Bereiding van plasmamembraanvezels uit botmarges Mesenchymale stamcellen voor potentiële cytoplasmvervangende therapie
18 mei 2017
Leeftijdgerelateerde aandoeningen zijn geassocieerd met meerdere defecten in componenten van het cytoplasma. Hier presenteren we een protocol om plasmamembraan vesicles uit mesmermale stamcellen van beenmerg te bereiden. Deze techniek kan potentieel gebruikt worden als middel voor het vervangen van cytoplasma ter verbetering van de leeftijd-geassocieerde fenotypen.
Het algemene doel van deze procedure is om een nieuwe cytoplasma vervangende therapie te leveren aan de gastrocnemius spier van muizen met behulp van plasmamembraanvesikels, of PMV's afgeleid van muizen beenmerg mesenchymale stamcellen of BMSC's. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over de toevoeging van cellen met jong cytoplasma van andere BMSC's via PMV-fusie die de leeftijd geassocieerde fenotypes kunnen verbeteren of zelfs omkeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat PMV-incapsulatie van BMSC-cytosol en kan onmiddellijk worden geïnduceerd door mechanische extrusies.
Wanneer u deze methode demonstreert, is het cruciaal dat u, omdat u aan het extruderen en construeren bent, de stappen moeilijk te leren zijn door te testen om daadwerkelijk te bezitten. Om de PMV's te genereren, kweekt u eerst muis BMSC's in compleet DMEM-kweekmedium in één put van een zes-putten plaat in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Wanneer de cellen 90% confluency hebben bereikt, spoelt u de put met 0,5 milliliter calciumvrij PBS en los de cellen met 0,5 milliliter 0,25% trypsin-EDTA.
Na drie minuten bij 37 graden Celsius, tikt u met de palm van de hand een paar keer op de plaat om celdissociatie te vergemakkelijken en stopt u de vertering met één milliliter kweekmedium. Breng de cellen over in een vijf milliliter conische buis voor centrifugatie en suspendeer de pellet in vier milliliter vers kweekmedium. Verdeel vervolgens de cellen tussen twee putten van een nieuwe zes-putten plaat en plaats de plaat terug in de celkweekincubator voor 24 uur.
De volgende dag, oogst u de cellen van één put door trypsine-digestie zoals net gedemonstreerd. Suspendeer de pellet in 0,5 milliliter vers kweekmedium na collectie door centrifugatie. Laad de cellen in een één milliliter insulinesyringe en bevestig de spuit aan een filtereenheid.
Druk snel op de zuiger om de cellen door het filter te persen en gooi het geëxtrudeerde medium weg. Laad vervolgens en doseer 0,5 milliliter extra kweekmedium door het filter zoals net gedemonstreerd, waarbij u het medium van de tweede extrusie verzamelt. Zaai 150 microliter van het verzamelde medium in een 35 milliliter glazen bodemschaal en laat de blaasjes ongeveer 10 minuten bezinken.
Bevestig vervolgens de aanwezigheid van PMV's onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop uitgerust met een CCD-camera met behulp van een 20-voudige objectieflens. Om de mitochondriale omhulling en membraanpotentiaal in de PMV's te traceren, kleurt u een 90% confluente BMSC-kweek met een geschikte mitochondriale kleurstof of een mitochondriale membraanpotentiaal sonde respectievelijk in vers kweekmedium gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de cellen drie keer met 0,5 milliliter PBS per wasbeurt en oogst de cellen door trypsine-digestie voor PMV-generatie zoals net gedemonstreerd voor hun visualisatie door confocale microscopie.
Om de cytoplasmatische lokalisatie van de PMV-eiwitten te traceren, verdunt u eerst twee microgram supergewonden plasmide DNA voor een EGFP-expressiecassette en zes microliter cationische transfectie reagens in afzonderlijke 0,5 milliliter buisjes met 50 microliter serumvrij DMEM. Vortex de buisjes, gevolgd door een korte centrifugatie. Voeg vervolgens het transfectiereagens druppelsgewijs toe aan het buisje met de verdunde DNA-oplossing.
