Name: Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Leer fluorescerend gelabelde eiwitten tot expressie brengen in gekweekte insectencellen voor het bestuderen van eiwitfunctie en cellulair transport. Deze methode biedt snelle vectorconstructie zonder baculovirusnadelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Lynn Forlow-Jech en Dannialle LeRoy voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door base CRIS financiering van USDA ARS, Nationaal Programma 304 - Crop Protection and Quarantine [Project # 2020-22620-022-00D] om JAF en JJH Vermelding van handelsnamen of commerciële producten die in dit artikel is alleen voor het doel van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.

1. OE-PCR voor de bouw van expressieplasmiden Opmerking: zie tabel 1 voor alle primers die in OE-PCR. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen voor alle amplificaties. Omdat deze enzymen vaak geen reactie 3&#39;A, is het noodzakelijk om een ​​korte, niet-amplificeren incubatie voeren met een Taq DNA polymerase &#39;A-staart&#39; van de PCR-producten voordat ze kloneren in een TA insectencel expressie vector. Dit protocol wordt een methode voor het genereren insect expressie plasmiden chimere eiwitten, waarbij de fluorescerende eiwitten gefuseerd in-frame aan de carboxylterminus van de genen van belang (in casu twee Bemisia tabaci aquaporine eiwitten) of subcellulaire markereiwitten (Fig 1). <ol><li> Gebruik OE-PCR, die bestaat uit twee onafhankelijke rondes van amplificatie genereren: (1) die coderen voor de genen van belang (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) gefuseerd in frame met een groen fluorescerend eiwit variant genaamd EGFP of (2) de subcellulaire markers (Drosophila melanogaster sex peptide receptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) met mCherry coderende sequentie. Direct ligeren de uiteindelijke OE-PCR producten in de pIB / V5-His-TA plasmide. <ol><li> Voor de eerste ronde van OE-PCR (aangeduid met AD en A&#39;-D&#39; in figuur 1), gebruik van een gen-specifieke sense primer (vetgedrukt in Tabel 1) en een chimeer antisense primer (cursief in Tabel 1) gevonden de laatste 15 bp (zonder het stopcodon) van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5&#39;-uiteinde van het gewenste fluorescerend eiwit (EGFP of mCherry) een productmengsel met een 3&#39;-overhang genereren. Opmerking: Zie tabel 2 voor PCR omstandigheden. </li><li> In een afzonderlijke buis, gebruik van een gen-specific fluorescerend eiwit antisense primer (afgebeeld met een onderstreping in tabel 1) en een chimère sense primer die 15 bp van het 3&#39;-uiteinde van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5&#39;-einde van de gewenste fluorescerende bevat eiwit aan een product met een 5&#39;-overhang te genereren. Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. De PCR-matrijs kan hetzij een sequentie gevalideerde PCR product of, liever, plasmide-DNA dat de gewenste sequentie. De hier beschreven onderzoek maakt gebruik sequentie gevalideerde plasmiden. </li><li> Scheid de PCR producten met 1% agarose gelelektroforese (met behulp van standaard moleculair-grade agarose). </li><li> Accijns en zuiveren van de producten van de verwachte afmetingen (zie tabel 2) met een commercieel beschikbare DNA gelextractiekit (zie de tabel van materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol). </li><li> Met de gel gezuiverde PCR-producten van stap 1.1.4 de definitieve overlap e genererenXTensie producten (aangegeven met A &#39;- D &#39;&#39; in figuur 1). Met een gen sense primer voor het betreffende gen / subcellulaire marker en het overeenkomstige gen-specifieke antisense primer voor het fluorescerende eiwit aan de gewenste chimere sequentie te genereren. Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. Het kan nodig zijn om de optimale hoeveelheden eerste ronde overlap verlengingsproducten empirisch vast te voegen aan het reactiemengsel om het uiteindelijke volledige lengte chimere PCR product. </li><li> Scheid de tweede ronde OE-PCR producten door 1% agarose gelelektroforese. Accijns en zuiveren van de producten met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-gelextractiekit. </li><li> Incubeer gel gezuiverde tweede ronde OE-PCR producten met 1 eenheid Taq DNA-polymerase master mix gedurende 10 minuten bij 72 ° C aan het 3&#39;-geadenyleerde (dwz A-staart) producten nodig voor TA klonering genereren. </li><li> Ligeren van de resulterende geadenyleerde productenpIB in de expressievector en het gebruik van standaard moleculaire