Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Het algemene doel van deze techniek is om cellen of cel-afgeleide producten met gemodificeerde sialic zuur expressie te genereren. Daarom worden cellen behandeld met N-acyl gemodificeerde Mannosamines die worden gemetaboliseerd tot de corresponderende sialic zuren en vervolgens op het celoppervlak worden geëxpresseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het Glycobiologie veld, zoals de invloed op glycoconjugaten op receptor-ligand interacties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk toe te passen is en puur cytotoxisch is. Om metabolische Glycoengineering te demonstreren, zullen we N-acetylmannosamine gebruiken, die commercieel verkrijgbaar is. Verder zullen we de synthese en het gebruik van N-propionyl en N-butanoylmannosamine demonstreren.

De biologische effecten van metabolische glycoengineering op de expressie van polysialic zuur worden getoond. Los eerst 431,2 milligram Mannosamine hydrochloride op in 10 milliliter van drie Millimolar Natrium methoxide oplossing in een 15 milliliter glazen fles met een roerbaar. Koel het mengsel op ijs tot nul graden Celsius.

Onder roeren, voeg langzaam 210 micrometer propionylchloride druppelsgewijs toe aan de oplossing. Incubeer vervolgens het roerende mengsel gedurende vier uur op nul graden Celsius. Breng de oplossing daarna over in een 50 milliliter plastic buis en prik vier tot 8 gaatjes in de dop van de buis met een dunne naald.

Bevriest de oplossing snel met vloeibaar stikstof. Lyofiliseer vervolgens het monster tot het volledig droog is. Na lyofilisatie, los het gedroogde product op in ethylacetaat, methanol en water.

Laad de oplossing met een pipet op een eerder bereide silica gel kolom. Verzamel na het elueren van 500 milliliter oplosmiddel vier milliliter fracties. Breng de eluerende fracties over in een 15 milliliter plastic buis en prik drie tot zes gaatjes in de dop van de buis met een dunne naald.

Na het bevriezen van de oplossing met vloeibaar stikstof, lyofiliseer het monster tot het volledig droog is. Kweek Kelly neuroblastoomcellen in RPMI medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voorafgaand aan het toepassen van de mannosamines, los de Kelly neuroblastoomcellen op door ze gedurende 10 minuten te incuberen met Trypsine en EDTA.

Na het neutraliseren van de trypsine met RPMI medium, tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer. Om sialic zuur monosacchariden te meten, zet de cellen in 500 microliter medium in een 48-wells weefselkweekplaat. Voor de analyse van polysialic zuren, zet de cellen in drie milliliter medium op een zes centimeter diameter celkweekschotel.

Voeg de respectieve mannosamine derivaten, opgelost in RPMI, toe aan de vers geplaatste cellen, in een eindconcentratie van vijf millimolar en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, waarbij het medium dat de N-acyl gemodificeerde Mannosamines bevat elke 24 uur wordt vervangen. Na de behandeling, decanteer het medium en was de cellen met PBS. Los de cellen op door ze gedurende 10 minuten te incuberen met Trypsine en EDTA.

Neutraliseer de trypsine door dezelfde hoeveelheid celkweekmedium toe te voegen aan de losgekoppelde cellen. Breng vervolgens de losgekoppelde cellen over in 15 milliliter plastic buizen. Centrifugeer de monsters gedurende drie minuten bij 500 keer G.Na het weggegooien van het supernatant, was de cellen drie keer met vijf milliliter PBS.

Na de centrifugatie, resuspendeer de verzamelde cel pellets in 500 microliter ijskoud HPLC lysis buffer. Ultrasoneer de monsters met een ultrasone processor naald driemaal gedurende een periode van 30 seconden bij medium-hoge amplitudes, waarbij de monsters gedurende ten minste een minuut op ijs worden gekoeld tussen de cycli. Na het centrifugeren van de gelyseerd celmonsters, scheid de supernatant van de membraanfracties in 1,5 milliliter plastic buizen.

Voor zure hydrolyse, voeg 150 microliter van een 1 molare TFA oplossing toe aan de gescheiden membraanfracties. Incubeer de monsters gedurende vier uur bij 80 graden Celsius met schudden bij 200 tot 600 RPM. Transport vervolgens de monsters naar 0,5 milliliter filterbuizen met drie kilodalton exclusiemembranen.

Centrifugeer de monsters gedurende ongeveer 30 minuten bij 20.000 keer G en 21 graden Celsius, tot het volume van de bovenste fase minder is dan 20 microliter. Gooi vervolgens de inserts weg en prik twee tot vier gaatjes in de doppen van de buizen die het ultrafiltraat bevatten met een dunne naald. Na het bevriezen van de monsters met vloeibaar stikstof, lyofiliseer ze een nacht lang.

Resuspendeer de gedroogde monsters in 10 microliter van 120 millimolar TFA oplossing en voeg 50 microliter DMB oplossing toe. Breng de monsters over in donkere 1,5 milliliter buizen om ze te beschermen tegen ultraviolet licht. Incubeer de celmembraan monsters en standaarden gedurende 1,5 uur bij 56 graden Celsius.

Na incubatie, voeg vier microliter van een 400 millimolar natriumhydroxide oplossing toe aan elk monster om de labelreactie te stoppen. Voor HPLC analyse, stel de temperatuur van de kolom in op 40 graden Celsius en configureer de fluorescentie detector naar 373 nanometer voor excitatie en 448 nanometer voor omissie. Injecteer 10 microliter monstervolume en scheid de sondes gedurende 15 minuten bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut met methanol, Acetonitril en water als het eluens.

Voor massaspectrometrie analyse, injecteer 20 microliter van elk verzamelde HPLC monster in een LC massa selectieve detector systeem. Selecteer in de evaluatiesoftware van het LC massa selectieve detector systeem de piek van belang in het totale ionenchromatogram. Bekijk het massaspectrum van de opgeloste piek en toon het positieve massa-tot-ladingsverhouding tussen 300 en 700.

Voeg een milliliter western blot lysis buffer toe aan de eerder bereide pellets van glyco-geengineerde cellen en vortex. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs, waarbij elke vijf minuten wordt gevortext. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 1,5 uur bij 20.000 keer G en vier graden Celsius.