Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit Rhipicephalus microplus Epitheliale darmcellen
23 juli 2017
Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.
Zuivering van biotinyleren celoppervlak-eiwit uit Rhipicephalus microplus epitheelcellen van darmweefsel. Binnen deze studie werd een gewijzigde Percoll-gradiënt-gebaseerde methodologie gebruikt om individuele epitheelcellen te isoleren uit Rhipicephalus microplus darmweefsel. Aan het oppervlak gebonden eiwitten werden gebiotinyleerd en gezuiverd via streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.
Dissectie van het darmepitheel van half-volgezogen Rhipicephalus microplus. U zult de volgende materialen nodig hebben. Plak een strook plakband op de bodem van een petrischaal.
Voeg een druppel Superlijm toe aan het plakband. Plaats de teek met de buikzijde naar beneden op de Superlijm en laat het drogen. Dompel de teek volledig onder in 100 ml PBS.
Gebruik een mesje maat 11 om vanaf de bovenkant van de ogen tot aan de onderkant van de festoenen aan beide zijden van de teek te snijden. Gebruik steriele pincetten om het scutum en alloscutum volledig te verwijderen om de inwendige organen bloot te leggen. Verwijder de fijne witte draadachtige organen en andere membranen.
Verwijder de darm met behulp van pincetten. Bewaar de darm in ijskoud HBSS en PIC. Dissociatie van epitheelcellen.
U zult de volgende materialen nodig hebben. Giet het gedissekteerde darm op een 70 micron celzeef in een 50 ml Falcon-buis. Omdat zich een vacuüm kan vormen in de Falcon-buis, til de filter op om luchtcirculatie mogelijk te maken.
Spuit het darmweefsel door met 50 ml ijskoud HBSS met PIC. Resuspendeer de darmen in 30 ml ijskoud HBSS met PIC. Gebruik indien nodig een steriele schraper om de darmresuspendering te ondersteunen.
Centrifugeer bij 500 g. Verwijder de supernatant en herhaal het wasproces drie keer. Resuspendeer de darmcellen in 10 ml DMEM, 2%FCS, 5 millimolar EDTA, één millimolar TCEP en PIC.
Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius onder langzame rotatie met behulp van een roller. Filter de suspensie door een 250 micron celzeef.
Vortex de doorstroming. En filter door een 70 micron celzeef, verzamel de resterende doorstroming. Centrifugeer de suspensie.
Isolatie van enkele epitheelcellen met behulp van een Percoll-gradiënt. U zult de volgende materialen nodig hebben. Bereid door filteren via AP15 voorfilterpapier 40% en 20% Percoll in Milli-Q water.
Laad een steriele spuit met de Percoll-oplossing. Breng deze aan op het filterapparaat en laat de Percoll langzaam uitstromen. Koel gedurende een uur op vier graden Celsius voordat u de gradiënt gaat lagen.
Stel de peristaltiekpomp in zoals weergegeven. Gebruik een peristaltiekpomp ingesteld op de laagste snelheid om drie ml van 40% Percoll in een 16 ml ultracentrifugebuis te lagen. Laat het 15 minuten op ijs bezinken.
De snelheid van de pomp moet leiden tot een stromingssnelheid van minder dan één ml per minuut. Kantel de buis in een hoek van 45 graden en gebruik de peristaltiekpomp om de 20% Percoll op de 40%-laag te lagen. Zorg ervoor dat de uitloopbuis tegen de centrifugeerbuis rust om te voorkomen dat druppels zich mengen met lagere lagen.
De snelheid van de pomp moet leiden tot een stromingssnelheid van minder dan één ml per minuut. Laat de lagen 15 minuten op ijs bezinken. Gebruik de peristaltiekpomp bij een stromingssnelheid van minder dan één ml per minuut om drie ml DMEM-oplossing met de geïsoleerde epitheelcellen over de 20 tot 40% Percoll-gradiënt te lagen.
Zorg ervoor dat de uitloopbuis tegen de centrifugeerbuis rust om te voorkomen dat druppels zich mengen met de lagere lagen en de gradiënt verstoren. Centrifugeer bij 600 g gedurende 10 minuten. Verzamel interfasen tussen de DMEM, 20% Percoll-gradiënt en de 20%40% Percoll-gradiënten om enkele epitheelcellen te isoleren.
