Name: In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer cardiomyogene differentiatie van mesenchymale stamcellen via omgevingsignalen en aggregaatvorming. Deze methode biedt een alternatief voor farmacologische benaderingen bij hartziekteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel voor hun bijdragen: Matthew Librach, Leila Maghen Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg en Andrée Gauthier-Fisher. Dit werk werd gesteund door de The Ontario Fonds voor onderzoek inzake - Research Excellence (ORF-RE, ronde #7) en maken programma Inc.

Alle studies met dieren werden uitgevoerd en gerapporteerd volgens de ARRIVE-richtlijnen48. Alle studies werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethische commissie van het instituut (REB-nummer 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, University of Toronto, Toronto, Canada). Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van het University Health Network (Toronto, Canada) en alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8de editie (National Institutes of Health 2011).
1. Weefselkweek
<ol>
	<li>Kweek FTM HUCPVCs, term HUCPVCs (vooraf gevestigd, n ≥ 3 onafhankelijke lijnen voor elk)42 en commercieel verkrijgbare BMSCs in alfa-minimum essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en een 1% penicilline/streptomycine (P/S) cocktail. Kweek rat primaire cardiomyocyten en MSC-cardiomyocyt co-cultures in Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM-F12) bevattend 10% FBS en 1% P/S. 
	OPMERKING: Steriliseer het medium met behulp van een 0,2-µm filter. Bewaar bereide mediumoplossingen bij 4 °C voor maximaal 3 weken.</li>
	<li>Onderhoud de celculturen in bevochtigde incubatoren (95% relatieve vochtigheid, 37 °C, en 5% CO2) en passeer bij 70-80% confluency, bepaald door fasecontrastmicroscopie. Gebruik geschikte hoeveelheden medium voor de grootte van het gebruikte weefselkweekschaaltje (bijv. 10 mL in een 10-cm schotel en 2 mL per putje in een 6-well weefselkweekplaat). Gebruik deze kweekcondities gedurende de duur van het protocol.</li>
	<li>Dissocieer MSC-monolagen voor passages of MSC-cardiomyocyt co-cultuur-opbouw met behulp van een dissociatie-enzymoplossing (2 mL/putje in een 6-well plaat) en incubeer bij 37 °C gedurende 4 min.</li>
	<li>Breng de gedissocieerde cellen over naar een 15-mL buis en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Zuig het supernatant af zonder het cellenpellet te verstoren en resuspendeer de cellen in 1 mL van een kweekmedium dat geschikt is voor telling met behulp van een geautomatiseerde celteller. Zaai de cellen zoals beschreven in de volgende protocolsecties.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van primaire rat cardiomyocyte-MSC co-cultures
<ol>
	<li>Verkrijg hartweefsel voor primaire cardiomyocyte-isolatie.
	<ol>
		<li>Euthaniseer rattenpups (5-6 dagen postnataal) met CO2 verstikking. Zet CO2 kamers op 20% gasvervanging (stroom snelheid = 0.2 x kamervolume per min). Bevestig exitus door afwezigheid van de knijpreflex.</li>
		<li>Verwijder de atria met de aansluitende grote bloedvaten met behulp van gesteriliseerde instrumenten (d.w.z. tang en gebogen schaar)41. Breng de harten over naar 50-mL buizen met steriel PBS met1% P/S (PBS-P/S) op ijs.</li>
		<li>Snijd de ventriculi doormidden en laat het bloed wegspoelen in een 10-cm schotel met 10 mL PBS-P/S op ijs. Snijd de ventriculaire wanden in kleine stukjes (diameter = 2-3 mm) met behulp van gebogen schaar.</li>
		<li>Breng de hartstukken van 10-12 dieren over naar een 50-mL buis met behulp van een serologische pipette en laat ze bezinken.</li>
		<li>Verwijder zoveel mogelijk PBS-P/S zonder enig hartstukje te verwijderen. Voeg 10 mL nieuw PBS-P/S toe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verteer het hartweefsel om de cardiomyocyten te isoleren.
	<ol>
		<li>Laat de hartstukken bezinken. Vervang de PBS-P/S met 10 mL van 0.15% trypsine in PBS en schud bij 37 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg. Herhaal de vertering beschreven in stap 2.2.1 nog drie keer, maar decant de supernatanten in 50-mL opvangbuizen met 10 mL 100% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugeer de cellen (400 x g, 5 min) en zuig het supernatant af. Resuspendeer de cellen in DMEM-F12 bevattend 10% FBS en 1% P/S en zaai op een 6-well plaat (1 x 105 cellen/cm2, 2 mL medium per putje).</li>
	<li>Na 1 h, breng het medium met niet-aanhechtende cellen over naar een 50-mL buis en gooi de aangehechte cellen weg. Tel de cellen in suspensie en plateer ze opnieuw in nieuwe 6-well platen (1 x 105 cellen/cm2, 2 mL van DMEM-F12 bevattend 10% FBS en 1% P/S per putje).</li>
	<li>Rem celproliferatie met bromodeoxyuridine (BrdU). 
	Opgelet: BrdU is een sterk teratogeen en vermoedelijke mutageen. Zorg ervoor dat adequate training is gegeven en raadpleeg de veiligheidsinformatieblad voor gebruik.
	<ol>
		<li>Zodra cellen zich hebben gehecht, vervang het medium in de 6-well plaat met DMEM-F12 bevattend 10% FBS, 1% P/S (2 mL medium per putje), en 5 µM BrdU. Incubeer gedurende 16 h (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Verwijder het BrdU-bevattend medium en vervang met DMEM-F12 bevattend 10% FBS en 1% P/S (2 mL medium per putje).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid vooraf gekleurde MSCs.
	<ol>
		<li>Zodra MSC-culturen bij 70-80% confluency in 10-cm schalen zijn, verwijder het kweekmedium en voeg 3 mL celdissociatie-oplossing toe. Incubeer de schaal bij 37 °C

