Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution
1 juni 2017
Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.
Het algemene doel van native elektroforese in combinatie met in-gel assays, immunoblotting en native elektroelutie is het behoud en de analyse van de samenstelling van mitochondriale supercomplexen. Deze methode kan helpen om te beantwoorden hoe de eiwitcomplexen van de mitochondriale elektronentransportketen zich assembleren in supercomplexen, afhankelijk van vele factoren, waaronder bio-energetische behoeften en fysiologische en pathologische omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat, indien correct uitgevoerd, de fysiologische integriteit en functionaliteit van de mitochondriale supercomplexen gedurende het hele isolatieproces wordt behouden.
Deze methode kan ook worden toegepast om de dynamica van supercomplexassemblage te bestuderen en om eiwitcomplexen in het plasmamembraan, evenals in andere intracellulaire membranen te analyseren. Bij de voorbereiding van in-gel assays is het absoluut van cruciaal belang dat alle onderdelen die voor native elektroforese worden gebruikt, niet zijn verontreinigd door detergenten, omdat deze zullen bijdragen aan een ontbinding van de mitochondriale supercomplexen. Snijd een of meer banen van een helder native gel en breng deze over naar een gelabelde container.
Om de complex-1 assay uit te voeren, combineer 10 milliliter assaybuffer met 25 milligram nitro blauw tetrazoliüm en 100 microliters van 10 milligram per milliliter NADH. Voeg dit toe aan de uitgesneden heldere native gelbaan of het gebied van belang. Volg de ontwikkeling van blauwe banden na zachtjes schudden op een rocker gedurende minimaal drie minuten.
Fixeer vervolgens de gel in 10 tot 20 milliliter acetaatzuuroplossing of spoel in vijf millimolair Tris pH 7,4 om de reactie te stoppen. Maak foto's voor documentatie. Om de complex-5 assay uit te voeren, verkrijg een gel, een baan of een gebied van belang van een blauwe native of heldere native gel.
Incubeer het monster gedurende twee uur met zachtjes schudden in 10 tot 20 milliliter assaybuffer, plus of min vijf microgram per milliliter oligomycine bij kamertemperatuur. Vervang na incubatie de buffer met 14 milliliter verse assaybuffer. Voeg vervolgens, in volgorde, 190 microliters van een molaaire magnesiumsulfaat, 27,28 milligram loodnitraat, 60 milligram ATP en 75 microliters oligomycine toe.
Incubeer met zachtjes schudden en let op een witte neerslag, omdat banden op de oligomycine-behandelde gels niet-complex-5 afhankelijke banden zullen geven. Fixeer de gel in methanol-gebaseerde fixeermiddel omdat zure oplossingen het loodprecipitaat zullen oplossen. Fotografeer de resultaten en volg met eiwitoverdracht en immunoblotting, zoals beschreven in het protocol van de tekst.
Op de dag van elektroelutie, plaats een frit in de bodem van elke glazen buis die zal worden gebruikt. Plaats indien nodig de glazen buis in elutiebuffer en duw de frit van binnenuit naar de bodem van de buis. Duw de glazen buis met de frit in het module van de Electro-Eluter.
Bevochtig de pakking met elutiebuffer en schuif de glazen buis op zijn plaats. Zorg ervoor dat de toppen van de glazen buizen gelijk zijn met de pakking. Sluit de lege pakkingen met stoppen.
Plaats vervolgens een natte membraankap op de bodem van de siliconenadapter en vul de adapter met elutiebuffer. Pipet de buffer en de adapter langzaam op en neer om eventuele luchtbellen rond de dialyse membraan te verwijderen. Schuif de buffer-gevulde adapter naar de bodem van de glazen buis.
Verwijder vervolgens alle bubbels die op de frit in de glazen buis verschijnen. Vul elke glazen buis met de elutiebuffer. Plaats de uitgesneden banden van de BN-PAGE in de glazen buizen.
Snijd grote stukken in kleinere stukken. Zorg ervoor dat de vulhoogte binnen de glazen buis ongeveer een centimeter is. Plaats vervolgens de hele module in de tank.
Voeg ongeveer 600 milliliter koude elutiebuffer toe aan de tank. Zorg ervoor dat de siliconenadapterkapjes in de buffer zijn ondergedompeld. Plaats een roerlat aan de bodem van de tank voordat de eiwitten gedurende vier uur bij 350 volt in een koude kamer worden elutieert.
Nadat de elutie is voltooid, verwijder de Electro-Eluter module uit de buffertank en plaats deze in een wasbak of kom. Als er een stop werd gebruikt, verwijder deze om de bovenste bufferkamer te laten lekken. Verwijder de buffer uit elke glazen buis en gooi het weg.
