Name: Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer hoe extracellulaire vesikels en exosomen uit mesenchymale mammary epitheelcellen worden geïsoleerd en gekarakteriseerd. Deze methode toont aan dat EVs stamcel-eigenschappen kunnen overdragen naar luminale mammary epitheelcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) en van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Alle onderzoeken waarbij dieren betrokken zijn, voldoen aan protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenwelzijn. 1. Extracellulaire Vesikel / Exosome Isolatie en Validatie <ol><li> Cultuur mammale epitheliale basale cellen, NAMECs 4 , met vers, serumvrij medium gemaakt van 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); Boviene hypofyse extract (BPE; 35 μg / ml); En GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm gerechten. </li><li> Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, zaad 1,2 x 10 6 cellen in 12 ml medium per 15 cm gerecht op dag 0 gedurende 4 dagen 4 . </li><li> Na 4 dagen in cultuur centrifugeer het kweekmedium bij 300 xg gedurende 5 minuten met behulp van een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een conische buis ( Figuur 1 ). </li><li> Centrifugeer het supernatantGedurende 20 minuten bij 2000 xg in een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een ultracentrifugebuis en laat de dode cellen en celresten achter ( Figuur 1 ). </li><li> Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de supernatant over naar een nieuwe ultracentrifugebuis ( Figuur 1 ). </li><li> Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ). </li><li> Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ). Resuspendeer de pellet geïsoleerd van 240-480 ml NAMEC-geconditioneerd medium in 100 μl. </li><li> Meet de eiwitconcentratie van de EV-suspensie met de BCA-eiwitassay. Zorg ervoor dat de concentratie ongeveer 20-40 μg / 100 μL bedraagt. Bewaren bij -20 ° C voorverdere analyse. </li><li> Meet de concentratie en grootte van de EV&#39;s / exosomen door nanoparticle tracking analysis (NTA), zoals eerder beschreven door Gardiner et al. 11 . Verdun de EV&#39;s / exosomen (20 μg / 100 μL) met PBS tot 10.000 keer voor NTA-analyse. OPMERKING: Het resultaat van de NTA-analyse weerspiegelt het aantal en de grootte van de geanalyseerde blaasjes. </li><li> Beeld de EV&#39;s / exosomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals eerder beschreven door Lin et al. 4 . </li></ol> 2. Exosome zuivering met behulp van een dichtheidsgradiënt <ol><li> Resuspendeer de 110.000 g pellet uit stap 1.7 in 40% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml). Plaats het mengsel in volgorde met een hoeveelheid van 30%, 20%, 10% en 5% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml elk) om een ​​dichtheidsgradiënt in een ultracentrifugebuis te vormen. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 200.000 xg gedurende 8 uur bij 4 ° C. </li><li> Verzamel elke gradiëntfractie (10 fractions; 1 ml / fractie) met een pipet uit de bovenkant van de buis. </li><li> Analyseer de aanwezigheid van exosoommarkers ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) in elke fractie door SDS-PAGE 12 en Western blot. Loop 50 μl suspensies van elke fractie op een 10% gel bevattende 0,1% (w / v) SDS en scheid de eiwitten in fracties met gelelektroforese. </li><li> Breng de eiwitten over van een gel naar een PVDF membraan en incubeer het membraan met antilichamen tegen de exosoommarkeringen ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) en huishoudelijke eiwit GAPDH overnacht ( Table of Materials ) bij 4 ° C. OPMERKING: Het resultaat identificeert de fractie die exosomen bevat. </li></ol> 3. Extracellulaire Vesicle / Exosome Etikettering <ol><li> Schors de EVs / exosomen, verkregen in stap 1.7, in 10 μM carboxyfluoresceïne succinimidyldiacetaatester (CFSE) bij 20 μg exosomaal eiwit / 100 μl. Bereid een parallel monster coAlleen CFSE en PBS, op dezelfde wijze verwerkt, als een negatieve controle voor de latere EV / exosome opname assays. Laat de mengsels gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Schors de EV&#39;s / exosomen in 50x volume PBS en centrifugeer de suspensie bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS. Herhaal stap 3.2 een keer. </li><li> Suspenseer de EV&#39;s / exosomen in PBS bij een concentratie van 20 μg exosomale eiwit / 100 μl en filter vervolgens de EV&#39;s / exosomen door middel van 0,22 μm membranen voordat de EV&#39;s / exosomen aan de cellen worden toegevoegd. </li></ol> 4. Extracellulaire Vesikel / Exosome Opname Assay <ol><li> Om cultuurmedium te maken, meng 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); En BPE (35 μg / ml) 4 . Platte de HMLE-cellen van de menselijke mammary epitheel in 6-putjes (1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; cellen / putjes) één dag voor EV / exosome behandeling. Voeg 2 μg / ml CFSE fluorescentie-gemerkte EVs / exosoom, verkregen in stap 3.3, toe aan het kweekmedium van de HMLE-cellen gedurende 2-6 uur. Behandel de HMLE-cellen van de negatieve controlegroep met de parallelle bereiding, beschreven in stap 3.1. </li><li> Na de 2- tot 6-uur incubatie wassen de cellen tweemaal met 4 ml PBS bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de cellen met 0,25% trypsine gedurende 10 minuten en zet de cellen opnieuw op in PBS die 0,2% FBS bevat. Meet de EV / exosome opname uit de fluorescentie-intensiteit in de cellen met behulp van een fluorescentiecelanalysator 4 . Beeld de cellen die met EV&#39;s / exosomen worden behandeld of de negatieve controle met behulp van confocale microscopie. OPMERKING: De groene fluorescentie in de cellen wordt veroorzaakt door de opname EV / exosome. Zie de legende van Figuur 6 voor de instellingen van de microscoop. </li></ol> 5. Isolatie van Primaire Muis Mammary Epithelial Cells <ol><lI&gt; Bereid gelatine-gecoate gerechten door 12 ml 0,1% gelatineoplossing toe te voegen aan 10 cm gerechten. Plaats de platen in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. Verwijder de gelatineoplossing en laat de deksels gedurende 4 uur in een laminaire stromende afkoeling laten vallen tot de gelatine-bekleding gedroogd is. </li><li> Dissecteer de 2, 3, 4 en 5 borstklippen ( Figuur 2 ) van 12-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met behulp van een schaar en snijd de klieren in kleine stukken (2 mm 2 ) met een scheermes. </li><li> Verdere dissociatie van de slurrie van borstklippen (van 10 muizen) gedurende 60 minuten bij 37 ° C, 120 rpm geroerd met 50 ml DMEM / F12 bevattende 0,2% collagenase type IV, 0,2% trypsine, 5% FBS, 5 ug / ml gentamycine , En 1x pen-streep. </li><li> Pellet de epitheliale organoïden uit het mengsel door centrifugeren bij 350 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Suspensieer de epitheliale organoïden in 4 ml DMEM / F12 met 0,1 mg / ml DNase I gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 6 ml DMEM / F12 toe aan een finaleVolume van 10 ml. