Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Het algemene doel van deze procedure is het tot expressie brengen van fluorescentie-gelabelde eiwitten van belang in commercieel verkrijgbare insectencellen voor een verbeterde verduidelijking van de eiwitfunctie en/of het cellulaire transport van eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie en biochemie met betrekking tot eiwitfunctionaliteit, eiwitinteracties en/of subcellulaire eiwitlokalisatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat constructen snel kunnen worden gegenereerd en dat de tot expressie gebrachte eiwitten functioneel kunnen worden beoordeeld in levende cellen zonder de schadelijke effecten die gepaard gaan met baculovirus-expressie, waardoor de doorvoer wordt verbeterd.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden bij de studie naar insecteneiwitten, kan deze ook worden toegepast op elk systeem waarvoor de studie naar eiwitfunctie of cellulaire lokalisatie gewenst is. De procedure voor insectenceltuivel en transfectie zal worden gedemonstreerd door Danni LeRoy, een technicus uit mijn laboratorium. Om deze procedure te starten, haalt u de stockvials met bevroren SF9- en Tni-cellen uit de -80 °C vriezer en laat u deze ontdooien in een 37 °C waterbad.

Decontamineer na het ontdooien de vials met 70% ethanol en plaats deze op ijs. Alle celmanipulaties waarbij vials en weefselkweekflessen moeten worden geopend, moeten worden uitgevoerd in een laminaire flowkast om steriele omstandigheden te waarborgen. Voeg vier milliliter serumvrij insectenmedium toe aan een nieuwe T25-fles en vier milliliter TNM-FH-medium aan een andere T25-fles.

Overbreng één milliliter ontdooide Tni-cellen naar de kolf met serumvrij insectenmedium en één milliliter ontdooide SF9-cellen naar de kolf met TNM-FH-medium. Plaats de kolven in een niet-bevochtigde incubator bij 28 °C en laat de cellen 30 tot 45 minuten hechten. Vervang het zaaimedium door vijf milliliter van het overeenkomstige medium.

Plaats de kolven vervolgens terug in de niet-bevochtigde incubator bij 28 °C. Controleer dagelijks de confluentie van de cellen. Subcultiveer de cellen wanneer zij een confluentie van 90% bereiken, zoals weergegeven in deze representatieve afbeeldingen.

Kantel de kolf met de confluente cellen zodat het medium naar één hoek stroomt, weg van de cellaag, en gebruik een steriele serologische pipette van vijf milliliter om het medium voorzichtig te verwijderen zonder de cellen te verstoren. Gebruik voor Tni-cellen een nieuwe steriele serologische pipette van vijf milliliter om voorzichtig vier milliliter serumvrij insectmedium op de confluente cellaag toe te voegen. Beweeg de pipetpunt over de kolf en spoel langzaam om cellen die losjes aan de bodem van de kolf zitten te verwijderen.

Om te controleren of de cellen voldoende zijn losgelaten, verwijdert u alle media, draait u de fles om en observeert u of de bodem van de fles schoon is. Voor SF9-cellen, die sterker hechten, voegt u vier milliliter vers TNM-FH-medium toe en gebruikt u een celschraper om de gehechte cellen los te maken. Gebruik een serologische pipette van vijf milliliter om de cellen voorzichtig te mengen en celklontering te verminderen.

Nadat de cellen zijn losgemaakt, brengt u ongeveer 0,1 milliliter van elk mengsel van cellen en medium over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg in een aparte microcentrifugebuis van 0,5 milliliter 10 microliter van elk mengsel van cellen en medium toe aan 10 microliter trypaanblauw. Haal de objectglasplaat voor de celsteller uit de verpakking en voeg 10 microliter van het mengsel van celmedium en trypaanblauw toe aan elke zijde van de telplaat.

Plaats het objectglas in een automatische celteller en bepaal de celdichtheid en levensvatbaarheid. Breng ongeveer 1 tot 1,5 × 10⁶ cellen over naar T25-flessen met vers medium. Label de flessen met de cellijn, datum, gebruikt medium, aantal toegevoegde cellen en het passagesnummer.

Plaats de flessen gedurende maximaal 72 uur in een incubator van 28 °C. De procedure voor transfectie van insectencellen moet tevens worden uitgevoerd in een laminaire flow-kast. Zaai een T25-fles in met maximaal 1 x 10⁶ Tni- of SF9-cellen in een geschikt insectencellmedium.

Tni-cellen worden in deze demonstratie gebruikt. Laat de cellen gedurende 72 uur bij 18 graden celsius groeien tot confluentie. Verwijder en gooi na 72 uur het oude medium weg en los de Tni-cellen los met vier milliliters vers serumvrij insectmedium, zoals eerder getoond.

Het meest uitdagende aspect van deze procedure is het verkrijgen van de juiste dichtheid van cellen die aan de glazen bodem van de schaaltjes zijn gehecht tijdens de transfectie. Er mogen niet meer dan 7 × 10⁵ cellen per schaaltje worden toegevoegd. Nadat de celdichtheid met een automatische celsteller is geschat, dient de celsuspensie grondig maar voorzichtig te worden gemengd door de buis om te keren, waarna ongeveer 7 × 10⁵ cellen aan individuele glazen bodemschaaltjes van 35 millimeter worden toegevoegd.