kloneringstechnieken om chemisch competente (hitteschok) of elektrocompetente (elektroporatie) Escherichia coli cellen te transformeren. Plaat overnacht op medium dat de geschikte selectiemerker (bijvoorbeeld ampicilline of carbenicilline). </li><li> Uitvoeren van kolonie-PCR 12 met behulp van een vector-specifieke primer en een plaats-specifieke primer voor insertie-positieve kolonies die zijn getransformeerd met expressie- plasmiden die een insert in de 5&#39;-3&#39; oriëntatie te identificeren. Bereid &#39;s nachts culturen van kolonies genereren van PCR-producten van de verwachte grootte. </li><li> Isoleer plasmide-DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol). Valideer de sequentie integriteit van elk inzetstuk door directe DNA-sequentiebepaling. </li></ol></li></ol> Opmerking: Om steriele omstandigheden te handhaven over tot alle cellen manipulaties die de opening van de weefselkweek kolf onder een laminaire stroming kap. Schakel de laminaire stroming kap UV kiemdodende lamp tenminste 1 uur voor cel manipulaties. Draag nitril en decontamineren oppervlak van de bank, pipetten, werktuigen, buizen en kolven met 70% ethanol voor het gebruik ervan. Bekendheid met elementaire celcultuur technieken wordt aanbevolen 13. <ol><li> Gebruik Tni cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid van Trichoplusia ni ovarieel weefsel) die zijn aangepast aan serumvrij medium en onderhouden als hechtende monolaag kweek in serumvrij insect medium bij 28 ° C in T25 weefselkweekflessen. </li><li> Handhaven Sf9-cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid is van Spodoptera frugiperda ovariële weefsel) die gelijk maar met gebruik TNM-FH insect kweekmedium supplemented met 10% foetaal runderserum (FBS). </li><li> Zaad van de eerste kweek uit bevroren Sf9 of Tni-cellen door het verwijderen stock flesjes van -80 ° C en zodat ze ontdooien in een 37 ° C waterbad. Decontamineren flesjes met 70% ethanol na ontdooien en plaats ze op ijs. </li><li> Voeg 4 ml insectencel medium in nieuw T25 fles en breng 1 ml van het ontdooide insectencel suspensie. Plaats de kolf in een 28 ° C, niet-bevochtigde incubator en de cellen te laten hechten gedurende 30-45 min. </li><li> Vervang het enten medium met 5 ml van het geschikte medium en de flessen te brengen naar een 28 ° C niet bevochtigde incubator. Monitor cel samenvloeiing dagelijks. Passage van de cellen bij het bereiken van 90% samenvloeiing. Opmerking: de volledige dekking van T25 fles overeenkomt met ~ 5 x 10 6 cellen. </li><li> Insectencel passage. <ol><li> Om doorgang de cellen eerst de uitgeputte medium uit de confluente kolf met cellen met een steriele 5 ml serologische pipet.Kantel de kolf zodat het medium stroomt naar een hoek, weg van de celmonolaag. Verwijder voorzichtig het medium met behulp van een pipet zonder verstoring van de cellen. </li><li> Los TNI cellen door zachtjes spoelen van de T25 kolven met de confluente monolaag met 4 ml serumvrij medium insect middels nieuwe, steriele, 5 ml serologische pipet. Verplaats de pipetpunt in de kolf langzaam irrigatie cellen losjes bevestigd aan de bodem kolf te verwijderen. <ol><li> Controleer de adequate losmaken van cellen door alle media, het draaien van de kolf, en het waarnemen dat de bodem van de kolf helder. </li></ol></li><li> Voor Sf9-cellen, die strakker hechten wordt 4 ml vers TNM-FH-medium en gebruikt een cel schraper om de gehechte cellen te verwijderen. Met een 5 ml serologische pipet zachtjes mengen en verkleinen cellen klonteren. </li><li> Gebruik een geautomatiseerde celteller het aantal levensvatbare insectencellen per volume medium schatten. Overdracht 0,1 ml cellen / mediummengsel met 1,5 mLmicrofugebuis. In een afzonderlijke 0,5 ml microcentrifugebuis, voeg 10 ul cellen / mediummengsel 10 pi van trypan blauw. </li><li> Verwijderen celteller kamer slede uit de verpakking en voeg 10 ul van de cel / medium / trypan blue mengsel aan weerszijden van de slede tellen. Steek de schuif in de cel teller en bepaal de celdichtheid en de levensvatbaarheid. </li><li> Gebruik van de celdichtheid, bereken en voeg de juiste hoeveelheid van insectencellen celmedium (maximaal 5 ml) nieuwe, steriele T25 flessen. </li><li> Breng ongeveer 1-1,5 x 10 6 cellen T25 flessen met vers medium; etiket van de flessen met de cellijn, datum, drager, aantal cellen toegevoegd en passage nummer (Pn + 1 generatie, waarbij P n is het aantal passages van de vorige generatie cellen); en plaatst de flessen in een 28 ° C incubator gedurende maximaal 72 uur. Opmerking: Insectencellen kunnen continu worden