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. </li><li> Resulteer de pellet in 10 ml DMEM / F12. Centrifugeer de vering maar sla de rem als de snelheid 400 x g bereikt. Gooi de supernatant weg. OPMERKING: Door de rem te slaan worden epitheliale organoïden snel gepelletteerd, terwijl fibroblasten, als enkele cellen, nog in de supernatant blijven. </li><li> Herhaal stap 5.6 en 5.7 5-7 keer. Voeg een druppel van de suspensie toe aan een hemocytometer en controleer vervolgens de speling van fibroblasten uit het organoïde mengsel onder microscopie na elke centrifugeringsronde ( Figuur 3 ). </li><li> Platte de organoïden in de gelatine gecoate schotel, verkregen in stap 5.1, gedurende 48 uur met DMEM / F12 die 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstrip bevatten. </li><li> Na 48 uur verwijder de drijvende cellen in de kweek door het medium te vervangen door vers cultureel medium zonder FBS (FBSDMEM / F12 bevattende 1x ITS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstreep). </li><li> Bevestig dat een monolaag van mammale epitheelcellen migreert en groeit uit de bijgevoegde epitheliale organoïden in 3 dagen. </li></ol> 6. Scheiding van Primaire Muis Basale / Luminale Mammary Epithelial Cells <ol><li> Na de 3-daagse cultuur, verwijder de muis primaire mammarycellen met een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collageenolytische enzymactiviteit gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 5 mg / ml dispas gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. </li><li> Zet de cellen opnieuw op in 100 μl PBS met 0,2% FBS bij een concentratie van 10 7 cellen / ml met de verdundeAnti-CD49f en anti-EpCAM antilichamen op ijs gedurende 1 uur in het donker. </li><li> Was de cellen met PBS en incubeer vervolgens de cellen met fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam op ijs gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> De cellen in PBS wassen en opnieuw opschorten met 0,2% FBS. </li><li> Sorteer de EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen op een cel sorter 4 . </li></ol> 7. Extracellulaire Vesikel / Exosome Behandeling <ol><li> Zet de gesorteerde EpCAM hi / CD49f lo luminale mammale epitheliale cellen uit stap 6.7 op gelatinecoated 6-putjes (2 x 10 5 cellen / putjes) en behandel ze vervolgens met PBS of de 2 μg / mL NAMEC-afgeleide EV&#39;s / exosomen Verkregen in stap 1.7. </li><li> Om de biologische werkzaamheid van de EV&#39;s / exosomen te waarborgen in de langdurige cultuurbehandeling, vervang het celkweekmedium met vers medium die PBS bevat of 2 μg / ml NAMEC-afgeleide EV&#39;s / exosomen om de twee dagen. Verdeel de muis niet primaRij luminale cellen tijdens de 10-daagse behandeling. </li></ol> 8. Vetpasta Injectie Van Mammary Epithelial Cells <ol><li> Anesthetiseer een 3-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met isofluoraan 2-3% inhaleermiddel. </li><li> Plaats de verdoofde muis op zijn rug. Verwijder de vacht op het middel van de buik met een scheermes / haarcrème en maak de operatieplaats schoon met drie alternatieve cycli van 70% alcohol en povidon-jodium. </li><li> Maak een 1,5 cm verticale insnijding door de huid langs het ventrale thoracale inguinale gebied met een schaar en wissel dan de rechter en linker 4e dikke vetpads. </li><li> Verwijder elk vetpaneel door het verwijderen van klierparenchyma met een schaar. Plaats de lymfeklieren in het vetpaneel en verwijder het hele klierparenchym onder het lymfeknoop. OPMERKING: tweederde van het vetblok moet op zijn plaats blijven. </li><li> Verwijder de cellen die zijn verkregen uit stap 7.2 met een natuurlijk enzymmengsel (zie de Tabel van Materialen ) met proteolytische aEn collagenolytische enzymactiviteit gedurende 10 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Tel de cellen met een hemocytometer en schud de cellen in PBS bij een concentratie, zodat 15 μL de gewenste celdosis bevat (10 4 -10 2 cel / pad). </li><li> Spuit 15 μL van de epitheelcel suspensie in een vetpaneel met behulp van een 100 μL glazen spuit bevestigd aan een 27G naald. </li><li> Herhaal de stappen 8.4-8.7 voor het vetpaneel aan de andere kant. </li><li> Sluit de huid met wondklemmen. </li></ol> 9. Mammary Gland Whole Mount <ol><li> Euthanize de muis met CO 2 plus cervicale dislocatie na 8 weken na de celinjectie (stap 8.7). </li><li> Maak een verticale snede door de huidlaag van het thoracale gebied naar het inguinale gebied met behulp van een schaar en laat dan zowel rechts als links 4e mAmmary dikke pads. Verwijder de 4e borstklieren ( figuur 2 ). </li><li> Spreid de vetbladen op glasmicroscoopschuiven en maak de vetbladen met Kahle&#39;s fixatief (4% formaldehyde, 30% EtOH en 2% ijsazijn) bij kamertemperatuur &#39;s nachts. Let op: Kahle&#39;s fixative is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap. </li><li> Was de vetbladen in 250 ml 70% EtOH gedurende 15 minuten en daarna gedurende 250 minuten in 250 ml dH20. Vlek de vetpadsjes met karminealuminium (1 g karmine en 2,5 g aluminiumkaliumsulfaat in 500 ml dH 2 O) bij kamertemperatuur &#39;s nachts. </li><li> Was de vetpadsjes gedurende 15 minuten met 250 ml 70% EtOH gedurende 250 minuten, 250 ml 95% EtOH en 250 ml 100% EtOH gedurende 15 minuten. </li><li> Reinig de vetblokken in xyleen voor dagen en stop de xyleen incubatie wanneer de vetpadsjes transparant worden. Let op: Xylene is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap. </li><li> Monteer de glijbanen wiMontage medium en neem afbeeldingen (2.400 dpi) van de dikke pads met behulp van een digitale dia scanner. </li></ol>

