Opsporen van oestrogene liganden in verzorgingsproducten met behulp van een gist oestrogeen scherm geoptimaliseerd voor het Undergraduate Onderwijs laboratorium

Het algemene doel van deze procedure is om een gist-oestrogenscreening te gebruiken om menselijke oestrogenereceptor-agonisten te kwantificeren die zijn geëxtraheerd uit persoonlijke verzorgingsproducten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van toxicologie, endocriene disruptie en ecofysiologie, omdat het milieu-oestrogenen in water, voedingsmiddelen en persoonlijke verzorgingsproducten detecteert en kwantificeert. De belangrijkste voordelen van deze in vitro-techniek zijn dat deze goedkoop en veelgebruikt is, en een uitstekend platform biedt voor het onderwijzen van technische laboratoriumvaardigheden.

De detectie van milieu-estrogenen is cruciaal omdat zij de hormonale signalering kunnen beïnvloeden, met name tijdens de foetale ontwikkeling en perioden van fysiologische transitie zoals de puberteit. De meest uitdagende onderdelen van deze methode zijn de berekeningen en de data-analyse, die wij hebben vereenvoudigd door een gebruiksvriendelijke applicatie te ontwikkelen. Daarnaast is nauwkeurig pipetteren essentieel.

Dit protocol begint met het bereiden van reagentia. Bereid glucose- en galactosemedia, vehikelcontroles van 50% ethanol en estradiolstandaarden die op de eerste dag van de assay worden gebruikt, alsook LacZ-buffer, dithiothreïtol en natriumcarbonaat voor de tweede dag. Steriliseer de glucose- en galactosemedia door filtratie via een 0,2 micrometer filter.

Tot 23 verschillende persoonlijke verzorgingsproducten (PCP's) en extractiecontroles kunnen in triplikaat worden getest op één enkele 96-well plaat. PCP's omvatten zeep, haarcrème, shampoo, zonnebrandcrème, make-up, scheerschuim en lotion. Voor de behoeften van de opname zullen monsters van slechts acht PCP's worden voorbereid.

Combineer één gram van elk monster met 10 milliliter watervrij ethanol in een 15-milliliter conische buis. Bereid daarnaast een negatieve extractiecontrole voor, bestaande uit 11 milliliter watervrij ethanol in een 15-milliliter conische buis. Homogeniseer de inhoud van elke conische buis gedurende 30 minuten door middel van een combinatie van handmatig schudden en vortexen.

Centrifugeer de conische buizen 10 minuten lang op de maximaal toegestane snelheid in een mandcentrifuge. Giet het supernatant van elke buis door een 40-micrometer celzeef in een conische buis van 50 milliliter. Breng vervolgens de inhoud van elke buis van 50 milliliter over in een glazen scintillatiefles.

Laat de ethanol volledig verdampen door de vials een week open te laten staan in een geventileerde zuurkast. Bescherm de drogende monsters tegen licht om degradatie van lichtgevoelige bestanddelen te voorkomen. Wanneer de monsters droog zijn, reconstitueert u elk monster in één milliliter 50% ethanol en vortexest u vervolgens om te homogeniseren.

Twee nachten of ongeveer 42 uur voordat de gist-oestrogenscreening of YES-platen worden voorbereid, wordt de gist met steriele techniek gesubcultured door 0,1 milliliters van elke actieve gistcultuur toe te voegen aan 10 milliliters filtergesteriliseerde glucosemedium in een steriele Erlenmeyerkolf. Incubeer bij 30 degrees Celsius en incubeer de oorspronkelijke culturen verder als stocks. Twee dagen later, op dag één van de YES-assay, worden de gesuspendeerde gistculturen en het filtergesteriliseerde galactosemedium met steriele techniek verdund in een steriel bekerglas.

Bevestig de optische dichtheid door 120 µL van elk gistmonster in triplicaat, samen met triplicaat blanco's van het galactosemedium, in een transparante polystyreenplaat te pipetteren. Gebruik een platen-spectrofotometer om te verifiëren dat de verdunde gistcultuur een netto optische dichtheid heeft van 0,065 ± 0,005 bij een golflengte van 610 nm. Bepaal de netto OD610 van de gist door de OD610 van de blanco's van het galactosemedium af te trekken.