voortgeplant, hoewel cellen minder ontvankelijk voor transfectie en / of heteroloog kan zijneiwitexpressie na 30 passages. Behandelen weggegooid cellen / Media met 10% bleekmiddeloplossing autoclaaf en wegwerp plastic waren vóór verwijdering. </li></ol></li></ol> 3. insectencel Transfectie <ol><li> Zaad een T25 kolf met tot 1 x 10 6 Tni of Sf9-cellen in een geschikt insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en groeien tot confluentie gedurende 72 uur bij 28 ° C. </li><li> Verwijder de oude medium en los de cellen met 4 ml vers serumvrij insectenmedium (zie stap 2.6.2 en 2.6.3 hierboven). </li><li> Schat de celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie stap 2.6.4, hierboven). </li><li> Voeg ongeveer 7 x 10 5 cellen afzonderlijke 35 mm glazen bodem gerechten en de cellen te laten hechten gedurende 20-25 minuten bij 28 ° C. </li><li> Voor elke transfectie, voeg 2 pg plasmide DNA (hetzij een plasmide voor enkele transfecties of 2 ug van elk van de twee plasmiden voor doeuble transfecties) tot 0,1 ml serumvrij insectenmedium (zonder FBS zowel Sf9 en Tni transfecties) in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> In een afzonderlijke buis, meng 8 pl transfectiereagens met 0,1 ml serumvrij medium insecten en breng deze oplossing aan de buis bevattende het plasmide-DNA van belang. Licht vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min. </li><li> Verdun het plasmide-transfectie mengsel van stap 3.5 en 3.6 met 0,8 ml serumvrij medium insect, zodat het totale volume gelijk aan 1 ml. </li><li> Verwijder voorzichtig de media uit de glazen schalen met aangehechte cellen. Overlay de aangehechte cellen met het verdunde plasmide-transfectie medium. </li><li> Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 5 uur. Opmerking: De omstandigheden voor transfectie vereist empirische optimalisatie voor maximale transfectie-efficiëntie (bijvoorbeeld overnacht transfectie plaats van 5 uur, de hoeveelheid plasmide-DNA dat de chemie van het transfectiereagensgebruikt, enz.). </li><li> Verwijder de transfectie medium en voorzichtig wassen van de cellen met 1 ml serumvrij medium insect, dat evenwel niet om cellen los te maken. </li><li> Voeg 2 ml vers insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en incubeer bij 28 ° C gedurende 48-72 uur. Opmerking: Nogmaals, dit vereisen empirische optimalisatie voor maximale expressie van heteroloog eiwit. </li></ol> 4. Confocale fluorescentie microscopie <ol><li> Op 48-72 h na transfectie was de cellen eenmaal met 1 ml IPL-41 insectenmedium en dek af met 2 ml IPL-41 voor beeldvorming. Opmerking: Deze wasstap vermindert de achtergrond auto-fluorescentie waargenomen met insect cel medium dat wordt gebruikt in normale cel onderhoud. </li><li> 4 druppels Hoechst levende cellen kleurend reagens (zie de tabel van materialen voor de specifieke nucleaire kleurstof gebruikt in dit protocol) aan het medium en incubeer bij 28 ° C gedurende 20-25 min. Opmerking: Extra nucLear vlekken kunnen worden gesubstitueerd, hoewel de kleurstof een fluorescentieprofiel uniek van EGFP en mCherry moeten hebben. </li><li> Plaats een 35 mm schaal in de in zichzelf besloten laser scanning confocale microscoop (zie de tabel van materialen voor het specifieke instrument dat in dit protocol). </li><li> Stel de microscoop voor Hoechst, EGFP en mCherry observatiecondities: Hoechst excitatie / emissie - 359/461 nm; EGFP excitatie / emissie - 489/510 nm; mCherry excitatie / emissie - 580/610 nm. </li><li> Uitvoeren van een initiële scan met een 10x objectief fluorescerende expressie te bevestigen en daarna naar aftastmodus met gebruik van een 60X fasecontrast water immersie objectief. </li><li> Pas het laservermogen (5-7%), detectorgevoeligheidsbereik (47-49%), scansnelheid, Z-as diepte en digitale zoomfunctie om het beeldcontrast en resolutie optimaliseren. Het imago van de cellen met 1,5x digitale zoom om een ​​totaal van 90X versterking te geven. Opmerking: Microscoop parameters nodig empirische aanpassing voor optimalebeeldcollectie en kunnen specifiek zijn voor het instrument in gebruik. </li><li> Exporteer de ruwe data zoals TIFF beeldbestanden en wijzigen (gewas en overlay) voor de figuur generatie. </li></ol>

<ol><li>Kost, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>van Oers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+baculovirus-insect+cell+protein+expression%3A+from+dark+horse+to+mainstream+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology.</a> J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).</li>
