Name: DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in Ambystoma Mexicanes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Leer vasculaire visualisatie met DiI-perfusie voor regeneratief onderzoek bij Ambystoma mexicanum. Deze methode maakt heldere fluorescentiebeelden van bloedvaten mogelijk om revascularisatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het Brigham &amp; Women&#39;s Hospital en de March of Dimes. De auteurs willen alle leden van het Whited Lab bedanken voor hun steun en advies.

Alle axolotl-experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van Brigham en Women&#39;s Hospital (BWH). 1. Stel Perfusion Experiment op <ol><li> Plaats een volwassene axolotl in een plastic container, gevuld met 0,1% tricaine oplossing (MS222) gedurende 15-20 minuten of tot het volledig verdoofd is. Zorg ervoor dat de container voldoende tricineoplossing is, zodat de axolotl volledig ondergedompeld is. Opmerking: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierlijke zorg. Bij BWH wordt een axolotl als volledig verdoofd beschouwd als het een voetnijp test mislukt, wat betekent dat er geen reflexieve beweging is wanneer de voet zachtjes wordt geperst. Let op: hoewel tricine een verdoving is die specifiek wordt gebruikt voor aquatische organismen, moet direct contact met de tricineoplossing voorkomen worden. </li><li> Stel het axolotl perfusie station op. <ol><li> Plaats deAbsorberend pad op een vlakke, vlakke oppervlakte met de absorberende kant naar boven gericht. </li><li> Knip een gat in het polystyreen schuim frame dat de juiste grootte en vorm voor de verdoofde axolotl ligt in de rugliggende positie. Plaats het frame op het absorberende pad. Opmerking: Sommige extra papieren handdoeken kunnen direct onder het frame geplaatst worden voor extra absorptie. </li><li> Laad de peristaltische pomp met de perfusiebuis. Zet de pomp aan op een stromingssnelheid van 0,7 ml / min, met de klok mee naar beneden. </li><li> Maak de verdunningsoplossing met 0,7x PBS en 5% glucose in een 1: 4 mengsel. </li><li> Meng 10 ml verdunningsoplossing met 200 μl van de DiI-voorraadoplossing in een 50 ml conische buis. Cap en meng door inversie. Bedek deze buis met aluminiumfolie om de werkoplossing tegen blootstelling aan licht te beschermen. Opmerking: Volumes moeten proportioneel veranderd worden volgens de grootte van de axolotl. Deze waarden zijn voor een axolotl van ongeveer 15 cm (snout-naar-tail lengte). EENNimalen van deze grootte hebben mogelijk geen volledige seksuele volwassenheid bereikt, zodat dierlijk geslacht op dit moment niet kan worden bepaald. </li><li> Vul een 50 ml conische buis met 0,7x PBS. Opmerking: PBS wordt gebruikt om de lus- en axolotl-exsanguinatie te primeren. </li><li> Bevestig de 27-gauge vlinder naald aan het einde van de perfusie buis. Vouw de vlindervleugels op elkaar en plaats de klemstand. </li><li> Plaats het vrije uiteinde van de perfusiebuis in de 50 ml conische buis gevuld met 0,7x PBS en voer de perfusiepomp door totdat de volledige buis met oplossing is gevuld. Pauzeer de pomp zodra de hele buis gevuld is met PBS. Opmerking: Zorg ervoor dat het buis te allen tijde vrij is van luchtbellen, omdat dit luchtembolie in de axolotl veroorzaakt en volledige perfusie voorkomt. </li><li> Plaats een papieren handdoek in de axolotl-vormige vorm in het polystyreen schuim frame. Gebruik een transferpipette, doek de handdoek met de tricineoplossing. Opmerking: Knip een klein vierkant in het midden van het papierEl om de afvoer van vloeistoffen tijdens de perfusieprocedure mogelijk te maken. </li><li> Plaats de verdunde axolotl op de papierdoek in het polystyreen schuim frame. </li></ol></li></ol> 2. Het openen van de Axolotl-borst <ol><li> Gebruik chirurgische tang om de huid langs de centrale as van de borst van de axolot te knijpen, net onder de schouderslijn. Optrekken. </li><li> Gebruik een scalpel om een ​​kleine snede te maken waar de huid is getrokken. </li><li> Verwijder een vierkante patch van de huid over de borst om twee kraakbeenplaten te onthullen. <ol><li> Verwijder de huid om een ​​raam over de thoracale holte te openen die groot genoeg is om het hart duidelijk te zien en ongeveer 5 mm van de aorta af te trekken van het hart. </li></ol></li><li> Zet het bindweefsel zorgvuldig door met behulp van pincet of de gesloten schaar, om te voorkomen dat alle belangrijke bloedvaten worden gesneden. </li><li> Breng elke kraakplaat afzonderlijk met behulp van de tang en accijnst ze wMet de chirurgische schaar. </li><li> Knip het pericardium met de tang vast, trek het op en steek