Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen
April 20th, 2017
Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om fluorescentie gelabelde eiwitten van belang binnen commercieel verkrijgbare insectencellen tot expressie te brengen voor de verbeterde verheldering van eiwitfunctie en/of cellulaire trafficking van eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen uit de celbiologie en biochemie over eiwitfunctionaliteit, eiwitinteracties en/of subcellulaire eiwitlokalisatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat constructen snel kunnen worden gegenereerd en expressie van functionele eiwitten kunnen worden beoordeeld in levende cellen zonder schadelijke effecten geassocieerd met baculovirusexpressie, waardoor de doorvoer wordt verbeterd.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de studie van insecteneiwitten, kan deze ook worden toegepast op elk systeem waarvoor de studie van eiwitfunctie of cellulaire lokalisatie wenselijk is. Het demonstreren van de procedure voor insectencelcultuur en transfectie zal worden gedaan door Danni LeRoy, een technicus uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, verwijdert u de voorraadbuisjes van bevroren SF9 en Tni cellen uit de vriezer op min 80 graden Celsius en laat ze ontdooien in een waterbad van 37 graden Celsius.
Na het ontdooien, decontamineer de buisjes met 70% ethanol en plaats ze op ijs. Alle celmanipulaties die het openen van buisjes en weefselcultuurkolven vereisen, moeten worden uitgevoerd in een laminaire flowkast om steriele omstandigheden te handhaven. Voeg vier milliliter serumvrij insectenmedium toe aan een nieuwe T25 kolom en vier milliliter TNM-FH medium aan een andere T25 kolom.
Breng een milliliter van de ontdooide Tni cellen over naar de kolom met serumvrij insectenmedium en een milliliter van de ontdooide SF9 cellen naar de kolom met TNM-FH medium. Plaats de kolommen in een 28 graden Celsius niet-bevochtigde incubator en laat de cellen 30 tot 45 minuten hechten. Vervang het zaaisemedium met vijf milliliter van het juiste medium.
En plaats de kolommen terug in de 28 graden Celsius niet-bevochtigde incubator. Controleer dagelijks de celconfluency. Passageer de cellen wanneer ze 90% confluency bereiken zoals getoond door deze representatieve afbeeldingen.
Kanteel de kolom met de confluente cellen zodat het medium naar één hoek stroomt weg van de cellagen en gebruik een steriele vijf milliliter serologische pipet om het medium voorzichtig te verwijderen zonder de cellen te verstoren. Voor Tni cellen, gebruik een nieuwe steriele vijf milliliter serologische pipet om voorzichtig vier milliliter serumvrij insectenmedium toe te voegen op de confluente celmonolayer. Beweeg de pipettip over de kolom en irrigeer langzaam om cellen die losjes aan de bodem van de kolom zijn gehecht te verwijderen.
Om te controleren of de cellen voldoende zijn losgemaakt, verwijder al het medium, draai de kolom om en observeer dat de bodem van de kolom helder is. Voor SF9 cellen, die sterker hechten, voeg vier milliliter vers TNM-FH medium toe en gebruik een celschraper om de gehechte cellen los te maken. Gebruik een vijf milliliter serologische pipet om voorzichtig te mengen en celkluwens te verminderen.
Na het losmaken van de cellen, breng ongeveer 0,1 milliliter van elke cel- en mediummix over naar een 1,5 milliliter micro-fugebuis. Voeg in een afzonderlijke 0,5 milliliter micro-fugebuis 10 microliter van elke cel- en mediummix toe aan 10 microliter trypanblauw. Verwijder de celtellerkamerslide uit de verpakking en voeg 10 microliter van de celmedium trypanblauwmix toe aan elke kant van de telslide.
Plaats de slide in een geautomatiseerde celteller en bepaal de celdichtheid en levensvatbaarheid. Breng ongeveer een tot 1,5 maal 10 tot de 6de cellen over naar T25 kolommen met vers medium. Label de kolommen met de cellijn, datum, gebruikt medium, aantal toegevoegde cellen en passagenummer.
Plaats de kolommen in een 28 graden Celsius incubator voor maximaal 72 uur. De procedure voor insectenceltransfectie moet ook worden uitgevoerd in een laminaire flowkast. Zaai een T25 kolom met maximaal een maal 10 tot de 6de Tni of SF9 cellen in een geschikt insectencelmedium.
Tni cellen worden gebruikt in deze demonstratie. Laat de cellen groeien tot confluency gedurende 72 uur bij 18 graden Celsius. 72 uur later, verwijder en gooi het oude medium weg en los de Tni cellen op met vier milliliter vers serumvrij insectenmedium zoals eerder getoond.