<ol><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes--vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication.</a> Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Boelens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+Transfer+from+Stromal+to+Breast+Cancer+Cells+Regulates+Therapy+Resistance+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-507 (2014).</li>
<li>Lin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2+%2FEP4+Signaling+Controls+the+Transfer+of+the+Mammary+Stem+Cell+State+by+Lipid+Rafts+in+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles.</a> Stem Cells. , (2016).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li>
<li>György, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Olver, C., Vidal, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4020-5943-8_7">Proteomic analysis of secreted exosomes.</a> Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Prater, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+stem+cells+have+myoepithelial+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary stem cells have myoepithelial cell properties.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+exosome+release+from+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells+-+a+new+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway.</a> Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>Outzen, H. C., Custer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+normal+and+neoplastic+mammary+tissues+in+the+cleared+mammary+fat+pad+of+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse.</a> J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).</li>
<li>Sheffield, L. G., Welsch, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+breast+epithelia+to+mammary-gland-free+fat-pads+of+athymic+nude+mice%3A+influence+of+mammotrophic+hormones+on+growth+of+breast+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia.</a> Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Exosomen dragen vaak eigenschappen van de cellen die hen vrijgegeven, en de hoeveelheid vrijgegeven exosomen kan door stimuli 4 worden geïnduceerd. Het kweekmedium van cellen kan worden verzameld en onderworpen aan differentiële ultracentrifugatie voor EV / exosoom-collectie ( Figuur 1 ). Er is momenteel geen algemene overeenstemming over een ideale methode om EV&#39;s / exosomen te isoleren. De hier gebruikte optimale methode is bepaald door de downstream applicatie...