Voeg met een repeteerpipetteur en een steriele spuittip de verdunde gist-suspensie toe aan de putjes van een steriele polypropyleen 96-well microplate volgens deze plaatindeling. Houd de bron-gist tijdens het pipetteren in suspensie door het bekerglas continu te zwenken of door met de pipette te mengen. Voeg tot slot 120 µL filtergesteriliseerd galactose-medium toe aan de putjes H10 tot en met H12, in het groen aangegeven in de plaatindeling, om te dienen als mediumcontroles waarmee rekening wordt gehouden met de absorptie die uitsluitend door het medium wordt veroorzaakt.

Bereid afzonderlijke platen voor voor elke combinatie van giststam en calorimetrisch substraat die zal worden getest. Maak vervolgens in elke plaat een standaardcurve door seriële verdunning volgens de plaatindeling. Gebruik een enkelkanaalpipetteur met steriele tips om 5 µL estradiolstandaard toe te voegen aan wells A2, A2 en A3. Gebruik een multikaanaalpipetteur om de inhoud van de wells door pipetteren te mengen en breng vervolgens 205 µL van wells A1 tot A3 over naar wells B1 tot B3. Herhaal de overdracht van 205 µL tot en met rij G. Verwijder na voltooiing van de seriële verdunning 205 µL uit wells G1 tot G3. Aan het einde van deze stap moeten alle standaardwells 120 µL bevatten.

Voeg vijf microliters 50% ethanol toe aan elke vehicle control-put met de gist-suspensie, putten H1, H2 en H3, die blauw zijn aangegeven in dit plaatoverzicht. De volgende stap is het toevoegen van triplicaten van vijf microliters van de monsters of negatieve extractiecontroles aan de putten met de gist-suspensie, aangegeven in paars in het plaatoverzicht. Noteer welke monsters of extractiecontroles in welke putten zijn geplaatst.

Om bij te houden welke putjes monsters bevatten en welke niet, begint u met een nieuwe doos pipetpuntjes en gebruikt u puntjes van dezelfde posities in de doos als de posities van de overeenkomstige putjes in de plaat. Meng de inhoud van de putjes met het monster, de extractiecontrole en de vehikelcontrole door te pipetteren. Stel de volumes van deze putjes in op 120 µL door 205 µL uit elk putje te verwijderen.

Verzegel elke plaat met een steriele, adhesieve poreuze folie, label deze en incubeer ze gedurende 17 uur bij 30 °C. Haal de platen na de incubatie van 17 uur uit de incubator. Indien de platen niet onmiddellijk verwerkt kunnen worden, wikkel ze dan in vershoudfolie en bewaar de gewikkelde platen zes dagen lang bij 4 °C in de koelkast.

Wanneer de platen klaar zijn voor verwerking, kunnen ze worden uitgepakt. Gebruik een multichannel pipette om de inhoud van elke rij wells te mengen en breng vervolgens 50 µL gist-suspensie van elke well over naar de overeenkomstige well van een transparante polystyreen 96-wells microplate. Label de nieuwe plaat.

Om kruiscontaminatie tussen de wells te voorkomen, dient u voor elke well nieuwe pipetpunten te gebruiken; deze punten hoeven niet steriel te zijn. Voeg in een zuurkast 20 µL 1 M DTT toe aan 20 mL ontdooide LacZ-buffer op kamertemperatuur voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM DTT. Meng de LacZ-buffer grondig.

Voeg met een repeterende pipet 200 µL LacZ-buffer met DTT en ofwel ONPG of CPRG toe aan alle putjes van de polystyreenplaat, en meet en noteer onmiddellijk de optische dichtheid bij 610 nm van alle putjes met behulp van een platenlezer. Herhaal dit indien nodig voor aanvullende platen. Dek de platen af met een deksel en incubeer ze bij 30 °C gedurende de aangegeven tijden.