Het moeilijkste aspect van deze procedure is het verkrijgen van de juiste dichtheid van cellen die aan de glasbodemschalen zijn gehecht tijdens de transfectie. Er mag niet meer dan zeven maal 10 tot de 5de cel worden toegevoegd aan elke schaal. Na het gebruik van een geautomatiseerde celteller om de celdichtheid te schatten, meng de celsuspensie grondig maar voorzichtig door de buis om te keren en voeg ongeveer zeven maal 10 tot de 5de cellen toe aan individuele 35 millimeter glasbodemschalen.
Laat de cellen 20 tot 25 minuten hechten bij 28 graden Celsius. Voeg voor elke transfectie twee microgram plasmide DNA toe aan 0,1 milliliter serumvrij insectenmedium zonder FBS in een steriele 1,5 milliliter micro-fugebuis. Meng in een aparte buis acht microliter transfectiereagens met 0,1 milliliter serumvrij insectenmedium.
Breng vervolgens de oplossing over naar de buis met het plasmide DNA van belang. Vortig gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verdun vervolgens het plasmidetransfectiemengsel met 0,8 milliliter serumvrij insectenmedium, waardoor het totale volume op één milliliter komt.
Verwijder voorzichtig het medium van de glasplaat met gehechte cellen. Bedek de gehechte cellen met het verdunde plasmidetransfectiemedium. Incubeer de cellen bij 28 graden Celsius gedurende vijf uur.
Na vijf uur, verwijder en gooi het transfectiemedium weg en was de cellen voorzichtig met één milliliter serumvrij insectenmedium, zorg ervoor dat de cellen niet losraken. Voeg twee milliliter vers serumvrij insectencelmedium toe en incubeer bij 28 graden Celsius gedurende 48 tot 72 uur. 48 tot 72 uur na transfectie van de insectencellen, was de cellen eenmaal met één milliliter IPL-41 insectenmedium en
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het tot expressie brengen van fluorescent gelabelde eiwitten in insectencellijnen, wat het onderzoek naar eiwitfunctie en cellulaire transport verbetert. De aanpak maakt een snelle generatie van expressievectoren en functionele beoordeling van eiwitten in levende cellen mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Biochemie
- Eiwitfunctionaliteit
Achtergrond
- Nonlytische insectencel expressiesystemen worden onderbenut.
- Deze systemen kunnen de doorvoer in eiwitexpressiestudies verbeteren.
- Fluorescent tagging helpt bij de visualisatie van eiwitlokalisatie.
- De methode kan worden toegepast op verschillende eiwitstudies buiten insecten.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitfunctie en cellulaire transport te verduidelijken.
- Om inzichten te geven in eiwitinteracties en lokalisatie.
- Om een snelle en effectieve eiwitexpressietechniek te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Ontdooien van bevroren SF9 en Tni insectencellen.
- Transfectie van cellen met expressievectoren.
- Co-lokalisatiestudies met behulp van fluorescente markers.
- Functionele beoordeling van geëxprimeerde eiwitten in levende cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van fluorescent gelabelde eiwitten.
- Demonstratie van eiwitlokalisatie in levende insectencellen.
- Inzichten in de functionaliteit van aquaporins van Bemisia tabaci.
- Validatie van de effectiviteit van de methode voor eiwitstudies.
Conclusies
- Nonlytische insectencelsystemen zijn waardevol voor eiwitonderzoek.
- De methode verbetert het begrip van eiwitdynamica.
- Het biedt een veelzijdige aanpak die toepasbaar is op verschillende biologische systemen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, nonlytic transient expression in insect cells enables high-throughput functional interrogation of recombinant proteins, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. Direct visualization of protein localization and trafficking in live cells provides actionable insights for portfolio triage and predictive confidence in discovery workflows. This approach reduces reliance on viral systems, streamlining assay development and accelerating translational research decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assessment of protein function and subcellular localization in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying trafficking pathways and compartmentalization.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of recombinant constructs.
- Improves predictive confidence for advancing targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated cellular systems for downstream screening of protein interactions and localization.
- Enhances assay reproducibility and standardization via fluorescently tagged constructs.
- Enables scalable, nonlytic workflows suitable for high-throughput applications.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein trafficking and localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular localization data with disease-relevant pathways for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling live-cell imaging of protein dynamics.
- Reduces biological risk in preclinical models by confirming mechanistic hypotheses in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This transient expression and localization method integrates at the interface of early discovery, target validation, and assay development, providing a reusable platform for functional protein analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of protein trafficking.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible systems for quantitative localization and co-localization studies.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts for comparative analysis of protein distribution and interaction.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by validating cellular mechanisms in live systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, nonlytic workflow adaptable across diverse protein targets and cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, scalable, and reproducible nonlytic expression systems.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust functional data early in the pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect cell culture, transfection, and live-cell imaging.
- Needs access to confocal microscopy and automated cell counting instrumentation.
- Demands cross-team standardization of transfection and imaging protocols for reproducibility.
- May require adaptation of glassware and imaging conditions for different cell lines or constructs.
- Cell density and attachment optimization are critical for consistent transfection efficiency.