het met behulp van de chirurgische schaar; Deze incisie moet net zo diep genoeg zijn om het zeer dunne pericardium te puncturen en moet groot genoeg zijn om het pericardium te verwijderen. Pas op om het hart niet te snijden. </li><li> Verwijder het pericardium delicaat om het hart en de aorta bloot te leggen. Opmerking: Gebruik een transferpipet om de borstholte en de kiemen periodiek met de tricineoplossing te spoelen om het gebied helder te houden en de axolotl verdoofd te houden. </li></ol> 3. Perfusie van de Axolotl <ol><li> Plaats de klemstang met de geladen vlindernaald naast het polystyreen schuimframe, zodat de arm van de klem gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om de naald in de axolotl aorta te plaatsen. Steek de punt van de naald in de richting van het rostrale aspect van het dier tijdens het inbrengen en houd de naald evenwijdig aan de aorta om te voorkomen dat het door de opPositieve kant. </li><li> Zet de peristaltische pomp aan. 0,7x PBS moet door de buis doorgaan. </li><li> Steek de naald in de aorta. <ol><li> Schuif de tang onder de aortische boog en trek licht omhoog om gemakkelijk toegang te krijgen. </li><li> Manoeuvreer de naaldklem combinatie zodanig dat de naald langs de lengte van de aorta loopt, naar boven gericht. Plaats de naald terwijl u de tang gebruikt voor ondersteuning achter de aorta. Opmerking: De naald moet diep genoeg in de aorta worden ingebracht om ervoor te zorgen dat het niet tijdens perfusie zal glijden. Dit kan ongeveer 5 mm zijn voor een 15 cm axolotl. Zorg ervoor dat de naald perfect in lijn is met de aorta om volledige vulling van het vaartuig te vermijden. Door-en-door-puncturen kunnen massale bloeding veroorzaken en de succesvolumes van perfusie verminderen. Succesvolle invoeging kan worden bevestigd door zichtbare vergroting van de atria van het hart. </li></ol></li><li> Snijd een atrium snel met de sciSsors en laat bloed afvoeren. <ol><li> Spoel met tricineoplossing om bloedophoping en stollingsvorming in de borstholte te voorkomen. </li></ol></li><li> Perfuseer de axolotl met ongeveer 20-30 ml PBS. Het dier moet van lichtroze naar kleur veranderen in een succesvolle perfusie. </li><li> Pauze de peristaltische pomp en beweeg het vrije uiteinde van de buis in de 15 ml buis DiI-oplossing. Start de pomp opnieuw op, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buis ontstaan. </li><li> Perfuse de axolotl met de volledige werkvoorraad van DiI. Opmerking: in een succesvolle perfusie, de axolotl met veranderende kleur naar de heldere roze van de DiI. Dit zal het meest opvallend zijn in de kieuwen. </li><li> Pauze de pomp na de perfusie met DiI is compleet en plaats het vrije uiteinde van de buis in 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing om het weefsel vast te maken. Start de pomp opnieuw en vul tenminste 10 ml PFA aan. Let op: PFA is giftig en moet worden behandeld en afgezondenGepast van Handschoenen en veiligheidsbril dienen te worden gedragen, en oplossingen moeten in een dampkoker worden aangebracht. Perfusie van de axolotl met PFA om het weefsel te repareren resulteert in de dood van het dier. </li></ol> 4. Beëindiging van de perfusie- en visualisatievoorbereiding <ol><li> Stop de peristaltische pomp en verwijder de naald uit de axolotl aorta. </li><li> Plaats de axolotl op een plastic plaat. Opmerking: Het gebruik van de helft van een grote Petri-schotel werkt goed en maakt het mogelijk om een ​​kleine hoeveelheid Tricaine of PBS op de axolotl te gieten om zijn huid nat te houden en de visualisatie kwaliteit te verbeteren. </li><li> Verwijder alle gebruikte materialen in de betreffende afvalbakken. Schoon chirurgische gereedschappen met 70% ethanol, desinfecteren met behulp van een glaspiraal sterilisator tussen dieren en steriliseren door autoclaving volgens de procedure. Spoel de buizen met de PBS-oplossing en laat ze vervolgens afvoeren, drogen en opslaan voor verdere gebruik. </li></ol> 5. Visualisatie van de Perfused Axolotl <ol&gt; <li> Plaats de axolotl onder een fluorescerende confocale microscoop. </li><li> Schakel de lichten uit, omdat visualisatie van de DiI-gekleurde schepen door licht wordt belemmerd. </li><li> Gebruik een groene fluorescentie-emissiefilterkubus ( bijv. ET-CY3) met de confocale microscoop om de vasculatuur van de axolotl te visualiseren. Gebruik excitatie licht van golflengte 545 nm. Opmerking: Om een ​​beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen, kunnen de volgende parameters worden gebruikt: blootstelling voor 1,1 s, winst van 1x, verzadiging van 1,0, vergroting van 2X. </li></ol>

