Name: Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren. Deze methode maakt real-time karakterisatie van ECS-parameters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door NIH NINDS subsidie ​​R01 NS047557.

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

<img alt="Figuur 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figuur 10: Niet-ideale gegevens die gemeenschappelijke technische problemen tonen. (A) Schema van gemeenschappelijke technische problemen met iontoforese micro-elektroden: Vergelijking van de normale release van TMA uit een functionerende iontoforese micro-elektrode met drie bronnen demonstreren technische problemen. [Hoge vergroting, a1] De stroom in een ideale iontoforetische bron wordt gelijk ve...

<html> De extracellulaire ruimte (ECS) is het netwerk van door elkaar verbonden kanalen buiten alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix ( Figuur 1a en Figuur 1b ). De verspreiding van veel stoffen die nodig zijn voor de hersencelfunctie, met inbegrip van voedingsstoffen, hormonen en neurotransmitters, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in de fysieke parameters van deze ruimte, met inbegrip van volume, geometrie en extracellulaire matrix, kunnen de diffusie drastisch beïnvloeden door de ECS en de lokale ionconcentraties baden van de hersenen, die een belangrijke invloed hebben op de celfunctie van de hersenencel 1 , 2 . Real-time iontoforese (RTI) wordt gebruikt om twee structurele kenmerken van een hersengebied te bepalen: volume fractie en tortuositeit 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. Volumefractie ( a ) is het aandeel van weefselvolume dat door de ECS ( V ECS ) wordt bezet ten opzichte van het totale weefselvolume ( V weefsel ) in een representatief elementair volume; <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> Tortuosity ( λ ) is de relatieve belemmering die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersengebied in vergelijking met een medium zonder obstructies; <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Waar D * (cm 2 s -1 ) de effectieve diffusiecoëfficiënt van de stof in de hersenen en D (cm 2 s -1 ) is, is de vrije diffusiecoëfficiënt van de stof in een vrij medium, zoals verdunde agarosegel. Vandaag de meest gebruikte sonde stof voor de RTI methode is het kleine kationtetramethylammonium (TMA). TMA heeft een molecuulgewicht van 74 g / mol, dissocieert volledig in oplossing en heeft één positieve lading. RTI studies met dit ion hebben aangetoond dat α <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 en λ <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1,6 1 , 2 . Dit betekent dat de ECS ongeveer 20% van het totale hersenvolume bedraagt ​​en dat de diffusie van een klein inert molecuul ongeveer 2,5 keer langzamer voorkomt in de ECS dan in een medium zonder obstakels 3 . Beide α en λ variëren echter met de leeftijd van de hersenen, regio en staat en in pathologische omstandigheden 1 . Wijzigingen van deze parameters zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van de hersenen, veroudering, slaap, epilepsie en vele andere fundamentele processen en hersenziekten 1, 6 . Terwijl andere technieken a en λ meeten, kan RTI zowel in gelokaliseerde gebieden van levend weefsel in realtime meten. Om deze reden is RTI een onontbeerlijk instrument geworden voor het onderzoeken van veranderingen in a en λ tijdens acute en omkeerbare uitdagingen. De theorie ter ondersteuning van RTI werd oorspronkelijk gevalideerd door Nicholson en Phillips, en de techniek is sinds die tijd zeer uitgebreid gebruikt 4 , 7 . Experimenten die RTI gebruiken, beginnen met het vrijkomen van een puls van TMA van een bron-micro-elektrode door iontoforese in een verdunde agarosegel. Eens uitgeworpen diffundeerden de ionen vrij van de puntbron, waarbij ze kiezen uit een potentieel oneindig aantal willekeurige wegen ( Figuur 1d ). De veranderende concentratie van het ionen wordt mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode (ISM) die ruwweg is gepositioneerd100 μm weg ( figuur 1c ). De veranderingen in TMA-concentratie worden getekend en op een curve aangebracht die de berekening van zowel D als het transportnummer van de iontoforese micro-elektrode mogelijk maakt (parameters beschreven in het protocol). Met deze waarden wordt de procedure herhaald in een hersengebied van belang om D * te verkrijgen en zowel α als λ te berekenen. Beheersing van de iontoforese micro-elektrode, dataverzameling, grafieken en montage van de TMA-concentratiecurve en berekening van de