DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in Ambystoma Mexicanes

Het algemene doel van deze procedure is om de vaatstructuur van de axolotl te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van regeneratieve geneeskunde over de fijne kneepjes van de hervatting van de bloedcirculatie in regenererend weefsel bij de axolotl. Het grote voordeel van deze techniek voor vaatvisualisatie is dat alle bloedvaten in het dier gemakkelijk kunnen worden afgebeeld op een standaard fluorescentiemicroscoop.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regeneratie van ledematen van de axolotl, kan ze ook worden toegepast op andere weefsels, zoals de staart, het hart, de ogen, kieuwen of andere organen. Voordat u de borstkas van de axolotl opent, bevestigt u eerst het juiste niveau van sedatie door aan de teen te knijpen. Gebruik vervolgens chirurgische pincetten om de huid langs de centrale as van de borstkas te knijpen, net onder de schouderlijn.

Gebruik een scalpel om een snede te maken waar de huid omhoog wordt getrokken en verwijder een vierkant stuk huid over de borstkas om twee kraakbeenplaten te onthullen. Open vervolgens een raam over de borstholte en scheur voorzichtig het bindweefsel open zonder enige grote bloedvaten door te snijden. Gebruik pincetten om elke kraakbeenplaat afzonderlijk op te tillen en verwijder elke plaat met chirurgische schaar.

Knijp voorzichtig met de pincetten in het blootgestelde pericard. Trek het weefsel omhoog en prik het met de chirurgische schaar, net diep genoeg om het pericard te verwijderen zonder het hart te verwonden. Verwijder vervolgens voorzichtig het pericard om het hart en de aorta bloot te leggen, zodat het hart op ongeveer vijf millimeter van de aorta, die zich van het hart aftakt, duidelijk zichtbaar is.

Om de axolotl te perfunderen, plaatst u een klemmenstandaard met een geladen vlindernaald naast een polystyreenschuimframe, zodat de arm van de klem gemakkelijk kan worden gemanipuleerd voor het inbrengen van de naald. Schakel een peristaltische pomp in om 0,7x PBS door de slang van de pomp te spoelen en richt de naaldpunt naar de rostrale kant. Schuif de pincetten onder de aortaboog en trek lichtjes omhoog.

Manoeuvreer vervolgens de naaldklemcombinatie, zodat de naald langs de lengte van de aorta naar het hoofd van het dier loopt, en steek de naald ongeveer vijf millimeter in de aorta, waarbij de pincetten achter de aorta blijven voor ondersteuning. Een succesvolle inbreng kan worden bevestigd door een zichtbare vergroting van de hartboezems. Lacereer snel een boezem en laat het bloed weglopen.

Perfundeer vervolgens de axolotl met ongeveer 20 tot 30 milliliter PBS. Na een succesvolle perfusie zou het dier van lichtroze moeten veranderen in wit. Wanneer alle PBS is geperfundeerd, stopt u de peristaltische pomp en verplaatst u het vrije uiteinde van de slang naar een buisje van 15 milliliter met Dil-oplossing.

Start de pomp opnieuw en zorg ervoor dat u geen luchtbellen in de slang maakt en perfundeer het dier met de volledige werkzame Dil-oplossing. Bij een succesvolle perfusie zal de axolotl veranderen in een felroze kleur die het meest opvallend zal zijn in de kieuwen. Wanneer alle Dil is geperfundeerd, stopt u de pomp en plaatst u het vrije uiteinde van de slang in een 4% paraformaldehyde-oplossing.

Start vervolgens de pomp opnieuw en perfundeer minstens 10 milliliter van het fixeermiddel. Wanneer alle paraformaldehyde is toegediend, stopt u de pomp en verwijdert u de naald. Breng de axolotl over naar een plastic schaal en plaats de schaal op de tafel van een fluorescentiemicroscoop.

Selecteer vervolgens, met de lichten uit, een filter dat opwinding van Dil mogelijk maakt, wat een rood oranje licht uitzendt. Na een succesvolle perfusie is de Dil-kleuring zichtbaar als een rood opnamesignaal in alle weefsels van de axolotl, inclusief de staart, ledematen, kieuwen en ogen. Als deze techniek eenmaal onder de knie is, kan deze in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat u de grote bloedvaten of het hart niet lacereert tijdens het openen van de borstholte en om de naald in lijn met de aorta in te brengen om doorboorde punten te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals skeletpreparaten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Na de ontwikkeling van deze techniek heeft het onderzoekers in het biomedische veld de mogelijkheid geboden om de vaatstructuur van verschillende soorten te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een cardiale perfusie van de axolotl kunt uitvoeren met de carbocyaninekleurstof Dil. Vergeet niet dat het werken met naalden en paraformaldehyde buitengewoon gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van de procedure.