<ol><li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryo%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374(2013).</li>
<li>Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23328838"> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li>
<li>Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.formatex.info/microscopy4/29-39.pdf"> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li>
<li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895330/">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li>
<li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li>
<li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Visualisatie van de vasculatuur van de axolotl kan succesvol worden bereikt via perfusie met de lipofiele carbocyanine kleurstof, DiI. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol voor de perfusie van de axolotl met DiI met behulp van een peristaltische pomp. We tonen ook de latere visualisatie van de axolotl vasculatuur met behulp van een fluorescerende confocale microscoop. Dit protocol was een aanpassing van het knaagdier DiI perfusieprotocol gezien in Li et al. 7 , maar grote ver...

Visualisatie van vasculatuur speelt een belangrijke rol bij het begrijpen van de structuur en functie van organismen in vele soorten. Vanaf de 16e eeuw met Leonardo da Vinci zijn modellen en grafische voorstellingen van de circulatie 1 bestudeerd. Met behulp van wassen en rubberen matrijzen werden weefsels geperfuseerd om driedimensionale modellen van de vaatwortel te creëren, die de studie van organogenese en pathogenese 1 , 2 toonden. Harsen en wassen werden gekleurd met kleurstoffen zoals India Ink of Carmine Red om hun eenvoudige visualisatie 1 , 2 mogelijk te maken . Deze technieken veroorzaken echter veel problemen omdat hun hoge viscositeiten volledige perfusie van het weefsel van belang 1 verhinderden. Toen het veld verfijnder werd, kwam het gebruik van confocale en elektronenmicroscopen in het spel, waardoor de perfusie techniek<html> Ues weg van gietvormen en naar vloeibare perfusies van de vaatwasser, waarvan sommige toegestaan ​​zijn voor de perfusie en beeldvorming van bloedvaten zonder het aanvankelijke weefsel 3 te vernietigen. DiI, een fluorescerende carbocyanine kleurstof, is een dergelijke vlek die de perfusie van dieren mogelijk maakt zonder schade aan het vaatweefsel. Carbocyanine kleurstoffen zijn lipofiele kleurstoffen die in contact komen met celmembranen. Deze kleurstoffen zorgen voor makkelijke en onmiddellijke kleuring van vasculaire endotheelcellen, die vervolgens onder een fluorescerende confocale microscoop kunnen worden bekeken. DiI beweegt via laterale diffusie in het lipidemembraan van cellen, zoals blijkt uit de etikettering en opsporing van neuronen 4 . Chemisch geven de twee alkylketens van DiI de hoge affiniteit voor celmembranen, terwijl twee geconjugeerde ringen van een fluorochroom die verantwoordelijk zijn voor het uitzenden van een rode golflengte wanneer het opgewekt wordt door groene fluorescerende lichtfilters&gt; 4. DiI is in veel capaciteiten gebruikt, met inbegrip van succesvolle etikettering van het plasmamembraan en zowel anterograde als retrograde etikettering in neuronen 5 , 6 . DiI is eerder gebruikt in perfusieprotocollen terwijl het visualiseren van de vasculatuur van muizen 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) zijn salamanders die uitsluitend in brakke meren in de buurt van Mexico City, Mexico leven. Deze dieren zijn een belangrijk model geworden voor het begrijpen van regeneratieve processen, aangezien zij volledige ledematen, staart (inclusief zenuwsnoer), delen van het hart en andere inwendige organen, en delen van het oog als volwassenen 8 , 9 kunnen regenereren. Bovendien, met de recente toepassing van genetische hulpmiddelen in axolotls, is nu ongekend inzicht in de moleculen en cellen die deze processen runnen 8 mogelijk. De succesvolle regeneRantsoen van een hele ledemaat vereist een uitgebreid revascularisatieproces, dat een belangrijke rol kan spelen in regeneratie, buiten de traditionele functies van bloedvaten bij het leveren van zuurstof en voedingsstoffen. Het begrijpen van revascularisatie in de context van weefselregeneratie is imperatief. Axolotl bloedvaten zijn eerder met India Ink in beeld gebracht, en hoewel de resultaten intrigerend zijn, is dit proces niet in de daaropvolgende decennia 10 herzien. Wij trachten een DiI perfusie protocol aan te passen dat is ontwikkeld voor gebruik in zoogdieren om een ​​volledige perfusie en visualisatie van de axolotl vasculatuur 7 mogelijk te maken . Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om succesvol te perfectioneren en vervolgens de axolotl circulatie te visualiseren met een DiI-kleuringstechniek. Deze procedure zorgt voor een nauwkeurige visualisatie van octrooibloedschepen in homeostatische weefsels, evenals in regenererende weefsels, en biedt een nieuwe methode voor visualizatioN en analyse van het revascularisatieproces in de axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&nbsp;</td><td>Marshall Scientific&nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusie slang</td><td>Excelon Lab &amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>maat S1A</td></tr><tr><td>27g vlindernaald</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische pincetten&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen schuim frame</td><td></td><td></td><td>elke polystyreen schuim vierkant met een axolotl-vormige&nbsp; uitgesneden</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbeerbare onderlaag</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Papieren handdoeken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard wegwerpoverdrachtspijp</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Klemstandaard</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine poeder</td></tr><tr><td>Volwassen axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof tanks</td><td></td><td></td><td>Variërende maat geschikt voor de axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscoop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescerende Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in<em&gt; ambystoma mexicanes</em