experimentele parameters worden doorgaans uitgevoerd door de programma&#39;s Wanda en Walter, die speciaal hiervoor zijn ontworpen (de software en hun handleidingen zijn Vrij verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag). Het protocol gedeelte van deze review beschrijft de basisprocedures die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren van RTI in knaagdierbreinzen. De techniek is ook gebruikt in niet-staafEnt modellen, waaronder menselijke hersenen plakjes en in vivo hersenpreparaten 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Het gedeelte Representatieve resultaten biedt zowel ideale als niet-ideale resultaten om nuances in data-interpretatie te markeren. Tenslotte behandelt de discussie sectie probleemoplossingstechnieken, beperkingen van RTI, alternatieve technieken die gebruikt worden om de ECS te bestuderen en toekomstige toepassingen van RTI. <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figuur 1: Diagrammen van diffusie via ECS. (A) Schema van ECS: Toont de grootte en locatie van het ECS in een typische hersenpreparaat. Geel markeert de ECS tussen de grijze hersencel processen. Het volume van de ECS bedraagt ​​ongeveer 20% van het totale weefsel volume ( dwz volume fractie = 0.2) onder fysiologische omstandigheden. ( B ) vergroot diagram van de ECS: benadrukt fysieke parameters die bijdragen aan tortuositeit, inclusief hersencel geometrie (grijs) en extracellulaire matrix (aangetoond als een netwerk van veelkleurige glycosaminoglycanen en proteoglycanen). ( C ) 3D-diagram van diffusie van een puntbron: Demonstreert de netto beweging van inerte moleculen van een iontoforetische bron naar een ISM. Met uitzondering van diffusiebarrières en cellulaire opname diffundeerden de moleculen in alle richtingen naar buiten, waardoor er een bolvormige concentratievoorzijde ontstaat. Het ISM kwantificeert de lokale concentratie van de inerte moleculen die vrijkomen van de iontoforetische bron. ( D ) Computer simulatie van diffusie in ECS van de hersenen: [Verre links] Instelling voor Monte Carlo simulatie; Groene bollen vertegenwoordigen hersencelprocessen en het rode kruis vertegenwoordigt een puntbron. Deze opstelling modelleren het hersenweefsel diagramma in figuur 1a . [Middenbeelden] 3 en6 moleculen die willekeurige bewegingen verrichten als ze diffunderen door de extracellulaire ruimte van de hersenen, weergegeven in 2 dimensies. [Verre rechts] Willekeurige wandelingen van veel moleculen die uit de puntbron worden vrijgegeven. De netto beweging van alle moleculen uit de puntbron is naar buiten, zoals afgebeeld in figuur 1c . De cumulatieve willekeurige wandelingen schetsen de ruimten tussen de cellen ( dwz de ECS, zie referentie 5 voor verdere uitleg). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>A/D- en D/A-converter</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>De NI USB-6221 wordt nog steeds verkocht als een 'Legacy'-apparaat door NI. Ze bevelen NI USB-6341 X Series DAQs aan voor nieuwe installaties, maar we hebben de nieuwere eenheden niet getest. We beschrijven het gebruik van de NI USB-6221 met MATLAB en Windows 7 (32-bits). Alternatieven: de veel oudere PCI-MIO-16E-4 A/D-converter (alleen gebruikt onder Windows XP of ouder OS) met BNC-2090 BNC-connectorpaneel en SH68-68-EP-kabel. Zoals vermeld in de Wanda-handleiding, is er een experimenteel MATLAB-programma beschikbaar om Axon Binary Files te gebruiken.</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarose #50081</td><td>om verdunde agarosegel voor RTI-metingen voor te bereiden</td></tr><tr><td>versterker voor ISM</td><td>Dagan</td><td>Model IX2-700 Dual Intracellulaire Voorversterker</td><td>ionen- en referentiespanningsversterker met N=0,1 (voor referentievat) en N=0,001 (voor ionenvat) headstages</td></tr><tr><td>biologisch samenstelling microscoop (met 4x en 10x objectief)</td><td></td><td></td><td>voor het chippen van de micro-elektrodenpunten en het inspecteren van micro-elektroden; verschillende leveranciers, bijv. AmScope</td></tr><tr><td>borosilicaat theta capillair glasbuis</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811</td><td>dubbelbuisglas voor ionen-selectieve micro-elektroden en iontoforetische micro-elektroden; O.D. 2,0 mm, I.D. 1,4 mm, septum 0,2 mm, lengte 10 cm</td></tr><tr><td>kwast</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>University Series 233, maat 0</td><td>ronde korte handgreepkwast, verkrijgbaar bij Amazon</td></tr><tr><td>bunsenbrander</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera voor het visualiseren