Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

Het algemene doel van deze methode is om een microRNA te selecteren en te leveren met behulp van een recombinant Adeno-geassocieerd virusvector. Vervolgens wordt het geleverd aan skeletspier en motorneuronen van muizen, en wordt de effectiviteit ervan beoordeeld bij het verbeteren van ziektefenotypen. Deze methode kan helpen om de belangrijke vraag te beantwoorden of een microRNA-gebaseerde silencing-strategie kan worden gebruikt om neuromusculaire aandoeningen te behandelen.

Het grootste voordeel van deze techniek is het gebruik van Adeno-geassocieerd serotype 9-virus om een microRNA via de systemische circulatie naar het ruggenmerg en de skeletspier van muizen te leveren, om direct een doelwitgen van de ziekte te verdoven. Verdeel de AAV-microRNA-plasmidestock in 100 tot 200 microliter aliquoten met een virale lading van tien tot honderd triljoen genomen per milliliter. Laad vervolgens één aliquot in een spuit en bevestig een naald van 27 tot 30 gauge.

Gebruik nu een standaard muisbegrenzer om een muis vast te zetten met de staart blootgelegd. Reinig vervolgens de staart met 70% alcohol en plaats een warm kussentje onder de staart gedurende ongeveer 30 seconden om de vaatverwijding te verhogen. Steek nu, op het distale gedeelte van de staart, de naald met de snede omhoog en onder een hoek van ongeveer 15 graden in de staarvene met de bevel omhoog en onder een lichte hoek.

Injecteer vervolgens het virus en wacht een paar seconden voordat u de naald verwijdert. Nadat u de naald hebt verwijderd, oefent u matige druk uit met twee vingers om eventuele bloedingen te stoppen. Breng het dier vervolgens terug naar zijn kooi.

Tijdens de injectie in de staarvene is het niet ongewoon om een ​​bloedflits in de naaldhuid te zien. Tijdens het injecteren mag er geen weerstand zijn. Als de staart begint te verbleken en zwelt, verwijder dan de naald en probeer het opnieuw proximal van de vorige ingangslocatie.

Voor deze tests moeten de muizen ouder zijn dan vier weken en zorg ervoor dat u een basismeting verzamelt vóór de behandeling. De testruimte moet stil en donker zijn zonder storingen. Breng de muizen minimaal 30 minuten voor het uitvoeren van tests in de ruimte.

Verstoor de dieren niet tijdens deze periode van acclimatisering. Begin met de hangende draadtest. Pak de muis bij zijn staart en plaats hem in het midden van het draadhekken.

Vervolgens heft u het hek 15 tot 20 centimeter op en draait u het scherm langzaam om de muis tijd te geven om zijn greep aan te passen. Zodra het hek volledig is omgekeerd, start u de timer en noteert u de valtijd. Geef de muis 60 seconden om te hangen, als hij eerder valt, breng hem dan terug naar het hek en herhaal de procedure.

Als de muis 60 seconden hangt, registreert u 60 seconden voor de score en brengt u de muis terug naar zijn kooi. Geef elke muis drie pogingen om 60 seconden te hangen. Anders scoort u de langste hangtijd.

Na het euthanaseren van de muis oogst u het ruggenmerg en vervolgens de quadriceps skeletspier. Om de geoogste weefsels snel te bevriezen, vult u een roestvrijstalen kom half met 2-methylbutaan en dompelt u de onderste kwart van de kom onder in vloeibare stikstof. Wacht twee minuten voordat u verder gaat.

Na een paar minuten brengt u het monster over in de 2-methylbutaan. Wanneer het monster wit wordt, brengt u het onmiddellijk over in een container ingedompeld in droogijs. Bewaar het monster later bij 80 graden Celsius.

Voor biochemische analyse en microRNA-kwantificering plaatst u het geoogste weefsel in een cryovial en bevriest u het in vloeibare stikstof. Bewaar het vervolgens bij 80 graden Celsius. SBMA-muizen werden geïnjecteerd met honderd triljoen genomen van AAV microR-298 op de leeftijd van vijf weken.

SBMA-muizen dragen het humane androgeenreceptor-transgen met een abnormaal uitgebreide polyglutamine-ketting. Tegen tien weken ontwikkelen ze normaal gesproken tekenen van neuromusculaire ziekte. Het lumbale ruggenmerg en de quadriceps-spier werden op verschillende tijdstippen na de behandeling geoogst voor analyse.

Kwantitatieve RT-PCR toonde aan dat de micro-R298-expressie na acht weken in de skeletspier piekte en dat de expressie na 12 weken in het ruggenmerg piekte. Tien weken na de injectie werd GFP gedetecteerd in beide weefsels. En GFP-expressie co-lokaliseerde met de motorneuronmarker cholineacetyltransferase.

In een vervolgexperiment werden muizen willekeurig geïnjecteerd met het virus of voertuig op de leeftijd van zeven weken en werden vervolgens wekelijks gewogen en gedragsmatig beoordeeld, tot 40 weken oud. Tien weken na de injectie begonnen de behandelde muizen gewicht te winnen en begonnen ze een betere motorische prestatie te vertonen. Kwantitatieve realtime PCR onthulde dat de behandeling de AR-transcriptniveaus in de aangetaste weefsels verlaagde.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een microRNA kunt leveren met behulp van een recombinant Adeno-geassocieerd virusvector via injectie in de staarvene. En hoe u gedragstests kunt uitvoeren die kunnen helpen bij het beoordelen van de efficiëntie van de geleverde microRNA bij het verbeteren van atrofie en zwakte van de onderste ledematen bij muizen. De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar gentherapiebenaderingen, omdat een veilige en effectieve gentherapie een doelgerichte weefselspecifieke overdracht van het therapeutische transgen vereist.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat ziekten veroorzaakt door toxische functieverliesmechanismen, zoals SBMA, zouden profiteren van overexpressie van van nature voorkomende microRNA's die specifiek gericht zijn op de drie-prime reparatie van het ziektetranscript.