Laat de cellen 20 tot 25 minuten hechten bij 28 °C. Voeg voor elke transfectie twee µg plasmid DNA toe aan 0,1 mL serumvrij insectenmedium zonder FBS in een steriele 1,5 mL microcentrifugebuis. Meng in een aparte buis acht µL transfectiereagens met 0,1 mL serumvrij insectenmedium.

Overbreng vervolgens de oplossing naar de buis die het plasmide-DNA van belang bevat. Vortex kort en incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Verdun daarna het plasmidtransfectiemengsel met 0,8 milliliters serumvrij insectmedium, zodat het totale volume één milliliter wordt.

Verwijder voorzichtig het medium uit de glazen schaal met de gehechte cellen. Bedek de gehechte cellen met het verdunde plasmidtransfectiemedium. Incubeer de cellen vijf uur lang bij 28 °C.

Verwijder na vijf uur het transfectiemedium en gooi dit weg. Was de cellen voorzichtig met één milliliter serumvrij insectenmedium, waarbij u er op let de cellen niet los te maken. Voeg twee milliliter vers serumvrij insectencelmedium toe en incubeer gedurende 48 tot 72 uur bij 28 °C. Was de insectencellen 48 tot 72 uur na transfectie één keer met één milliliter IPL-41 insectenmedium en dek ze vervolgens met twee milliliter IPL-41 af voor beeldvorming.

Voeg vier druppels Hoechst live cell staining reagent toe aan het medium en incubeer dit bij 28 °C gedurende 20 tot 25 minuten. Plaats de 35 millimeter schaal in de zelfvoorzienende laser scanning confocale microscoop. Hoewel er commercieel veel glazen schalen beschikbaar zijn, is het belangrijk dat deze op de objecttafel van de microscoop passen; het kan noodzakelijk zijn om empirisch te bepalen welk glaswerk het meest geschikt is voor celhechting.

Stel de microscoop in voor de observatiecondities van Hoechst, EGFP en mCherry. 359 nanometers en 461 nanometers voor Hoechst-excitatie en -emissie. 489 nanometers en 510 nanometers voor EGFP-excitatie en -emissie.

En 580 nanometer en 610 nanometer voor mCherry excitatie en emissie. Voer met een 10X objectief een initiële scan uit om de fluorescente expressie te bevestigen. Schakel daarna over naar de scanmodus met een 60X fasecontrast waterimmersie-objectief.

Pas het laservermogen, de detectorgevoeligheid, de scansnelheid, de diepte van de Z-as en de digitale zoom aan om het beeldcontrast en de resolutie te optimaliseren. Beeld de cellen af bij een digitale zoom van 1,5X voor een totale vergroting van 90X. Sla de ruwe gegevens op en exporteer deze als TIFF-beeldbestanden voor latere analyse.

Tni-cellen werden getransfecteerd met de aangegeven plasmiden en de expressie van recombinante eiwitten werd gevisualiseerd met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Succesvolle transfectie en expressie van recombinant BtDrip1-EGFP is duidelijk zichtbaar door de aanwezigheid van groene fluorescentie op het celoppervlak. Cellen die getransfecteerd zijn met BtDrip2 versie één EGFP vertonen groene fluorescentie binnenin, wat duidt op de intracellulaire expressie van BtDrip2 versie één.

Op dezelfde manier vertonen cellen die getransfecteerd zijn met PIB DmSPR-mCherry of PIB PLA2G15-mCherry rode fluorescentie, wat wijst op de expressie van de respectievelijke chimeren. In de samengevoegde beelden duiden de oranje of gele gebieden op de expressie van zowel EGFP als mCherry, wat suggereert dat de eiwitten co-lokaliseren binnen dezelfde subcellulaire structuren. Een overlay van cellen die dubbel getransfecteerd zijn met PIB BtDrip1-EGFP en PIB DmSPR-mCherry suggereert co-lokalisatie van BtDrip1-EGFP en DmSPR-mCherry op het celoppervlak.

Cellen die dubbel getransfecteerd zijn met BtDrip2 versie één EGFP en PIB DmSPR-mCherry vertonen weinig colocalisatie van groene en rode fluorescentiesignalen, wat de intracellulaire expressie van BtDrip2 versie één bevestigt. In tegenstelling hiermee leidde de co-expressie van PIB BtDrip2 versie één EGFP en de lysosomale marker PIB PLA2G15-mCherry tot een significante overlap van de cytoplasmatische groene en rode fluorescentiesignalen. Dit suggereert sterk dat BtDrip2 wordt getransporteerd naar intracellulaire lysosomen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fluorescente eiwit-chimeren kunt tot expressie brengen in insectencultuurcellen. Dit systeem maakt een snelle vectorconstructie bij eiwitsynthese mogelijk, vermijdt de uitdagingen van virusgebaseerde expressiesystemen en biedt een robuuste methode om het transport van cellulaire eiwitten te observeren.