van micropipetten</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>vereist monitor, IR-filter op substage verlichting is optioneel</td></tr><tr><td>chart recorder</td><td></td><td></td><td>om continue spanningen op ionen-selectieve micro-elektrode tijdens kalibratie in tetramethylammonium-standaarden en tijdens RTI-experiment te registreren; bijv. Kipp &amp; Zonen type BD112 dual-cannel chart recorder, verkrijgbaar gereviseerde</td></tr><tr><td>chlorotrimethylsilaan, puriss., > 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>catalogus # 92360</td><td>voor silanisering; VOORZICHTIG: ontvlambaar, acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing), huidcorrosion, oogschade, reageert heftig met water, zie Sigma-Aldrich Veiligheidsinformatie voor volledige beschrijving</td></tr><tr><td>Commerciële Software</td><td>The MathWorks</td><td>MATLAB, Data acquisitie toolkit</td><td>voor data acquisitie en analyse met behulp van Wanda en Walter programma's. Merk op dat een academische licentie beschikbaar is.</td></tr><tr><td>oogbeschermende bril</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaste draaistelling compound microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>kan andere compound microscopen met vaste draaistellingen gebruiken</td></tr><tr><td>pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11251-10</td><td>om glas capillair te chippen; Dumond #5, bij voorkeur gebruikt en niet langer nodig voor fijn werk</td></tr><tr><td>afzuigkap</td><td></td><td></td><td>voor silanisering en het vullen van de punt van ionen-selectieve vat met vloeibare ionenwisselaar; verschillende leveranciers, bijv. Captair met geschikte filter verkocht door Erlab</td></tr><tr><td>glas microscoopglas</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td><td>om micro-elektrode punten te chippen</td></tr><tr><td>verwarming/roerder</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>om verdunde agarosegel te bereiden en oplossingen te roeren</td></tr><tr><td>iontoforetische unit</td><td>Dagan</td><td>ION-100 en PS-100</td><td>ION-100 is een enkelkanaals iontoforetische eenheid +/- 130 V compliance; PS-100 is een externe voeding; alternatieven: bijv. Axoprobe-1A gemaakt door Axon Instruments (nu Molecular Devices), niet meer in productie, controleer beschikbaarheid van gereviseerde eenheden (eBay en andere sites)</td></tr><tr><td>vloeibare ionenwisselaar (LIX) voor tetramethylammonium</td><td>World Precision Instruments</td><td>IE190 Kalium Ionenwisselaar</td><td>Opmerking: dit is gelijkwaardig aan de originele Corning-kaliumwisselaar 477317 op basis van tetrafenylboraat - niet verwarren met neutrale drager kaliumwisselaar afkomstig van het laboratorium van Dr. Simon, ETH, Zürich, die geen tetramethylammonium detecteert, en wordt verkocht door Fluka. U kunt ook zelf vloeibare ionenwisselaar voor tetramethylammonium maken: 3% per gewicht kalium tetrakis = (p-chloorfenyl)boraat opgelost in 2,3-dimethylnitrobenzeen. Koop chemicaliën bij Fluka (nu onderdeel van Sigma). Zie Oehme en Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; VOORZICHTIG: De toxicologische eigenschappen van deze vloeibare ionenwisselaar zijn niet volledig bepaald. Inslikken of contact met het menselijk lichaam kan schadelijk zijn. Wees voorzichtig! Vloeibare ionenwisselaars moeten op een koele plaats worden bewaard, buiten direct zonlicht.</td></tr><tr><td>micro-elektrode houder</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>om ionen-selectieve micro-elektrode voorfabricaat voor silanisering te houden en de punt van ionen-selectieve vat te vullen met vloeibare ionenwisselaar; WPI verkoopt twee versies van deze houder, doorzichtige M3301EH en zwarte M3301EH. Volgens onze ervaring lijkt de doorzichtige M3301EH steviger te zijn dan de zwarte M3301EH.</td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>om ionen-selectieve micro-elektrode voorfabricaat te positioneren tijdens silanisering en het vullen van de punt van ionen-selectieve vat met vloeibare ionenwisselaar; kan worden vervangen door elke drie-assige micromanipulator in goede werkende staat</td></tr><tr><td>micropipet puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td>om dubbelbuisglasbuis te trekken; andere pullers kunnen worden gebruikt zolang ze grote diameter dubbelbuisglasbuis kunnen plaatsen</td></tr><tr><td>microprobe thermometer</td><td>Physiotemp</td><td>Model BAT-12R</td><td>fijne sonde van deze thermometer wordt dicht bij opnameplaats geplaatst</td></tr><tr><td>naald</td><td>BD</td><td>Spuiten en Naalden