Vortex de DNA-transfectiemixtuur krachtig gedurende één minuut, gevolgd door een korte spin in een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Voer vervolgens een 30% confluente BMSC-kweek in een zes-putten plaat met twee milliliter vers kweekmedium en voeg het DNA-mengsel druppelsgewijs toe aan de cellen. 48 uur na hun transfectie, oogst u de BMSC door trypsine-digestie en bereid PMV's zoals net gedemonstreerd.
De PMV's kunnen vervolgens worden geanalyseerd door confocale microscopie met behulp van een 100-voudige olieobjectief. Voordat u de PMV's injecteert, labelt u een BMSC-kweek met een membraankleuringsfluorescente celtrackerkleurstof in één milliliter vers kweekmedium bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten en oogst de cellen door trypsine-digestie. Suspendeer de gelabelde cellen in 0,5 milliliter vers kweekmedium aangevuld met één microgram polyethyleendiamine en bereid PMV's zoals gedemonstreerd.
Concentreer vervolgens de PMV's door centrifugatie en suspendeer de pellet in 100 microliter vers kweekmedium met zacht schudden. Laad vervolgens de cellen in een één milliliter insulinesyringe uitgerust met een 30 gauge naald en desinfecteer de buitenkant van de gastrocnemius spier van een verdoofde BALB/c muis met 75% ethanol. Injecteer vervolgens langzaam het gehele volume van PMV's in de spier en laat het dier herstellen onder een warmtelamp.
Na 12 uur, strooi 75% ethanol over de spier, open de huid met een schaar en oogst de gehele gastrocnemius spier aan beide uiteinden. Spoel de spier met PBS en plaats deze onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik de 20-voudige objectieflens om de niet-fluorescerende spierweefselstukken met een scherpe scheermes te verwijderen en snijd de resterende sterk rood fluorescerende stukken in ongeveer negen kubieke millimeter blokjes.
Bevat elk blokje in een optimaal snijtemperatuurmedium. Dompel vervolgens de blokjes vijf minuten in vloeibare stikstof. En bewaar de weefselmonsters op min 20 graden Celsius tot hun analyse.
PMV's gegenereerd uit BMSC's zoals gedemonstreerd, vertonen overwegend een grootte in het bereik van ongeveer drie micrometer in diameter zoals onderzocht onder fasecontrastmicroscopie met behulp van de 20-voudige objectieflens. BMSC-transfectie met een fluorescente expressiecassette gedurende 48 uur illustreert de cytoplasmatische incapsulatie van het EGFP-eiwit door de PMV's. Verder, gekleurd met een fluorescente mitochondriale kleurstof, blijkt dat een groot deel van de PMV's mitochondriën bevat.
Het merendeel waarvan positief kleurt voor een mitochondriale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bereiden van plasmamembraanvesikels (PMV's) uit mesenchymale stamcellen uit het beenmerg (BMSC's). De techniek is bedoeld om cytoplasmaruplaattherapie te onderzoeken als een potentiële methode om ouderdomsgerelateerde fenotypes te verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ouderdomsonderzoek
Achtergrond
- Leeftijdsgebonden ziekten gaan vaak gepaard met defecten in cytoplasmatische componenten.
- Mesenchymale stamcellen uit het beenmerg zijn een veelbelovende bron voor cytoplasmatische vervanging.
- Plasmamembraanvesikels kunnen cytosol inkapselen voor therapeutische toepassingen.
- Het begrijpen van de effecten van jong cytoplasma op veroudering is cruciaal voor de ontwikkeling van therapieën.
Doel van de studie
- Om cytoplasma-vervangingstherapie toe te dienen aan de musculus gastrocnemius van muizen.
- Om te onderzoeken of de fusie van PMV's met verouderde cellen leeftijdgerelateerde fenotypes kan omkeren.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het genereren van PMV's uit BMSCs.
Gebruikte methoden
- Kweken van muis-BMSC's in volledig DMEM-kweekmedium.
- Loskoppelen van cellen met trypsin-EDTA na het bereiken van confluentie.
- Mechanische extrusie om PMV's te genereren die BMSC-cytosol inkapselen.