Biotinylering van celoppervlak-eiwit en de isolatie van gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten. U zult de volgende materialen nodig hebben. Biotinyleer 100 microliters van enkele-cel epitheelcellen met behulp van Biotin Type A Conjugation Kit volgens de instructies van de fabrikant.
Voeg 100 microliters PBS, 1%Triton X-100, 10%glycerol, 100 micromolar geoxideerd glutathion en PIC toe aan de gebiotinyleerde cellen. Incubeer gedurende een uur op ijs met voorzichtig mengen om de 10 minuten. Centrifugeer de cellysaat bij 20.000 g bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten en zet opzij.
Bereid 50 microliters streptavidine magnetische kralen voor door te wassen met 1.000 microliters TBS 1%Tween-20. Meng voorzichtig door te schudden met uw vinger. Plaats de buis in een magnetische stand, verzamel de kralen tegen de zijkant van de buis.
Verwijder en gooi het supernatant weg. Combineer 300 microliters biotinyleren celoppervlak-eiwitten met gewassen magnetische kralen. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met agitatie.
Verzamel de kralen met de magnetische stand, verwijder en gooi het supernatant weg. Voeg 300 microliters TBS 1%Tween-20 toe aan de buis, meng voorzichtig om de kralen te resuspenderen. Verzamel de kralen, verwijder en gooi het supernatant weg.
Herhaal deze wasstap twee keer. Voeg 100 microliters van de 1 molare glycine pH twee toe aan de magnetische kralen. En incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Verzamel de kralen en verwijder het supernatant dat de eluteerde gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten bevat. Figuur een is een weergave van het protocol dat wordt gebruikt om epitheelcellen en hun oppervlakte-eiwitten te isoleren uit een gehele teek. Met behulp van dit protocol kunnen ongeveer 1,2 bij 10 tot de zeven cellen per ml met 75 tot 80% levensvatbaarheid en 20 tot
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een aangepaste methodologie voor het isoleren van epitheelcellen uit het darmweefsel van Rhipicephalus microplus. De oppervlakte-eiwitten van de geïsoleerde cellen werden gebiotinyleerd en gezuiverd met behulp van streptavidine-magnetische kralen voor verdere toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Entomologie
Achtergrond
- Rhipicephalus microplus is een belangrijke landbougplaag.
- Inzicht in de epitheelcellen van de darmen kan inzicht bieden in de biologie ervan.
- De isolatie van specifieke eiwitten is cruciaal voor het bestuderen van cellulaire functies.
- Biotinylering maakt gerichte zuivering van eiwitten mogelijk.
Doel van de studie
- Om epitheelcellen te isoleren uit darmweefsel van Rhipicephalus microplus.
- Om oppervlakte-eiwitten te biotinyleren en te zuiveren voor downstream applicaties.
- Om methodologieën voor het bestuderen van tekenbiologie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gemodificeerde Percoll-gradiëntmethodiek voor celisolatie.
- Biotinylering van oppervlaktegebonden eiwitten.
- Zuivering met behulp van streptavidine-magnetische kralen.
- Dissectie van het darmepitheel uit semi-verzadigde teken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van epitheelcellen uit darmweefsel.
- Effectieve biotinylering van oppervlakte-eiwitten.
- Zuivering gerealiseerd met behulp van magnetische bead-technieken.
- Methodologie toonde potentieel voor verdere biologische studies.
Conclusies
- De aangepaste methodologie is effectief voor het isoleren van darmepitheelcellen.
- Biotinylerings- en zuiveringstechnieken zijn betrouwbaar voor proteïnestudies.
- Deze aanpak kan toekomstig onderzoek naar de biologie van teken faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze methode maakt de isolatie van levensvatbare epitheelcellen en hun oppervlakte-eiwitten uit darmweefsel van teken mogelijk, waardoor een gedefinieerd biologisch systeem ontstaat voor target-discovery in onderzoek naar door vectoren overdraagbare ziekten. Door gezuiverde gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten op te leveren, ondersteunt het downstream-applicaties zoals FACS of LC-MS/MS voor antigeenidentificatie en screening van vaccinkandidaten. Deze aanpak pakt een belangrijk knelpunt aan bij het bestuderen van interacties tussen teek en gastheer en biedt een schaalbare workflow voor het verminderen van risico's bij target-validatie in pipelines voor antiparasitaire middelen en vaccinontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het isoleren van natuurlijke darmepitheelcellen die oppervlakte-eiwitten zoals BM86 tot expressie brengen voor functionele validatie.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor celpreparatie die de biologische variabiliteit in studies naar target-interactie vermindert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door het genereren van kwantitatieve opbrengsten van oppervlakte-eiwitten om de abundantie en druggability van targets te beoordelen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten die geschikt zijn voor immobilisatie in bindingsassays om te screenen op inhiberende verbindingen of antilichamen.