real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Deze review beschrijft de basisconcepten en het protocol om de real-time iontoforese (RTI) methode uit te voeren, de gouden standaard om de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen te onderzoeken en te kwantificeren. De ECS omgeeft alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix. Het transport van veel stoffen die nodig zijn voor hersenactiviteit, inclusief neurotransmitters, hormonen en voedingsstoffen, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in het volume en de geometrie van deze ruimte komen voor bij normale hersenprocessen, zoals slaap en pathologische aandoeningen, zoals ischemie. De structuur en de regulering van hersen ECS, vooral in zieke staten, blijft echter grotendeels onontgonnen. De RTI methode meet twee fysieke parameters van het levende brein: volume fractie en tortuositeit. Volume-fractie is het aandeel van het weefselvolume dat door ECS wordt bezet. Tortuosity is een maat voor de relatieve hinder die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersenreactieGion in vergelijking met een medium zonder obstakels. In RTI wordt een inerte molecuul gepulst van een bron microelektrode in de hersenen ECS. Aangezien moleculen van deze bron diffunderen, wordt de veranderende concentratie van het ionen mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode die ongeveer 100 μm is gepositioneerd. Uit de resulterende diffusiecurve kan zowel volumefractie als tortuositeit worden berekend. Deze techniek is gebruikt in hersenschijfjes van meerdere soorten (inclusief mensen) en in vivo om acute en chronische veranderingen in ECS te bestuderen. In tegenstelling tot andere methoden kan RTI zowel in realtime als omkeerbare en onomkeerbare veranderingen in de hersenen ECS worden bekeken.