<li>Contreras-Gòmez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Kollewe, C., Vilcinskas, A. <a target="_blank" href="http://thescipub.com/abstract/10.3844/ajbbsp.2013.255.271">Production of recombinant proteins in insect cells.</a> Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).</li>
<li>Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltmann%2C+F+%22Glycotechnology%22">Glycotechnology</a>. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+plasmid-based+transient+gene+expression+method+using+High+Five+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells.</a> J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+membrane+protein+expression+in+transiently+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres.+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells.</a> Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-free+transient+protein+production+in+Sf9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Virus-free transient protein production in Sf9 cells.</a> J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).</li>
<li>Loomis, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InsectDirect+System%3A+rapid%2C+high-level+protein+expression+and+purification+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).</li>
<li>Wurch, T., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1023%2FA%3A1008848517221">A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes.</a> Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).</li>
<li>Woodman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+intact+bacteria+%28colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).</li>
<li>Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0">http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0</a> (2014).</li>
<li>Mathew, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+functional+aquaporin+water+channel+protein+from+alimentary+tract+of+whitefly%2C+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).</li>
<li>Van Ekert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+Bemisia+tabaci+aquaporins+reveals+the+water+channel+diversity+of+hemipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).</li>
<li>Hull, J. J., Brent, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+sex+peptide+receptor-like+transcript+from+the+western+tarnished+plant+bug+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus.</a> Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).</li>
<li>Maroniche, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+set+of+Gateway-compatible+vectors+for+live+imaging+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells.</a> Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).</li>
<li>Hull, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+western+tarnished+plant+but+%28Lygus+hesperus%29+olfactory+co-receptor+ORCO%3A+Expression+profile+and+confirmation+of+atypical+membrane+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology.</a> Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+the+PBAN+receptor+molecule%3A+Characterization+of+PBANR+variants+expressed+in+the+pheromone+glands+of+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths.</a> Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).</li>
<li>Fabrick, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+multiple+aquaporin+water+channel+proteins+from+the+western+tarnished+plant+bug%2C+Lygus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+baculovirus+%28Bombyx+mori+nuclear+polyhedrosis+virus%29+repeat+element+functions+as+a+powerful+constitutive+enhancer+in+transfected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells.</a> J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286814771_Comparative_analysis_of_the_activity_of_two_promoters_in_insect_cells">Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells.</a> African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).</li>
<li>Kohnhorst, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+functions+of+proteins+under+fluorescence+single-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/263/5148/802">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Heterologe eiwitexpressie zijn belangrijk voor de vervaardiging van recombinante eiwitten gebruikt in talrijke afgeleide toepassingen 4. Het kiezen van de diverse expressiesystemen beschikbaar afhankelijk van het einddoel voor het eiwit van belang. Verschillende expressie in insectencellen systemen zijn beschikbaar die flexibele alternatieven voor prokaryote en eukaryote celexpressiesystemen 5, 6 te bieden. Insecten systemen die baculovir...

