig om het te verwijderen, samen met de orgaand massa. OPMERKING: De metanefrische anlagen blijven gewoonlijk aan de dorsale lichaamswand bevestigd. Zij zijn ovaal, ~ 200 μm lange structuren gelegen op het niveau van de achterste ledematen. </li><li> Houd de dorsale lichaamswand vast met een paar tangjes, met de ventrale zijde naar boven gericht. Gebruik de andere paar tangen, pak de dorsale aorta aan het rostale uiteinde en schroef de dorsale aorta zorgvuldig af van de dorsale lichaamswand. OPMERKING: Beide metanefrische nieren blijven gewoonlijk bijgevenEd naar de dorsale aorta. </li><li> Met een paar tangjes snijdt u radiaal naar de nierpunten om de aorta te verwijderen. Vervolgens zorgvuldig scheid de twee nierpunten met behulp van de tips van de tang. </li><li> Vet het ongewenste weefsel voorzichtig af van de nierpunten met behulp van de tips van de tang. Wees voorzichtig om het mesenchym niet te beschadigen, aangezien schade kan leiden tot slechte groei en uitsluiting van de explant uit verdere analyse. </li><li> Breng de nierplaten apart door met een microliterpipet en een wijd open pipettepunt in 10 μl PBS aan het polycarbonaatmembraanfilter in een 4-putjesplaat. OPMERKING: Vanwege de oppervlaktespanning wordt de explant bedekt met een dunne laag medium. Eén filter is voldoende voor twee nieranlagen. <ol><li> Plaats elk van de twee nieranlagen in het midden van elke respectieve helft van het filter. Breng het bord terug naar de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2 . Laat de bord in de incubator tot aan de metanefrische rudIments uit het volgende embryo zijn klaar om op het filter te worden geplaatst. </li></ol></li><li> Herhaal stap 2.3-2.9.1 voor elk embryo. OPMERKING: Bij een bepaalde praktijk duurt de dissectieprocedure ongeveer 5 minuten per embryo. </li><li> Incubeer de nieren anlagen gedurende 3 dagen bij 37 ° C / 5% CO 2 . </li></ol> 3. Bereiding van reagentia voor fixatie en kleuring <ol><li> Om 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS zonder calcium en magnesium (w / v) op te bereiden, ontleed de PFA bij 60 ° C in PBS, continu roeren. Koel tot kamertemperatuur en gebruik een papieren filter om de resterende deeltjes te verwijderen. Aliquot en houd bij 4 ° C voor onmiddellijk gebruik of bevriezen voor langdurige opslag. VOORZICHTIG: PFA is giftig. Draag de persoonlijke beschermende uitrusting zoals gespecificeerd in de lokale veiligheidsnormen en werk in een afzuigkap. Verwijder afval volgens de institutionele richtlijnen en gebruik de aangegeven afvalcontainers. </li><li> Om de permeabilisatieoplossing voor te bereiden, verdund Triton X-100In PBS zonder calcium en magnesium tot 0,3% (v / v). </li><li> Voor het bereiden van een blokkerende oplossing, voeg 5% (v / v) geiten serum en 0,1% Triton X-100 toe aan PBS zonder calcium en magnesium. Voeg natriumazide toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w / v). Bewaren bij 4 ° C. VOORZICHTIG: Natriumazide is giftig. Hanteer natriumazide in overeenstemming met de lokale veiligheids- en milieubeschermingsvoorschriften. OPMERKING: Als u antilichamen gebruikt voor het vullen, gebruik 5% serum uit de soort waarvan het secundaire antilichaam is afgeleid om blokkerende oplossing te maken. </li><li> Verdun biotinyleerde Dolichorus biflorus agglutinine 1: 200 in blokkerende oplossing. Verdun Alexa488-geconjugeerde streptavidine 1: 200 in blokkerende oplossing. </li><li> Voor gebruiksklaar inbewerkingsmedium (zie tabel van materialen) voeg 0,1 g wateroplosbare polyvinylalcohol gebaseerde mucoadhesive / mL toe aan 25% (w / v) glycerol in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Verhit tot 50 ° C onder continue roering gedurende 1 uur, afkoelen en stel de pH op op 8,0-8,5 met 1M NaOH. Vermijd hogere NaOH concentraties. Voeg 100 μg / ml N-propylgallaat en thimerosal toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w / v). Roer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. VOORZICHTIG: Thimerosal is giftig. Hanteer het in overeenstemming met de lokale veiligheids- en milieubeschermingsvoorschriften. <ol><li> Vul het embeddingsmedium in 50 ml buizen, balans de rotor en centrifugeer bij 3.200 xg en kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Dek de heldere oplossing in 15 ml buizen en gooi de pellet weg. Aliquot en opslaan bij -20 ° C gedurende enkele weken. Zodra het ontdooid is, houd de oplossing bij 4 ° C. Warm tot ~ 30 ° C onmiddellijk voor gebruik. </li></ol></li><li> Bereid zoveel glazen glijbanen als filters met explanteren op. Lijm hiervoor twee kleine deklijsten, 18 x 18 mm aan weerszijden van de glazen glijbaan met behulp van directe lijm. Laat een ruimte van 15 mm voor de filter tussenin. </li></ol> 4. Bevestiging en kleuring <ol><li> Na een kweekperiode van 3Dagen in vitro (div), verwijder de platen uit de incubator en aspirateer het kweekmedium zorgvuldig uit elke put met behulp van een micropipet. Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt en de tipopening naar de wand van de put houdt. </li><li> Voeg 500 μl 4% PFA / PBS toe aan elke put. De filters zullen op de fixatie drijven. Gebruik een micropipet, voeg de PFA-fixatief voorzichtig toe om de filters te onderdompelen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. OPMERKING: Voor alle volgende stappen moet erop worden gezorgd dat de explantanten niet van het filter afgewassen worden. Houd de opening van de pipettip tegen de wand van de put. </li><li> Verwijder de PFA en spoel tweemaal met 500 μL PBS, onderdompeling van het filter. Voeg 500 μl permeabilisatieoplossing toe aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Spoel tweemaal met 500 μL PBS en voeg 500 μL blokkerende oplossing toe aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Vervang de blokkerende oplossing met250 μl biotinylated Dolichorus biflorus agglutinine verdund 1: 200 in blokkerende oplossing en incuberen bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Verwijder de Dolichorus biflorus agglutinine oplossing en spoel tweemaal met 500 μL PBS per putje. </li><li> Voeg 250 μL Alexa488-geconjugeerde streptavidine verdund 1: 200 in blokkeringsoplossing toe en incubeer bij 24 ° C gedurende 4 uur. Alternatief, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. OPMERKING: een beter signaal-ruisverhouding wordt bereikt bij incubatie bij 4 ° C. </li><li> Spoel tweemaal met 500 μL PBS per putje. Met behulp van pincet, breng de filters over op de voorbereide glazen glijbanen, met de explanteren naar boven gericht. Monteer met ~ 50-100 μL embedding medium. Deksel met 60 mm lang nr. 1.5 deksels. Laat de embeddingmediumoplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker stollen. Ga door naar afbeelden of sla de glijbanen op, in folie verpakt, bij 4 ° C tot klaar om op te slaan. </li><li> Afbeelding met een widefield epifluorescentiemicroscoop 7 &lt;/ Sup&gt; gekoppeld aan een Hg-lamp en gebruik een spiegel-eenheid voor blauwe excitatie (excitatie bandpas, 460 - 495 nm, dichromatische spiegel, 505 nm en emissie bandpas, 510 - 550 nm) en 20X Plan-Apochromat lenzen, 0,75 numerieke opening. </li></ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
<li>Lindström, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+%CE%B2-catenin%2C+BMP%2C+PTEN%2C+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000(2015).</li>
<li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Eph%2FEphrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li>
<li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555(2011).</li>
<li>Olympus Support. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817">http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817</a> (2016).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401300207/abstract">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li>
<li>Saxén, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/38101">Primary Embryonic Induction</a>. , Academic Press. London. (1962).</li>
<li>Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Morphog%22%5BJournal%5D)">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li>
<li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li>
<li>Perälä, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+exp+Morph%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
<li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel%2C+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550(2010).</li>
<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit manuscript beschrijft een methode om de ontwikkelende metanephrische anlagen van het muisembryo te isoleren en de orgaansrudimenten te cultiveren. Deze methode is een standaard techniek, zoals ontwikkeld door Grobstein 8 en Saxén 9 , 10 , en werd aangepast en aangepast door vele anderen 11 , 12 . Het succes van de methode hangt voornamelijk af van de duur van de dissectie, aan...