- Testen van de effectiviteit van PMV's bij het verminderen van ouderdomsgerelateerde effecten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van PMV's uit gekweekte BMSCs.
- Aangetoond potentieel van PMV's om jong cytoplasma af te leveren aan verouderde cellen.
- Initiële bevindingen suggereren dat PMV-behandeling leeftijdsgebonden fenotypes kan omkeren.
- Methodologie vastgesteld voor toekomstig onderzoek naar cytoplasma-vervangingstherapie.
Conclusies
- PMV's vertegenwoordigen een innovatieve benadering voor cytoplasma-vervangingstherapie.
- Deze techniek zou kunnen leiden tot doorbraken in de behandeling van ouderdomsziekten.
- Verdere studies zijn nodig om het therapeutische potentieel van PMV's te valideren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Cytoplasmvervangingstherapie met behulp van plasmamembraanvesikels (PMV's) van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg (BMSC's) biedt een mechanische benadering om ouderdomsgerelateerde cellulaire disfunctie aan te pakken door jonge cytoplasmatische componenten over te dragen. Deze strategie ondersteunt doelvalidatie in verouderingsonderzoek door functionele beoordeling van cytosolische verjonging in ziekterelateerde systemen mogelijk te maken. De methode biedt een preklinisch model voor het evalueren van cytoplasmatische vervanging als een potentiële interventie voor leeftijdsgebonden fenotypes.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de bijdragen van het cytosol aan verouderingsfenotypes te onderzoeken door middel van gecontroleerde toediening van jong cytoplasma.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem om het functionele herstel van de mitochondriale activiteit en de mitotische capaciteit te beoordelen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde PMV's met kwantificeerbare grootte en mitochondriale inkapseling voor consistente assay-inputs.
- Operationele waarde: Ondersteunt schaalbare productie van vesikelpreparaten via extrusie en centrifugatie voor downstream screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert cytoplasmatische afgifte aan spierweefsel, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking naar in vivo validatie.
- Operationele waarde: Vestigt een traceerbare PMV-preparatiemethode met behulp van membraankleuringen voor biodistributie- en opnamestudies.
Pipeline- & workflowintegratie
De PMV-preparatiemethode integreert in vroege ontdekkingsworkflows door een gestandaardiseerde vesiclebron te bieden voor studies naar cytoplasmatische vervanging, waardoor een brug wordt geslagen tussen doelvalidatie en preklinische evaluatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing over cytosolische verjonging door gecontroleerde fusie van jong cytoplasma met verouderde of zieke cellen mogelijk te maken.
- Screening: Levert uniforme PMV-preparaten die geschikt zijn voor high-content analyse van vesikelopname, vrachtlevering en functioneel herstel.
- Analyses: Maakt kwantitatieve beoordeling van het mitochondriale membraanpotentieel en de inkapseling van cytoplasmatische eiwitten mogelijk via fluorescentiemicroscopie.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door in vivo levering van gelabelde PMV's aan het spiercytoplasma aan te tonen.
- Herbruikbaarheid in de sector: Definieert een herbruikbaar platform voor vesikelproductie dat toepasbaar is op meerdere stamcelbronnen en ziektemodellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door cytoplasmatische variabelen in verouderingsfenotypes te isoleren.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde extrusieparameters en protocollen voor vesikelconcentratie.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door mechanistisch inzicht te verschaffen in de cytoplasmatische ausreichendheid voor fenotypische redding.
- Portfolio-impact: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van cytoplasma-gerichte therapieën mogelijk op basis van functionele validatie in ziekterelevante systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in primaire stamcelkweek, aseptische techniek en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot extrusieapparatuur met een gedefinieerde poriegrootte en centrifugeringsmogelijkheden voor de verwerking van blaasjes.
- Necessiteert standaardisatie van de celconfluentie, de timing van de trypsinisatie en de mediumcondities over productiebbatches heen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende celtypen en strategieën voor het laden van cargo buiten BMSCs en EGFP.
- Wordt beperkt door de heterogeniteit van de blaasjesgrootte en potentiële aggregatie tijdens concentratie, wat wordt beperkt door behandeling met polyethyleenamine.