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusionstechnieken zijn eeuwenlang gebruikt om de circulatie van weefsels te visualiseren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is een soort salamander die is uitgekomen als een essentieel model voor regeneratie studies. Er is weinig bekend over hoe revascularisatie zich voordoet in de context van regeneratie bij deze dieren. Hier rapporteren wij een eenvoudige methode voor visualisatie van de vasculatuur in axolotl via perfusie van 1,1&#39;-dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI). DiI is een lipofiele carbocyanine kleurstof die onmiddellijk in het plasmamembraan van endotheliale cellen inslaat. Perfusie wordt gedaan met behulp van een peristaltische pomp, zodat DiI de circulatie door de aorta binnentreedt. Tijdens perfusie vloeit de kleur door de bloedvaten van de axolotl en voegt zich in contact met de lipide bilayer van vasculaire endotheelcellen. De perfusieprocedure duurt ongeveer een uur voor een acht-inch axolotl. Onmiddellijk na perfusie wiTh DiI, kan de axolotl met een confocale fluorescerende microscoop worden weergegeven. De DiI licht licht in het rood-oranje bereik uit wanneer het opgewekt wordt met een groen fluorescerend filter. Deze DiI perfusie procedure kan gebruikt worden om de vasculaire structuur van axolotl te visualiseren of patronen van revascularisatie in regenererende weefsels te demonstreren.

<html> Met DiI-kleuring kan de vasculatuur van de axolotl gemakkelijk worden visualiseerd. Bloedvaten van dieren geperfuseerd met de lipofiele kleurstof zijn direct zichtbaar onder een fluorescerende confocale microscoop. Figuur 1 .1-1.5 is een schematische weergave van het perfusieprotocol. Na perfusie met de helderroze kleurstof zal een succesvol geperforeerde axolotl roze verschijnen. Met behulp van een groen fluorescerend filter op een co...

Met behulp van een lipofiele l, 3&#39;-dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.

DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in<em&gt; Ambystoma Mexicanes</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van het vaatstelsel van de axolotl. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen binnen het veld van de regeneratieve geneeskunde over de complexiteit van de revascularisatie van regenererende weefsels bij de axolotl. Het belangrijkste voordeel van deze vasculaire visualisatietechniek is dat alle bloedvaten in het dier eenvoudig in beeld kunnen worden gebracht met een standaard fluorescentiemicroscoop.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regeneratie van de ledematen van de axolotl, kan deze ook worden toegepast op andere weefsels, zoals de staart, het hart, de ogen, de kieuwen of andere organen. Voordat de borstkas van de axolotl wordt geopend, dient eerst het juiste sedatieniveau te worden bevestigd door middel van een knijptest bij de tenen. Gebruik vervolgens een chirurgische pincet om de huid langs de centrale as van de borstkas samen te knijpen, net onder de lijn van de schouders.Maak met een scalpel een incisie op de plaats waar de huid is opgetrokken en verwijder een vierkant stuk huid over de borst om twee kraakbeenplaten bloot te leggen. Open vervolgens een venster over de borstholte en scheur voorzichtig het bindweefsel weg zonder grote bloedvaten door te snijden. Gebruik een pincet om elke kraakbeenplaat afzonderlijk op te tillen en exciseer elke plaat met een chirurgische schaar.Knijp het blootgestelde pericardium voorzichtig vast met de pincet. Trek het weefsel omhoog en punctureer het met de chirurgische schaar, net diep genoeg om het pericardium te verwijderen zonder het hart te beschadigen. Verwijder vervolgens voorzichtig het pericardium om het hart en de aorta bloot te leggen, zodat het hart duidelijk zichtbaar is op ongeveer vijf millimeter van de aorta, waar deze vanuit het hart vertakt.Om de axolotl te perfunderen, plaatst u een klemstatief met een geladen vlindernaald naast een frame van polystyreenschuim, zodat de arm van de klem gemakkelijk kan worden gemanipuleerd voor het inbrengen van de naald. Zet een peristaltische pomp aan om 0,7x PBS door de pompslangen te spoelen en richt de naaldpunt naar de rostrale zijde. Schuif de pincet onder de aortaboog en trek deze lichtjes omhoog.Manoeuvre vervolgens de combinatie van naald en klem, zodat de naald langs de lengte van de aorta in de richting van de kop van het dier loopt, en breng de naald ongeveer vijf millimeter in de aorta in, terwijl de pincet achter de aorta wordt gehouden ter ondersteuning. Een succesvolle insertie kan worden bevestigd door een zichtbare vergroting van de hartatria. Lacerate snel één atrium en laat het bloed weglopen.Perfuseer de axolotl vervolgens met ongeveer 20 tot 30 milliliter PBS. Na een succesvolle perfusie moet de kleur van het dier veranderen van lichtroze naar wit. Wanneer alle PBS is geperfuseerd, pauzeer dan de peristaltische pomp en verplaats het vrije uiteinde van de slang naar een 15 milliliter buis met Dil-oplossing.Start de pomp opnieuw op, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen in de slang ontstaan, en perfuseer het dier met de volledige werkvoorraad Dil. Bij een geslaagde perfusie zal de axolotl veranderen in een felroze kleur, die het meest opvalt in de kieuwen. Wanneer alle Dil is geperfuseerd, pauzeer dan de pomp en plaats het vrije uiteinde van de slang in een 4%paraformaldehyde-oplossing.Start vervolgens de pomp opnieuw en perfuseer ten minste 10 milliliters van het fixatief. Wanneer alle paraformaldehyde is toegediend, stopt u de pomp en verwijdert u de naald. Verplaats de axolotl naar een plastic schaal en plaats de schaal op de tafel van een fluorescentiemicroscoop.Selecteer vervolgens, met de lichten uit, een filter dat excitatie van Dil mogelijk maakt, wat een roodoranje licht uitzendt. Na een succesvolle perfusie is de Dil-kleuring zichtbaar als een rood admittiesignaal in alle weefsels van de axolotl, waaronder de staart, ledematen, kieuwen en ogen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de grote bloedvaten of het hart niet worden beschadigd bij het openen van de borstholte, en dat de naald in lijn met de aorta wordt ingebracht om volledige puncties te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals skeletpreparaties, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het biomedische veld om de vasculatuur van verschillende soorten te bestuderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een cardiale perfusie van de axolotl uitvoert met de carbocyaninekleurstof Dil. Vergeet niet dat het werken met naalden en paraformaldehyde uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van de procedure.

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Hier presenteren we echocardiografie protocollen voor tweedimensionale en driedimensionale Beeldacquisitie van het kloppende hart van de salamander axolotl (Ambystoma mexicanum), een soort model regeneratie van het hart. Deze methoden toestaan voor longitudinale evaluatie van de hartfunctie met een hoge resolutie van de spatio.

2D- en 3D-echocardiografie in de Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Het artikel beschrijft een snel protocol voor het etiketteren van bloedvaten in een Teleost vis door cardiale transfusie van DiI verdund in fixatief, met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model en gericht op de hersenen en de hypofyse weefsel.

Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief

Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.

Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen

Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.

Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model

Hier wordt een effectief protocol voor snelle bloedperfusie gepresenteerd om weefselmonsters van Afrikaanse klauwkikkers voor te bereiden voor transcriptomics- en proteomics-studies.

Effectieve snelle bloedperfusie bij xenopus

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer vasculaire visualisatie met DiI-perfusie voor regeneratief onderzoek bij Ambystoma mexicanum. Deze methode maakt heldere fluorescentiebeelden van bloedvaten mogelijk om revascularisatie te bestuderen.

DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in

Meer video's verkennen