De productie van recombinante eiwitten met behulp van expressie in insectencellen systemen biedt tal van voordelen voor de studie van eukaryotische eiwitten. Namelijk insectencellen bezitten soortgelijke posttranslationele modificaties, verwerking en sorteermechanismen als die welke in zoogdiercellen, hetgeen voordelig is voor het produceren van correct gevouwen eiwitten 1, 2, 3. Insectencel systemen ook typisch minder middelen en minder tijd en moeite voor het onderhoud dan zoogdiercellijnen 4, 5. Het baculovirus expressiesysteem is zo&#39;n insectencellen gebaseerde systeem dat nu algemeen wordt gebruikt in vele disciplines, waaronder de productie van recombinante eiwitten voor eiwitkarakterisering en therapie, de immunogène presentatie van vreemde peptiden en virale eiwitten voor vaccinproductie, de synthese van multi -proteïne complexenDe productie van geglycosyleerde eiwitten, enz. 1, 2, 4, 6. Er zijn echter situaties waarin baculovirus expressie niet van toepassing 3, 7, en het gebruik van nonlytic en insecten transiënte expressiesystemen geschikter zijn. Bijzonder transiënte expressie in insectencellen biedt de mogelijkheid voor de snelle synthese van recombinant eiwit, vereist minder ontwikkeling en onderhoud, niet gepaard gaat met virale opgelegde cellysis en verschaft een middel om cellulaire transport beter bestuderen tijdens eiwitsynthese 7, 8, 9, 10. Dit protocol beschrijft de snelle vorming van expressievectoren gebruikt tweestaps overlap extension PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmiden worden gebruikt om dubbel transfecteren handel verkrijgbaar gekweekte insectencellen en representatieve eiwitten. Het protocol beschrijft de productie en het gebruik van twee verschillende fluorescent gelabelde subcellulaire markereiwitten en toont colocalisatie twee aquaporine eiwitten van het insect Bemisia tabaci. Het volgende protocol geeft de basismethode voor OE-PCR, insectencel onderhoud en transfectie en fluorescentiemicroscopie voor de cellulaire lokalisatie van doeleiwitten.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA Polymerase</td><td>EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td>High-fidelity DNA polymerase gebruikt voor PCR-amplificatie van overlappende extensie PCR-producten</td></tr><tr><td>ExTaq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa-Clontech</td><td>RR001B</td><td>DNA-polymerase gebruikt voor A-staarting van PCR-producten</td></tr><tr><td>EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix</td><td>Lucigen</td><td>30033-1</td><td>DNA-polymerase gebruikt voor bacteriële kolonie PCR</td></tr><tr><td>Biometra TProfessional Gradient Thermocycler</td><td>Biometra/LABRepCo</td><td>070-851</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Montage DNA Gel Extraction Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>LSKGEL050</td><td></td></tr><tr><td>pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K89020</td><td>Bevat componenten die nodig zijn om overlappende extensie PCR-producten te klonen, inclusief gelinieriseerd en door topoisomerase I geactiveerd pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemisch competente E. coli en zout oplossing.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube Robotic Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Vertical Clean Bench</td><td>Labconco</td><td>3970401</td><td></td></tr><tr><td>Tni gekweekte insectencel lijn</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10005</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 gekweekte insectencel lijn</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-CEL-10002</td><td></td></tr><tr><td>Serum-vrij Insectencultuurmedium</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10002</td><td></td></tr><tr><td>TNM-FH Insectencultuurmedium</td><td>Allele Biotech</td><td>ABP-MED-10001</td><td></td></tr><tr><td>IPL-41 Insectenmedium</td><td>ThermoFisher</td><td>11405081</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Transfectie Reagens</td><td>ThermoFisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>16 cm Wegwerp Cel Schrapers</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td>Cel schrapers met twee-positie mes</td></tr><tr><td>25 cm2 (T25) Weefsel Cultuur Flacons met Vent Filterdoppen</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229331</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipetten</td><td>Fisher</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>Steriele, 50 mL Bio-Reactiebuizen</td><td>Life Science Products</td><td>CT-229475</td><td></td></tr><tr><td>PipetteBoy</td><td>VWR</td><td>14222-180</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipetten</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Flat-Cap