Exosomen kunnen cellulaire communicatie bemiddelen door membraan- en cytosolische eiwitten, lipiden en RNA&#39;s tussen cellen 1 over te brengen . Exosoomgemedieerde communicatie is aangetoond dat zij betrokken zijn bij veel fysiologische en pathologische processen ( dwz antigeenpresentatie, ontwikkeling van tolerantie 2 en tumorprogressie 3 ). Exosomen hebben vaak dezelfde inhoud als die van de broncellen die ze vrijmaken. Zo kunnen de exosomen specifieke celeigenschappen van de broncellen dragen en deze eigenschappen overbrengen naar de cellen die ze innemen 4 . Exosomen zijn 50- tot 150 nm dubbellaagse membraan vesicles en aanwezige specifieke markers ( bijv. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101). Zo moeten exosomen worden gekenmerkt door verschillende methoden voor verschillende aspecten. Transmissie elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om membraan vesicles te visualiserenZoals exosomen 4 , 5 . Nanoparticle tracking analyse (NTA) en dynamische lichtverspreiding analyse (DLS) worden gebruikt voor het meten van de grootte en het aantal gezuiverde exosomen 4 . Het lipidemembraangehalte van exosomen kan door dichtheidsgradiënt worden gecontroleerd. Exosomale markers, zoals CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101 6 , 7 kunnen worden gemeten door Western blotting. Mammary basale cellen hebben de mogelijkheid om mammekirtels te genereren wanneer ze in vetpads geïmplanteerd worden, terwijl luminale cellen niet kunnen 8 , 9 , 10 . Zo worden ook basaalcellen van mammoet ook aangeduid als mammografische repopulerende eenheden. Door gebruik te maken van het model van basale en luminale cellen van de mammoet kan het vermogen van EV&#39;s / exosomen om celkenmerken tussen verschillende celpopulaties over te dragen, worden onderzocht. Dit werkDemonstreert de werkwijze voor het overbrengen van kliervormend vermogen van basale epitheelcellen naar mammary luminale epitheelcellen door gebruik te maken van EV&#39;s / exosomen afgeleid van mammale basale epitheelcellen. Luminale mammary epithelialcellen verworven basale cel eigenschappen na de inname van EV&#39;s / exosomen afgescheiden van basale cellen en kunnen dan mammary klieren 4 vormen .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>voor nanoparticle tracking analysis (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (w/v) oplossing van iodixanol in water (steriel).</td></tr><tr><td>CD81-antilichaam</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 &deg;C, overnacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CD9-antilichaam</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 &deg;C, overnacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CD63-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 &deg;C, overnacht&nbsp;</td></tr><tr><td>TSG101-antilichaam</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 &deg;C, overnacht&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 &deg;C, overnacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetaat ester)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>fluorescentiecelanalyzer</td></tr><tr><td>collageenase Type IV&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>trypsine</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>een mengsel van recombinant menselijk insuline, humane transferrine en natriumseleniet</td></tr><tr><td>accutase</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collagenolytische enzymactiviteit</td></tr><tr><td>dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>anti-CD49f-antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti-EpCAM-antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>celsorteerder</td></tr><tr><td>carmine alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>menselijke borstpieronstelcellen (HMLE-cellen, NAMEC's)</td><td></td><td></td><td>geschenken van Dr. Robert Weinberg</td></tr><tr><td>permount</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>natriumbicarbonaat</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (runde hypofyse-extract)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15 cm kweekschotel</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>tafelcentrifuge</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>Centrifuge 3415R</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifugebuis</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA-eiwitassay</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscopie</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>gelatine&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>10 cm kweekschotel</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-wells kweekschotel</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>vrouwelijke C57BL/6-muizen</td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (fetaal bovien serum)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15710072</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>isofluoraan&nbsp;</td><td>Halocarbon</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (ethanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>glaciumazijnzuur</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>kaliumsulfaat van aluminium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu;m membranen</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP-wondclips, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP-wondclipapplier</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C10046</td><td>plasmamembraankleuring</td></tr></tbody></table>