Het nut van de RTI techniek wordt aangetoond in een experiment dat is ontworpen om de veranderingen in a en tijdens een hypoosmolaire uitdaging te meten ( Figuur 8 en Figuur 9 ). Het is eerder aangetoond dat het verminderen van de osmolariteit van de ECS door wassen op hypotonische ACSF een afname in a en een toename van λ 13 zal veroorzaken . <p class="jove_content" fo:keep...

Dit protocol beschrijft real-time iontoforese, een methode die fysieke parameters meet van de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen. De diffusie van een inert molecuul dat in de ECS wordt vrijgegeven, wordt gebruikt om de ECS volume fractie en tortuositeit te berekenen. Het is ideaal voor het bestuderen van acute omkeerbare veranderingen in hersen ECS.

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Het algemene doel van deze procedure is om het volumefractie en de kronkeligheid van de extracellulaire ruimte in hersenweefsel te kwantificeren. Deze methode beantwoordt sleutelvraagstukken over de relatie tussen de extracellulaire ruimte en de fysiologie en ziekte. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de real-time karakterisering van twee belangrijke parameters van de extracellulaire ruimte mogelijk maakt.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de iontoforetische micro-elektrode een neiging vertoont om zijn eigenschappen tijdens experimenten te veranderen en vereist vaak probleemoplossing tijdens experimenten. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal aangezien de nauwkeurige manipulatie van een ion-selectieve micro-elektrode, een iontoforetische elektrode over meerdere stappen vereist is om een ​​succesvolle opname te verkrijgen. Om deze procedure te beginnen, laat ACSF met tetramethylammonium, of TMA, door de onderdompelingskamer lopen met twee milliliter per minuut.Stel de temperatuurregelaar in op een gewenste temperatuur en bellen de ACSF met 95% zuurstof, 5% koolstofdioxide gedurende de duur van het experiment. Monteer vervolgens de grondelektrode op een houder en dompel de punt in de ACSF die door de onderdompelingskamer loopt. Vul vervolgens de poreuze beker met 0,3% agarose bevattend TMA dat eerder is bereid en plaats het in de onderdompelingskamer.Bevestig nu een iontoforetische micro-elektrode aan de pijphouder van een micromanipulator. Verbind de iontoforetische micro-elektrodedraad met de hoofdtrap van de iontoforetische eenheid. Bevestig vervolgens een gekalibreerde ISM aan de tweede micromanipulator en verbind de ISM met de hoofdtrappen.Vervolgens, zet de computer aan die de Wanda en Walter programma's bevat. Klik in de Wanda GUI op Calibreren. Vul vervolgens in het kalibratievak de spanningen in die zijn gemeten tijdens de ISM-kalibratie en klik op Gegevens aanpassen.Klik vervolgens op Accepteren in het kalibratievak om de helling en de gegenereerde interferentie automatisch over te zetten naar de hoofd GUI. Zorg ervoor dat aan de linkerkant van de GUI alle experimentele parameters zijn ingesteld in de bijbehorende invoervelden. Plaats vervolgens een temperatuurvoeler in de agarcup.Noteer de gemeten temperatuur in het Temperatuurveld in het Meetelektrodevak van de GUI. Vervolgens laat de micro-elektroden minstens 1.000 micrometer diep in de agarose zakken en centreer ze in de cup. Beeld ze onder de microscoop af met een 10X objectief.Verplaats op de tweekanaals versterker handmatig de ISM-kanaalconnector naar de spanningsaftrekuitgang om de aftrek tussen de referentie en ISM-kanalen in te stellen. Centreer de uiteinden op elkaar in alle drie de richtingsassen. Nullen vervolgens de relatieve posities van beide micro-elektroden op de micromanipulator controleboxen en zorg ervoor dat de micro-elektroden nauwkeurig en nauwkeurig zijn gecentreerd.Vervolgens verplaats de ISM 120 micrometer weg van de iontoforetische micro-elektrode in één as. Start vervolgens een opname door op Verwerven in de GUI te klikken en laat het programma volledig opnemen. Open in deze procedure het Walter-programma op de computer.Klik in het Zero Records From-menu op de Wanda Voltoro-knop om de door Wanda gegenereerde records te lezen. Selecteer in het volgende pop-upvenster een of meer records om te lezen en klik op Openen. Klik in het One Write Excel-menu op Sheet 1.3 en volg de prompts totdat de records automatisch worden geplot.Om de pasprocedure te starten, klik in het menu Twee Opties op de select rec-knop. Gebruik vervolgens in het pop-upvenster figuur twee de muis om de kruislijnen over het eerste record te verplaatsen dat moet worden verwerkt en druk op een van de muisknoppen om het record te kiezen. Klik vervolgens op curve aanpassen in het menu en gebruik minimaal 20 iteraties van aanpassing om een ​​nauwkeurige pas van de gegevens te verkrijgen.Selecteer vervolgens alles om alle gegevenspunten te passen en selecteer doorgaan. Het programma past de weergegeven curve aan. Selecteer vervolgens de optie om het resultaat naar het juiste spreadsheetprogramma te schrijven door op Excel te klikken in het menu met zeven resultaten.Noem het Excel-bestand. Noteer en registreer de gegenereerde gegevens die zullen worden gebruikt om de functionaliteit van de iontoforetische micro-elektrode te bepalen. Als de iontoforetische micro-elektrode geschikt wordt geacht voor het experiment, noteer het gemiddelde transportnummer van alle proeven in het TransportNum eindveld in de Wanda GUI.Plaats in deze procedure een hersensnede van 400 micrometer dik in de opnamekamer en zorg ervoor dat deze volledig ondergedompeld is in de stromende ACSF. Vervolgens verplaats zowel de iontoforetische micro-elektrode als de ISM boven het veld van belang op de hersensnede. Dompel beide elektroden onder in de stromende ACSF, maar boven de snede.Nullen vervolgens de spanning voor zowel de referentie- als de ion-detectiekanalen naar nul millivolt. Wacht tot de spanning in beide kanalen is gestabiliseerd. Markeer op de diagramrecorder de spanning gemeten op het ion-detectiekanaal van de ISM.Plaats vervolgens de ISM en iontoforetische micro-elektroden 200 micrometer diep in de snede en 120 micrometer van elkaar weg. Bereken het spanningsverschil tussen de TMA-signalen gemeten in de stromende ACSF en in de hersenen en voer deze waarde in het Baseline Volt Millivolt veld in het Meetelektrodevak van de Wanda GUI. Zorg ervoor dat aan de linkerkant van de GUI alle experimentele parameters correct zijn ingevoerd.Start de opname door op Verwerven te klikken en laat deze een volledige opname maken. Nadat u beide micro-elektroden uit de snede hebt verplaatst, gebruikt u de diagramrecorder om eventuele verandering tussen de nu gemeten spanning en zijn meting van vóór te bepalen. Om de opnames uit de hersenen te analyseren, herhaalt u de procedures voor agarosegegevensanalyse met behulp van het Walter-programma.Schrijf de gegevens naar het spreadsheetprogramma door op Excel te klikken in het Walter-menu. Noteer vervolgens het volumefractie van de hersen-ECS, de kronkeligheid van de hersen-ECS en de niet-specifieke opname. Om het transportnummer te controleren, neemt u nieuwe opnames in agarose en herhaalt u de procedures in het Walter-programma om het transportnummer