De zoogdiernier is afgeleid van twee primordiale structuren met mesodermale oorsprong: de tubulaire epitheliale ureterknop en het metanefrische mesenchym. Tijdens de nefrogeneze dringt de ureterknop het metanefrische mesenchym binnen en vertakken om het verzamelsysteem te vormen. Het metanefrische mesenchym geeft aanleiding tot de epitheliale elementen van de nefronen. Deze processen vinden plaats op een precies getimede en ruimtelijk gecoördineerde manier en worden geïnitieerd door wederzijdse inductieve mechanismen. Beide weefselcomponenten communiceren en beïnvloeden de celmorfogenese van de ander.
In de jaren 1920 was het Boyden die de in vivo obstructie van de mesonefrosductus bij kippen uitvoerde en daarmee de eerste indicatie gaf van inductieve interacties, aangezien gescheiden nefrische blastema niet kon differentiëren1. Rond dezelfde tijd werden de eerste succesvolle pogingen gepubliceerd om nierrudimenten van kippen in een hangende druppel te kweken. Vervolgens werd de orgaancultuur ontwikkeld om weefselinteracties in de orgaanontwikkeling bij zoogdieren te bestuderen. In de jaren 1950 ontwikkelde Grobstein een techniek waarbij metanefrische rudimenten op een filter konden worden gekweekt. Deze techniek werd gewijzigd door Saxén, die het filter op een Trowell-type scherm in een kweekschaal plaatste1. In de loop der jaren zijn er veel aanpassingen en toepassingen voor orgaancultuur ontstaan. De hier beschreven methode is gebaseerd op Saxén's techniek, maar is vereenvoudigd, aangezien de filters vrij op het medium drijven en de diameter van de kweekput slechts iets groter is dan de diameter van het filter, wat ongewenste beweging van het filter beperkt.
Hele orgaancultuur is een klassiek, goedkoop en eenvoudig, maar krachtig hulpmiddel om cellulaire processen en intercellulaire communicatie tijdens de orgaanontwikkeling te onderzoeken. Orgaancultuur maakt behandeling mogelijk met biologische middelen, zoals groeifactoren, antilichamen, antisense-oligonukleotiden, virussen en peptiden, evenals met farmaceutische verbindingen en andere chemicaliën. Ook kan de genfunctie worden bestudeerd met behulp van explantaten afkomstig van genetisch gemodificeerde muizen of met behulp van inductieve geninactivatietechnologie, zoals het Cre-loxP systeem. Dit maakt de studie mogelijk van genetische mutaties die embryonale letaliteit veroorzaken vóór de ontwikkeling van de nier. Orgaancultuur kan ook worden gecombineerd met fluorescente tagging voor genfunctie of lijntracering en moderne beeldtechnieken, die real-time monitoring van celgedrag mogelijk maken2.
In het specifieke voorbeeld dat hier wordt gegeven, werd het effect van EphrinB2-geactiveerde Eph-receptorsignalering op de vertakkingsmorfologie van de ureterknop onderzocht. De morfologie van de EphA4/EphB2 dubbel-knockout muizen suggereerde verschillende ernstige defecten in de nierontwikkeling, die al op embryonale dag 11 (E11) detecteerbaar waren en de ureterknop, de ureter en de gemeenschappelijke nefrische ductus betrokken3. Signalering via Eph-receptoren vereist de clustering van het ligand-receptor dimeer4. Om Eph-signalering te overactiveren, werden de nierrudimenten van E11.5 muis embryo's gekweekt in aanwezigheid van geclusterd recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is een bekende ligand voor de EphA4 receptor, die in de uiteinden van de ureterknop wordt uitgedrukt3.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>gebruik voor dissectie</td></tr><tr><td>holo-Transferrin menselijk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazied</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propylgallaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren Dolichorus Biflorus Agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 geconjugeerd Streptavidin</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Eiwit, CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IgG1 Fc, CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Geit Anti-Human IgG Fc Antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossingen tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>gebruik voor fixatie en immunokleuring</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>2 paar pincetten zijn nodig</td></tr><tr><td>Iris schaar, recht, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps, recht, delicaat, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen Nunclo Delta behandeld</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isopore Membraanfilter, polycarbonaat, Hydrofiel, 5,0 &micro;m, 13 mm, wit, gewoon</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes 4 putten, platte bodem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop dekglas 24 x 50 mm dikte n. No.1.5H 0.17 +/-0.005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Dekglazen No.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Glijbanen ~76 x 26 x 1, 1/2-w. gemalen gewoon</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Scheermessen</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifugebuizen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuizen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman prepleated kwalitatief filterpapier, Grade 113V, crêpe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Vaste onderzoek microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte 6 ingebrede muizen, mannelijk, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte 6 ingebrede muizen, vrouwelijk, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie en cultuur van muis embryonale nier