overdracht van mammary gland-vormende vermogen tussen mammary basal epithelial cellen en mammary luminale cellen via extracellulaire vesicles / exosomen

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cellen kunnen communiceren via exosomen, ~ 100 nm extracellulaire vesicles (EV&#39;s) die proteïnen, lipiden en nucleïnezuren bevatten. Non-adherent / mesenchymale mammary epithelial cell (NAMEC) -gerelateerde extracellulaire vesicles kunnen worden geïsoleerd uit NAMEC medium via differentiële ultracentrifugatie. Op grond van hun dichtheid kunnen EV&#39;s worden gezuiverd via ultracentrifugatie bij 110.000 x g. De EV-bereiding uit ultracentrifugatie kan verder worden gescheiden door gebruik te maken van een continu dichtheidsgradiënt om verontreiniging met oplosbare eiwitten te voorkomen. De gezuiverde EV&#39;s kunnen vervolgens verder geëvalueerd worden met behulp van nanoparticle-tracking analyse, die de grootte en het aantal blaasjes in de bereiding meet. De extracellulaire blaasjes met een grootte van 50 tot 150 nm zijn exosomen. De NAMEC-afgeleide EV&#39;s / exosomen kunnen worden ingezet door mammale epitheelcellen, die kunnen worden gemeten door flowcytometrie en confocale microscopie. Sommige mammale stamcellen eigenschappen ( bijv. Membraanvormende vermogen) kunnenWorden overgebracht van de stamachtige NAMEC&#39;s ​​naar epitheliale cellen via de NAMEC-afgeleide EV&#39;s / exosomen. Geïsoleerde primaire EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen kunnen geen mammaklieren vormen nadat ze in muizenvetpads zijn getransplanteerd, terwijl EpCAM lo / CD49f hi basale mammary epitheelcellen na de transplantatie membraan vormen. Toepassing van NAMEC-afgeleide EV&#39;s / exosomen door EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen stelt hen in staat om melkklippen te genereren na transplantatie in vetpads. De EV&#39;s / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen overdragen de kliervormende vermogen van EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen.

Aangezien aangetoond is dat het blokkeren van PGE 2 / EP 4 signalering triggers EV / exosome vrijgave van basale basale stamcellen 4, presenteert dit werk een werkwijze voor het isoleren van de geïnduceerde EV&#39;s / exosomen uit mammary epithelial basal cell (NAMEC) cultuur. Aangezien NAMEC&#39;s ​​worden gekweekt in serumvrij medium, zijn er geen bestaande EV&#39;s / exosomen afgeleid van serum 13 . Voor cellen die in serum beva...

