Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om chondrogene lijncellen te genereren uit humane perifere bloed-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPS-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in het kraakbeenregeneratieveld over het gebruik van patiëntafgeleide perifere bloedcellen als C-cellen voor de generatie van de IPS-cellen voor kraakbeenreparatie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze gemakkelijk reproduceerbaar is, en dat de chondrocytdifferentiatie plaatsvindt onder serum- en xeno-vrije omstandigheden.

Begin door humane IPS-cellen in vier milliliter humane IPSC-medium op een 60 millimeter weefselkweekschaaltje te plaatsen dat een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblast-feedercellen bevat. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius in vijf procent koolstofdioxide. Wanneer de stamcellen 80 tot 90 procent confluent zijn, dissocioeer de cellen met dispace-oplossing voor subcultiveren.

Gebruik na twee tot drie passages een met vuur getrokken glazen naald om de 80 tot 90 procent confluente ongedifferentieerde IPSC-kolonie in kleinere fragmenten te snijden, en breng niet meer dan 100 cellenkweekstukken over naar een nieuwe niet-aderente 100 millimeter petrischaaltje dat 10 milliliter embryoïde lichaamsformatiemedium bevat. Mechanische dissociatie is beter dan automatische digestie omdat het celschade vermindert tot kleine fragmenten van cellen die naar de nieuwe kweekcontainer worden overgebracht, en verklaart het handmatig weggegooien van de feedercellen, die de differentiatie van humane IPS-cellen onderdrukken. Breng de humane IPS-cellen terug naar de cellenkweekincubator.

Na twee dagen, kant de schaal om de embryoïde lichamen te laten bezinken, en vervang voorzichtig drie milliliter van het embryoïde lichaamsformatiemedium met vier milliliter vers basaal kweekmedium. Na 10 dagen zullen embryoïde lichamen gevormd zijn. Bekleed een nieuwe 100 millimeter schaal met vier milliliter 0,1 procent gelatine gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Breng de embryoïde lichamen met het supernatant over naar een 15 milliliter kegelbuisje, en laat de lichamen vier tot vijf minuten bezinken. Zuig al het medium op, behalve de laatste 0,5 milliliter, en resuspendeer de embryoïde lichamen in 10 milliliter vers basaal kweekmedium. Wanneer de gelatine is gestold, gooi de gelatine weg.

Zaai vervolgens de cellen op de gelatine-gecoate schaal, en plaats de schaal in de cellenkweekincubator. Na 10 dagen in cultuur zullen de embryoïde lichamen gedifferentieerd zijn in fibroblastische celuitgroei. Om chondrocytdifferentiatie te induceren, was de kweek met DPBS en los de cellen met drie milliliter 0,25 procent trypsine EDTA bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Wanneer de cellen van de bodem van de schaal zijn opgetild, neutraliseer de reactie met vier milliliter vers basaal kweekmedium, en titrateer de kweek voorzichtig vijf tot 10 keer. Filter de celsuspensie door een 70-micron nylon gaasfilter, en verzamel de cellen door centrifugatie. Zaai vervolgens de cellen op een nieuwe gelatine-gecoate 100 millimeter plaat in 10 milliliter vers basaal kweekmedium.

Wanneer de kweek 90 tot 100 procent confluency bereikt, oogst de cellen met drie milliliter 0,25 procent trypsine EDTA zoals net gedemonstreerd voor het tellen. Breng een driemaal 10 tot de vijfde aliquot van cellen over naar een 15 milliliter polypropyleen buisje voor centrifugatie. En resuspendeer het pellet in één milliliter chondrogene differentiatiemedium.

Centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw, en plaats de buis in de cellenkweekincubator gedurende 21 dagen zonder het pellet te verstoren. Chondrogene cellen kunnen zich in vitro verzamelen, waardoor karakteristieke extracellulaire metrische waarden ontstaan onder hoge dichtheidscultuurcondities. Na 21 dagen in cultuur zal een humaan IPS-cellen chondrogene pellet gevormd zijn.

Na 21 dagen kweek zijn de humane IPSC-chondrogene cellen positief voor alcian blauw en toluidin in blauwe kleuring, wat wijst op een succesvolle chondrogene differentiatie van de HIPSC-pellet. Immunohistochemische analyse voor collageen twee en collageen 10 bevestigt verder hun chondrocyt-achtige fenotype. Gesulfateerde glycosaminoglycaananalyse onthult dat de gesulfateerde glycosaminoglycaaninhoud van de cellen significant opgereguleerd is in humane IPSC-chondrogene pellets, vergeleken met humane IPSC-fibroblast-achtige cellen, embryoïde lichamen en ongedifferentieerde humane IPS-cellen.

Verder vertonen humane IPSC-chondrogene cellen een hoog genexpressieniveau van chondroprogenitor lijn en volledig gedifferentieerde chondrocytmarkers, wat duidt op het bereiken van een succesvolle chondrogene differentiatie. Een meerstaps kweekmethode wordt gebruikt om humane IPSC's in chondrocyten te differentiëren, inclusief spontane differentiatie via EB-formatie, celuitgroei uit EB's, monolaag celkweek na celkweek, en 3D-pelletkweek. Het chondrocytfenotype wordt beoordeeld door histologische analyse, biochemische analyse en chondrogene genexpressie.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een meerstaps kweekmethode kunt gebruiken voor het induceren van humane IPS-cellendifferentiatie in chondrocyten. Deze techniek zou specifieker voor patiënten kunnen zijn en kosteneffectiever.