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Het doel van dit protocol is om een ​​methode te beschrijven voor de dissectie, isolatie en cultuur van muismetanefrische rudimenten. Tijdens de ontwikkeling van zoogdierontwikkeling, communiceren de twee voorvaderweefsels, de ureterische knop en het metanefrische mesenchym, cellulaire mechanismen en vormen zij uiteindelijk het verzamelstelsel en de nefronen van de nier. Aangezien de embryo&#39;s van de zoogdier intracuterine groeien en derhalve ontoegankelijk zijn voor de waarnemer, is er een orgelcultuur ontwikkeld. Met deze methode is het mogelijk om epitheliale mesenchymale interacties en cellulaire gedragingen tijdens nierorganogenese te bestuderen. Bovendien kan de oorsprong van aangeboren nier- en urogenitale tract misvormingen worden onderzocht. Na zorgvuldige dissectie worden de metanefrische rudimenten overgebracht op een filter dat op cultuurmedium drijft en gedurende enkele dagen in een celcultuur-incubator kan worden gehouden. Men moet echter bewust zijn dat de voorwaarden zijnKunstmatig en kan het metabolisme in het weefsel beïnvloeden. Ook kan de penetratie van teststoffen beperkt worden door de extracellulaire matrix en het basale membraan aanwezig in de explant. Een belangrijk voordeel van orgelcultuur is dat de experimentator direct toegang tot het orgaan kan krijgen. Deze technologie is goedkoop, eenvoudig en maakt een groot aantal wijzigingen mogelijk, zoals de toevoeging van biologisch actieve stoffen, de studie van genetische varianten en de toepassing van geavanceerde beeldvormingstechnieken.