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV&#39;s / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV&#39;s / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

De algemene doelen van deze procedure zijn het isoleren van stamcel-eigenschappen overdragende extracellulaire blaasjes en exosomen uit stamcellen, en het beoordelen van het vermogen van deze nanodeeltjes om stamcel-eigenschappen over te dragen. Dit kan cruciale vragen in het vakgebied van stamcellen beantwoorden over de vraag of stamcel-afgeleide eigenschappen via cellen of blaasjes worden overgedragen.Of exosomen kunnen stamceleigenschappen overdragen naar niet-stamcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de geïnduceerde stamcel voortkomt uit transcelulaire blaasjes. Daarnaast kunnen exosomen worden gebruikt om niet-stamcellen direct te herprogrammeren tot stamcellen.De procedure zal worden gedemonstreerd door postdoctoraal onderzoeker LeMonsier, samen met chirurgisch assistenten Pei-Ling, Wen-Tin en Shih-Yin, allen afkomstig uit mijn laboratorium. Begin met het uitplaatten van 1,2 × 10⁶ niet-adherente/mesenchymale mammaire epitheelcellen, of NAMECs, in 12 milliliters medium per 15 centimeter schaal voor een vierdaagse cultuur in een celkweekincubator. Oogst op dag vier het kweekmedium voor centrifugatie op een tafelmodel.Breng vervolgens het supernatant over in een conische buis voor een tweede centrifugatie op de tafelcentrifuge. Breng daarna het supernatant over in een nieuwe ultracentrifugebuis en voer ultracentrifugatie uit gedurende 30 minuten. Breng aan het einde van de centrifugatieronde het supernatant over in een nieuwe ultracentrifugebuis en centrifugeer het supernatant opnieuw in de ultracentrifuge.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet met extracellulaire blaasjes-exosomen in PBS voor een derde ultracentrifugatie. Resuspendeer het pellet vervolgens in verse PBS en ultracentrifugeer de celpartikels voor een laatste maal. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet met extracellulaire blaasjes-exosomen in 100 µL PBS.Meet vervolgens de proteïneconcentratie van de extracellulaire vesiclesuspensie met een bicinchonininezuur-assay. De concentratie moet ongeveer 20 tot 40 µg per 100 µL zijn. Om de concentratie en de grootte van de extracellulaire vesicles en exosomen te meten, worden de celpartikels verdund tot 2 µg proteïne per 100 mL PBS.Analyseer de deeltjes vervolgens met nanoparticle tracking analyse. Om de exosomen te zuiveren via een dichtheidsgradiënt, resuspendeer na de derde ultracentrifugatie de pellet in 2 mL 40% iodixanol in PBS. Breng vervolgens opeenvolgende volumes van 2 mL 30%, 20%, 10% en 5% iodixanol aan bovenop de celsuspensie.Scheid de celfractie door middel van dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie en gebruik een pipet om aan het einde van de centrifugatie elk van de tien gradiëntlagen te oogsten. Analyseer vervolgens de aanwezigheid van exosoommarkers in elke fractie via SDS-PAGE en western blot volgens standaardprotocollen, waarbij gebruik wordt gemaakt van antilichamen tegen de relevante exosoommarkers.Om mammaire epitheelcellen te behandelen met extracellulaire blaasjes en exosomen, zaait u eerst 2 x 10^5 flow-gesorteerde EpCAM^hi-CD49f^low luminale mammaire epitheelcellen per plaat op met gelatine gecoate zes-wells platen. Behandel vervolgens elke celcultuur met 2 µg/ml NAMEC-afgeleide extracellulaire blaasjes en exosomen. Vervang het cultuurmedium elke twee dagen gedurende tien dagen door verse extracellulaire blaasjes en exosomen.Plaats aan het einde van de behandelingsperiode een drie weken oude, geanestheseerde vrouwelijke 57 BL6 muis in rugligging en verwijder de vacht op de middenbuik. Desinfecteer de operatieplaats met drie afwisselende cycli van 70% alcohol en povidonjodium. Maak vervolgens een verticale incisie van 1,5 cm door de huid, langs de ventrale thoracisch-inguinale regio.Expose afwisselend de rechter en linker vierde mammaire vetkussentjes. Lokaliseer de lymfeklier in elk vetkussentje en verwijder de gehele klier perancama onder de lymfeklier. Gebruik vervolgens een natuurlijk enzym met prodialytische en cologenalytische activiteit om de extracellulaire vesikels en exosoom-behandelde luminale mammaire epitheelcellen los te maken.Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS na tien minuten. Verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder het supernatant. Verdun na het tellen de cellen tot een concentratie van 1 × 10² tot 1 × 10⁴ cellen per 15 µL PBS.Gebruik een glazen injectiespuit van 100 µL uitgerust met een naald van gauge 27 om 15 µL van de suspensie van mammaire epitheelcellen in elk vetkussen te injecteren. Sluit vervolgens de huid met wondclips. Maak acht weken na de injectie een verticale incisie door de huid van de thoracale regio naar de inguinale regio en leg zowel de rechter- als de linker vierde mammaire vetkussens bloot.Verwijder de vierde mammaire klier en spreid de vetkussentjes uit op afzonderlijke glazen microscoop OBJECTGLASjes. Verplaats de objectglazen vervolgens naar een zuurkast en fixeer de kussentjes gedurende de nacht bij kamertemperatuur met Collies fixatief. Was de monsters de volgende ochtend gedurende 15 minuten in 250 milliliters van 70 procent ethanol.Vervolgens gedurende vijf minuten spoelen met 250 milliliter gedestilleerd water. Na het wassen met gedestilleerd water de vetkussentjes overnacht bij kamertemperatuur kleuren met carmine alum. Daarna volgt dehydratie in oplopende ethanol-incubaties van 15 minuten.Na de laatste dehydratie worden de monsters in een zuurkast overgebracht naar xyleen totdat de vetkussens transparant worden. Monteer vervolgens de coupes met monteermedium en gebruik een digitale coupescanner om de vetkussens te beelden bij 2.400 dots per inch. De grootte van de geïsoleerde blaasjes en het ultracentrifugepallet is doorgaans ongeveer 100 nanometer, gemeten via nanoparticle tracking analysis.Verder onthult transmissie-elektronenmicroscopische analyse van ultracentrifugefracties van NAMEC-geconditioneerd medium de aanwezigheid van overvloedige membraanvesikels. Na densiteitsgradiëntscheiding, zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen exosoommarkers worden gedetecteerd in de 20 procent iodixonolfractie. Flowcytometrische analyse van humane luminale mammaire epitheelcellen behandeld met CFSE-gelabelde, uit NAMEC afgeleide extracellulaire vesikels en exosomen, onthult een tienvoudig hoger CFSE-signaal in de met exosomen behandelde culturen.Dit duidt op de specifieke opname van met CFSE gelabelde extracellulaire blaasjes en exosomen door de mammaire epitheelcellen. Bovendien vertonen de negatieve controles, de met PBS behandelde mammaire epitheelcellen, geen CFSE-signaal, terwijl met confocale microscopie bewijs kan worden waargenomen van de opname van NAMEC-afgeleide extracellulaire blaasjes en exosomen door de met exosomen behandelde cellen. Opmerkelijk is dat de vetkussentjes van muizen die flow-gesorteerde epCAMhi/CD49Flo luminale mammaire epitheelcellen kregen geïnjecteerd, welke tien dagen lang waren behandeld met NAMEC-afgeleide extracellulaire blaasjes en exosomen, het vermogen verwierven om melkklieren te vormen.Na de ontwikkeling heeft deze technologie de weg vrijgemaakt voor onze onderzoekers op het gebied van stamcelbiologie, om het gebruik van uit stamcellen afgeleide transcellen, blaasjes en exosomen te onderzoeken in de regeneratieve geneeskunde en directe celherprogrammering.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

HC11 lactogenic differentiatie kan worden gekenmerkt door de vorming van overkoepelde bedoelde structuren als mammospheres. De structuren kunnen worden opgesomd door de fase-contrast-microscopie om te helpen bij het kwantificeren van lactogenic differentiatie.

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

Dit artikel toont de procedure ontwikkeld door DeOme...

Borstklieren Epitheliale Transplant Procedure

In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

Het huidige protocol beschrijft intraductale injectie van virale vectoren via de speen om genen van belang af te leveren in de borstepitheelcellen.

In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas

Leer hoe extracellulaire vesikels en exosomen uit mesenchymale mammary epitheelcellen worden geïsoleerd en gekarakteriseerd. Deze methode toont aan dat EVs stamcel-eigenschappen kunnen overdragen naar luminale mammary epitheelcellen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen (Video) | JoVE Journal

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Meer video's verkennen