PCR Buizen</td><td>Fisher</td><td>14230200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen Biohazard Autoclaafzakken</td><td>Fisher</td><td>01828C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm #1.5 Glas Bodem Schaaltjes</td><td>Matsunami Glass</td><td>D35-14-1.5-U</td><td>35 mm schotel diameter, 14 mm glas diameter, 1.5 mm glas dikte, ongecoat</td></tr><tr><td>Incubator, Model 1510E</td><td>VWR</td><td>35823-961</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Cel Teller</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cel Telling Kamer Slides met 0.4% Trypan Blauw Reagens</td><td>ThermoFisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>HsPLA2/pCS6 plasmide DNA</td><td>transOMIC Technologies</td><td>TCH1303</td><td></td></tr><tr><td>pmCherry Vector</td><td>Clontech</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagens (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37605</td><td></td></tr></tbody></table>

transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heteroloog eiwit expressiesystemen worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, de interpretatie van cellulaire transport / lokalisatie en het vaststellen van de biochemische functie van eiwitten op sub-organismal niveau. Hoewel baculovirus expressiesystemen in toenemende mate gebruikt voor eiwitproductie in talrijke biotechnologische, farmaceutische en industriële toepassingen, nonlytic systemen die geen virale infectie inhouden duidelijke voordelen, maar vaak vergeten en onderbenut. Hier beschrijven we een werkwijze voor het nonlytic expressievectoren en transiënte expressie van recombinant eiwit. Dit protocol maakt een efficiënte cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten en kunnen worden gebruikt om snel te onderscheiden eiwittransport in de cel. We tonen de expressie van vier recombinante eiwitten in een in de handel verkrijgbaar insectencellijn, waaronder twee aquaporine eiwitten van insecten Bemisia tabaci, enals subcellulaire markereiwitten specifiek voor het cel plasmamembraan en intracellulaire lysosomen. Alle recombinante eiwitten werden geproduceerd als chimeren met fluorescerende eiwit markers aan hun carboxyl termini, die zorgt voor de directe detectie van de recombinante eiwitten. De dubbele transfectie van cellen met plasmiden constructen voor de genen van belang en een bekende subcellulaire marker zorgt voor live-cell imaging en verbeterde validatie van cellulaire eiwitten lokalisatie.

OE-PCR OE-PCR maakt de synthese van chimere DNA-producten die, wanneer in een expressievector ingebracht, maken de productie van recombinante chimere eiwitten overeenkomend naar proeven gen van belang en fluorescent merkereiwit. Figuur 1 een algemeen schema voor de bereiding van expressievectoren die pIB B. tabaci aquaporine coderende sequenties (BtDrip1 en BtDrip2_v1) in-frame met het fluorescerende pro...

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Het algemene doel van deze procedure is het tot expressie brengen van fluorescentie-gelabelde eiwitten van belang in commercieel verkrijgbare insectencellen voor een verbeterde verduidelijking van de eiwitfunctie en/of het cellulaire transport van eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie en biochemie met betrekking tot eiwitfunctionaliteit, eiwitinteracties en/of subcellulaire eiwitlokalisatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat constructen snel kunnen worden gegenereerd en dat de tot expressie gebrachte eiwitten functioneel kunnen worden beoordeeld in levende cellen zonder de schadelijke effecten die gepaard gaan met baculovirus-expressie, waardoor de doorvoer wordt verbeterd.Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij de studie naar insecteneiwitten, kan deze ook worden toegepast op elk systeem waarvoor de studie naar eiwitfunctie of cellulaire lokalisatie gewenst is. De procedure voor insectenceltuivel en transfectie zal worden gedemonstreerd door Danni LeRoy, een technicus uit mijn laboratorium. Om deze procedure te starten, haalt u de stockvials met bevroren SF9- en Tni-cellen uit de -80 °C vrie

transient-expression-cellular-localization-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.

Technische Cel-permeabel Protein

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Leer fluorescerend gelabelde eiwitten tot expressie brengen in gekweekte insectencellen voor het bestuderen van eiwitfunctie en cellulair transport. Deze methode biedt snelle vectorconstructie zonder baculovirusnadelen.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Meer video's verkennen