Zorg ervoor dat de siliconenadapter op zijn plaats blijft en dat de vloeistof onder de frit niet wordt verstoord of geschud. Verwijder vervolgens voorzichtig de siliconenadapter, samen met de membraankap van de bodem van de glazen buis. Pipet de inhoud van de siliconenkaap in een microbuis.
Met nog eens 200 microliters elutiebuffer, spoel de siliconenkaap en voeg toe aan de microbuis. Herhaal dit proces voor alle glazen buizen. Bewaar de herbruikbare membraankapjes door ze in elutiebuffer met 0,5 milligram per milliliter natriumaziet te plaatsen en te koelen.
Supercomplexen van hartmitochondriën worden hier gevisualiseerd door in-gel assays. Banen van het heldere native gel worden gebruikt voor in-gel assays voor complex-1 en complex-5. De specificiteit van het signaal kan worden geëvalueerd door gebruik te maken van remmers, zoals oligomycine voor de ATP-synthase.
In-gel assays geven informatie over de grootte van een eiwitcomplex, met complex-1 of complex-5 activiteit, maar niet over hun samenstelling. De blauwe native gel toont banden van eiwitcomplexen die kunnen worden uitgesneden voor elektroelutie. Na elektroelutie wordt het eluaat gebruikt voor verdere analyse, zoals in-gel assays, zilverkleuring van de geëluteerde eiwitten door native of denaturerende elektroforese, en Western blotting.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen drie dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Deze drie dagen omvatten het isoleren van mitochondriën, het uitvoeren van een overnachtelijke blauwe native maxi elektroforese en immunoblotting. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe mitochondriale supercomplexen te isoleren en te identificeren met behulp van native elektroforese, in-gel assays en elektroelutie.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat mitochondriale supercomplexen kwetsbaar zijn. Het invriezen en ontdooien van monsters moet tot een minimum worden be
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van native elektroforese om mitochondriale elektronentransportketencomplexen en hun supercomplexen te scheiden. Deze methode behoudt de fysiologische integriteit van de complexen, waardoor een gedetailleerde analyse van hun assemblage en structuur mogelijk is.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Mitochondriale supercomplexen spelen een cruciale rol in de cellulaire energiemetabolisme.
- Inzicht in hun assemblage kan inzicht geven in bioenergetische behoeften en ziektetoestanden.
- Native elektroforese helpt de functionaliteit van deze complexen tijdens analyse te behouden.
- Besmetting met detergenten kan de integriteit van supercomplexen verstoren.
Doel van het onderzoek
- Om de assemblage van mitochondriale supercomplexen te analyseren.
- Om de factoren die de complexvorming beïnvloeden te onderzoeken.
- Om de dynamica van supercomplex-assemblage onder verschillende omstandigheden te verkennen.
Gebruikte methoden
- Native elektroforese voor scheiding van complexen.
- In-gel assays voor functionele analyse.
- Immunoblotting voor eiwitidentificatie.
- Electroelutie voor zuivering van individuele complexen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle behoud van mitochondriale supercomplexen tijdens isolatie.
- Inzicht in de assemblagemechanismen van elektronentransportketencomplexen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op andere intracellulaire membranen.
- Identificatie van kritische factoren die de stabiliteit van supercomplexen beïnvloeden.
Conclusies
- Native elektroforese is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van mitochondriale supercomplexen.
- De methode kan ons begrip van mitochondriale functie in gezondheid en ziekte verbeteren.
- Verder onderzoek kan de toepassingen uitbreiden naar andere cellulaire structuren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding mitochondrial supercomplex assembly provides mechanistic insights into cellular bioenergetics, supporting target validation in metabolic disease research. This method enables functional analysis of electron transport chain complexes in their native state, improving predictive confidence in preclinical models. It supports hypothesis testing and pathway clarification in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving supercomplex assembly under varying bioenergetic conditions.
- Operational Value: Preserves physiological integrity of mitochondrial complexes, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking complex dynamics to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems for downstream functional screening of compounds affecting mitochondrial function.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through reproducible native gel separation and in-gel activity detection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across mitochondrial and other intracellular membrane systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase supercomplex analysis to preclinical validation via functional readouts.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translational biomarkers tied to supercomplex stability and activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic de-risking of mitochondrial targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving supercomplex assembly dynamics.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative in-gel assays that report complex-specific activity.
- Analytics: Provides functional readouts and structural data that help compare experimental conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant supercomplex phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for studying membrane protein complexes beyond mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mitochondrial biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of supercomplex isolation and analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic disease programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on supercomplex stability and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native protein electrophoresis and mitochondrial isolation.
- Demands detergent-free instrumentation and analytical infrastructure to preserve supercomplex integrity.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sample handling and gel processing.
- Involves adaptation considerations when applying to non-mitochondrial membrane systems.
- Limited by sample fragility; requires cold handling and minimal freeze-thaw cycles to maintain functionality.