Metanephrische nier anlagen werden afgeleid van zwangere Black-6 inbloed muizen bij E11.5 en werden gekweekt. Na 3 dagen had de ureterische knop tot 5 maal vertakt, waardoor de initiële T-vormige ureterische knop werd verdubbeld. Elke explant werd gefotografeerd en de aantallen segmenten en eindpunten werden gekwantificeerd om de vertakkende generaties te bepalen en het aantal eindpunten per tak te berekenen ( Figuur 1 ). ImageJ ( rd generatie; de 4e</sup...

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en cultiveren van metanefrische rudimenten uit muisembryo&#39;s.

Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

De algemene doelstellingen van deze procedure zijn het isoleren en kweken van metanefrische rudimenten uit muisembryo's en het observeren van de effecten van specifieke behandelingen op de vertakkingsmorfologie van de ureterknop. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de nierorganogenese met betrekking tot de controle van de tubulaire vertakkingsmorfogenese, epitheliale-mesenchymale interacties en de oorsprong van congenitale malformaties. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze directe toegang tot het orgaan faciliteert en dat deze eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk aanpasbaar is.Plaats vóór aanvang van de dissectie met steriele pincetten voorzichtig één polycarbonaatmembraanfilter met een poriegrootte van 5 µm in elke put van een plaat met vier putten die 500 µL vers kweekmedium bevat. Plaats de plaat in een celkweekincubator. Gebruik vervolgens een scheermesje om ongeveer 30 micropipetpunten van 100 µL op ongeveer 1 mm van de punt door te snijden om de openingen van de punten te verbreden, en plaats de punten terug in het statief voor pipetpunten.Wanneer de tips klaar zijn, plaats dan een embryo van embryonale dag 11 1/2 in PBS onder

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo's tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo's gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

We presenteren een methode voor de isolatie en de cultuur van de muis Wolffian kanaal (WD). We hebben ook een gedetailleerde procedure voor de hele berg immunokleuring van gekweekte / vers geïsoleerde WDS met fluorescent gelabelde antilichamen aan te tonen. Samen vormen deze technieken kan de studie van de WD ontwikkeling, oprollen, en differentiatie.

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Weefsel-engineered renale constructies bieden een oplossing voor het tekort aan organen en de schadelijke effecten van dialyse. Hier beschrijven we een protocol bij micro ontleden lymfkliertest nieren voor isolatie van cortico-Wallenberg segmenten. Deze segmenten zijn steiger-vrije cellulaire constructies, vorming van renale organoids ingeplant.

Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.

Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren

Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.

Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Leer de dissectie en cultuur van metanefrische rudimenten uit muizenembryo's voor nierorganogenese. Deze methode maakt directe observatie van ureterale takvorming en congenitale afwijkingen mogelijk.

Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier

Meer video's verkennen