Wanneer de incubatie is voltooid, worden de platen uit de incubator gehaald. Gebruik een repeater-pipette om 100 µL natriumcarbonaat aan elke put toe te voegen om de bèta-galactosidase-reactie te stoppen. Meet en noteer de optische dichtheid van alle putten bij 405 nm voor ONPG of 574 nm voor CPRG met behulp van een platen-spectrofotometer.

Een berekening van LacZ-waarden kan worden uitgevoerd met een geautomatiseerde applicatie waarvoor Java geïnstalleerd moet zijn. Open ter begin de geautomatiseerde LacZ-applicatie zoals beschreven in bijlage één. Plak de optische dichtheidsmetingen bij 405 nanometer voor ONPG of 574 nanometer voor CPRG van alle wells in, gebruikmakend van een plaatindeling die identiek is aan die in figuur één.

Voer de incubatietijd in uren in die nodig is voor de assay om kleur te produceren en klik op Volgende. Plak de optische dichtheidsmetingen bij 610 nanometer voor alle wells. Klik op Verzenden om de LacZ-resultaten weer te geven.

LacZ-resultaten kunnen via toetsenbordcommando's worden gekopieerd en naar een spreadsheet of andere bestanden worden geplakt indien nodig. Begin deze analyse door de online YES-assay data-analyseapplicatie te openen. Upload een CSV-databestand dat is opgemaakt zoals beschreven op het eerste tabblad.

Digitaliseer de estradiol-standaardcurve op het tweede tabblad en schat de regressieparameters. Bekijk de resultaten van het regressiemodel op het derde tabblad en zoek vervolgens de geïnterpoleerde x-aswaarden die overeenkomen met de LacZ-waarden van de monsters op het vierde tabblad. Klik op het vijfde tabblad om de oestrogeen-equivalenten of EEQ-waarden van de monsters te bekijken.

Standaardiseer tot slot de EEQ-waarden naar de oorspronkelijke monstermassa, zoals beschreven in het tekstprotocol. Er worden voorbeelden getoond van standaardcurves na een incubatie van 17 uur van gist met 17 beta-estradiol. Om redenen die in het manuscript worden besproken, is CPRG vaak een betere keuze voor het substraat dan ONPG.

In overeenstemming met eerdere waarnemingen waren assays met gist die ER Beta tot expressie bracht meer dan een orde van grootte gevoeliger dan assays met gist die ER Alpha tot expressie bracht. Daarom werd oestrogene activiteit vaker gedetecteerd met gist die ER Beta tot expressie bracht. Een aanvullend doel van de studie was om incubatieduren te testen die compatibel zijn met het schema van een laboratoriumcursus voor bachelorstudenten.

Wanneer een koelperiode van zes dagen na de incubatie van 17 uur werd geïntroduceerd, waren de standaardcurven van gekoelde platen vergelijkbaar met die van niet-gekoelde platen. De standaardfouten van de parameters die waren geschat met vierparameter logistieke regressiemodellen waren voor gekoelde platen allemaal kleiner dan voor niet-gekoelde platen. Koeling van de platen gedurende zes dagen vermindert dus de fout en verbetert de nauwkeurigheid van de EEQ-schattingen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee sessies van drie tot vier uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om een steriele techniek toe te passen voor alle stappen vóór de incubatieperiode van 17 uur, zorgvuldig en nauwkeurig te pipetteren en de plaatindeling in figuur 1 te volgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals in-vivo dierproeven, worden uitgevoerd om aanvullende mechanismen van oestrogene werking en effecten op het gehele organisme te onderzoeken.

Na de ontwikkeling werd de gist-oestrogenscreen geaccepteerd als een kosteneffectieve methode om oestrogene liganden te meten in milieumonsters, zoals voedingsmiddelen, plantenweefsels en persoonlijke verzorgingsproducten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u eenvoudige extracties van persoonlijke verzorgingsproducten uitvoert, gist kweekt, standaard verdunningscurves voorbereidt, de YES-assay uitvoert in een 96-wells plaat en de bijbehorende berekeningen voltooit. En vergeet niet dat werken met estradiol extreem gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen, alsmede het waarborgen van een juiste afvoer.