real-time-iontophoresis-with-tetramethylammonium-to-quantify-volume

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates evoked potassium ion concentration dynamics on electrical stimulation of mouse coronal hippocampal brain slices. A bipolar stimulating electrode is inserted into the stratum radiatum of the CA3 region in the hippocampus, and a potassium-ion selective electrode is placed in the CA1 stratum radiatum. The electrical stimulation causes an action potential, resulting in potassium ion release. Finally, the lack of evoked potassium ion response in the presence of an inhibitory...

Measurement of Evoked Potassium Ion Concentration Dynamics in Coronal Hippocampal Slices

This video demonstrates how to characterize the extracellular space in a brain slice by using ion-selective and iontophoresis microelectrodes to measure and compare electrical signals. This process helps determine the space's volume fraction and degree of twisting.

Characterizing Extracellular Space in a Brain Slice Using Ion-Selective and Iontophoresis Microelectrodes

Source: Moye, S. L., et.al. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019). This video demonstrates the use of fluorescent dye iontophoresis to study astrocyte morphology in fixed brain slices. It details the piercing of the astrocyte soma with an electrode to deliver an anionic, hydrophilic dye into the cytoplasm under a low-voltage current, enabling the dye to diffuse and label the soma and branches. Confocal microscopy is then used to visualize the...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

In dit artikel zullen we snel micro-iontoforese van neurotransmitters als een techniek om de integratie van postsynaptische signalen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie onderzoeken.

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

We demonstreren de fabricage, kalibratie en eigenschappen van twee soorten ionen-selectieve micro-elektroden (dubbel-gerand en concentrisch) voor het meten van ionenconcentraties in hersenweefsel. Deze worden vervolgens gebruikt in de muis hippocampale plak voorbereiding om te laten zien dat exciterende activiteit zowel extracellulaire kalium- als natriumconcentraties verandert.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

Astrocyten zijn morfologisch complexe cellen, geïllustreerd door hun meerdere processen en bossige gebieden. Om hun uitgebreide morfologie te analyseren, presenteren wij een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Lucifer gele Iontoforese in licht vast weefsel.

Visualisering van de morfologie van de astrocyten met behulp van Lucifer geel Iontforesis

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

We beschrijven een protocol voor het beoordelen van dosis-responscurves voor extracraniële stimulatie in termen van elektrische veldmetingen van de hersenen en een relevante biomarker-cerebrale bloedstroom. Aangezien dit protocol invasieve elektroden in de hersenen plaatst, is algemene anesthesie nodig, waarbij spontane ademhaling de voorkeur heeft boven gecontroleerde ademhaling.

Plaatsing van extracraniële stimulerende elektroden en meting van cerebrale bloedstroom en intracraniële elektrische velden bij verdoofde muizen

Leer real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren. Deze methode maakt real-time karakterisatie van ECS-parameters mogelijk.

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren (Video) | JoVE Journal

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

Meer video's verkennen