- Operationele waarde: Standaardiseert het inputmateriaal via gedefinieerde stappen voor celisolatie en eiwitzuivering, wat de reproduceerbaarheid van de assay verbetert.
- Schaalbaarheid: Maakt de verwerking van meerdere teken-dissecties mogelijk om voldoende eiwit te genereren voor high-throughput screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door inheemse membraaneiwitcomplexen van het darmepitheel van de teek te preserveren, een cruciale locatie voor pathogeentransmissie en vaccinuitslag.
- Operationele waarde: Faciliteert de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van consistente antigeenpreparaten voor immunogeniciteits- en effectiviteitstesten.
- Risicobeperking: Vermindert mechanische ambiguïteit bij targetvalidatie door de oppervlaktelokalisatie en toegankelijkheid van kandidaat-antigenen te bevestigen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van de ontdekkingfase en ondersteunt de targetidentificatie door de isolatie van natuurlijke celoppervlakte-eiwitten, wat kan bijdragen aan de leadidentificatie via bindings- of functionele assays, en preklinische beslissingen kan informeren door gevalideerde antigenen te leveren voor immunogeniciteitsstudies.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van eiwitten in de teken Darm mogelijk door levensvatbare epitheelcellen te isoleren die hun natuurlijke oppervlakte-expressieprofielen behouden.
- Screening: Levert gezuiverde gebiotinyleerde oppervlakte-eiwitten die kwantificeerbaar zijn via LC-MS/MS, wat kwantitatieve resultaten ondersteunt voor bindingassays van verbindingen of antilichamen.
- Analytics: Genereert meetbare output, waaronder celopbrengst (~1.2×10⁷ cells/mL), levensvatbaarheid (75–80%) en eiwithoeveelheid (20–24 µg per 50 teken), wat procesbeheersing en vergelijking tussen condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door gezuiverde antigenen te leveren die de natuurlijke target-conformatie weerspiegelen die aanwezig is op het darmepitheel van de teek.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd platform voor de isolatie van teken darmepitheelcellen dat toepasbaar is op meerdere tekensoorten van economisch belang, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door toegang te bieden tot native, oppervlakte-geëxposeerde eiwitten in een fysiologisch relevante context.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor dissociatie, gradiëntscheiding en biotinylering, waardoor variabiliteit tussen batches wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door een vroege beoordeling van de toegankelijkheid van het target en de expressieniveaus mogelijk te maken, wat investeringen in slecht gevalideerde kandidaten vermindert.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kwantificeerbare gegevens over eiwitopbrengst en -zuiverheid, wat de toewijzing van middelen naar targets met een hoog betrouwbaarheidsniveau informeert.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in teekdissectie, celisolatietechnieken en gradiëntcentrifugatie om de celviabiliteit en proteïne-integriteit te behouden.
- Is afhankelijk van toegang tot Percoll-gradiënten, magnetische separatieapparatuur en biotinyleringskits voor een consistente proteïnewerking.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de darmdissectie- en wasprotocollen om contaminatie met gastheerproteïnen te minimaliseren en de helderheid van de gradiënt te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij toepassing op andere teeksoorten, inclusief de optimalisatie van dissociatie-enzymen en gradiëntdichtheden op basis van de darmmorfologie.
- Houdt rekening met praktische beperkingen zoals proteïneverlies tijdens extractie en de noodzaak van protease-remmers om degradatie van oppervlakteproteïnen tijdens de verwerking te voorkomen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Title
0:28
Dissection of the Gut Epithelium from R. microplus
1:56
Epithelial Cell Dissociation
3:36
Isolation of Single Epithelial Cells Using a Percoll Gradient
6:47
Cell Surface Biotinylation and the Isolation of Biotinylated Surface Proteins
9:44
Representative Results
11:17
Conclusion