Dr. Clifford L. Librach is medehouder van het octrooi: methoden van isolatie en het gebruik van cellen die zijn afgeleid van de eerste trimester navelstreng weefsel, verleend in Canada en Australië.

De cardiale differentiatie van stamcellen is in ontwikkeling voor meer dan 2 decennia, met meerdere verschillende strategieën wordt gebruikt voor het genereren van cardiomyocyte-achtige cellen uit MSC bronnen. Veel van deze strategieën, echter zijn inefficiënt, en de voorwaarden gebruikt zijn vaak niet representatief voor het milieu getransplanteerde cellen ontmoeting in vivo.
In tegenstelling tot de bestaande methoden, het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een combinatie...

Congestief hartfalen (CHF) blijft bestaan als een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CHF treedt vaak op na het massale verlies van cardiomyocytes en de ontwikkeling van cel-vrije littekenweefsel als gevolg van een myocardinfarct (MI)1pathologische. Terwijl het hart een gedeeltelijk zichzelf vernieuwende orgaan is, vermindert de resident stam en progenitor cel pool verantwoordelijk voor de uitvoering van weefselregeneratie aanzienlijk in overvloed en functie in leeftijd patiënten, vaak steeds onvoldoende voor optimaal herstel na blessure. Er is dus grote belangstelling bij de ontwikkeling van experimentele behandelingen waarbij de transplantatie van cellen van de gezonde donor in het beschadigde myocardium. Het is noodzakelijk dat de donor cellen niet alleen de structuur van het weefsel herstellen, maar ook het bereiken van het functionele herstel van de getroffen myocard.
De inheemse hart hart weefsel-ingezetene werkzaam en endogene afkomstig is van het beenmerg cellen van de stam voor na letsel herstellen2,3,4. Regeneratieve cellen-host - en donor-afgeleide gelijk moet hebben de capaciteit om het verkrijgen van de juiste fenotype en functie in de communicatie van de remodelleert myocard, samen met het vermogen om efficiënt en veilig de verloren cellen vervangen. In vitro differentiatie methoden hebben is gebruikt uitgebreid tot hoogrenderende, stamcel gebaseerde cardiomyocyte productie5,6. Het profiel van de expressie van cardiale lineage markers wordt gebruikt voor het definiëren van het proces van differentiatie van de stamcel naar de cardiale lineage7. Vroege differentiatie markers, zoals NKX2.5, myocyte versterker factor 2 C (Mef2c), en GATA48,9, kunnen een indicatie van de opening van het cardiomyogenic-proces. Volwassen cardiomyocyte markeringen gebruikte om differentiatie effectiviteit te beoordelen zijn signaal regelgevende proteÃ¯ne α (SIRPA)10, cardiale troponine T (cTnT)11, zware ketting cardiale myosin (MYH6),8,,12,13en connexin 43 (Cx43)14,15,16. De methoden gebruiken van embryonale stamcellen (SER's) en pluripotente stamcellen (PSC's) zijn grondig geoptimaliseerd en besproken met betrekking tot de details van de inductieve factoren, zuurstof en voedingsstoffen verlopen, en de exacte timing van actie5,6,7,17,18. ESC - en PVC-gebaseerde technologieën presenteren echter nog steeds meerdere ethische en veiligheid zorgen, samen met suboptimaal elektrofysiologische en immunologische functies19,20. Hosts getransplanteerde met deze cellen vaak ervaren immunorejection en permanente immuunsuppressie vereisen. Dit is voornamelijk te wijten aan de grote histocompatibility complex (MHC) moleculen in de gastheer en de donor en de resulterende T-cel reactie21mismatching. Terwijl individuele MHC klasse I matching is een mogelijke oplossing, een toegankelijker klinische praktijk zou vereisen een cel bron die universeel immunoprivileged te overwinnen van de bezorgdheid van de afwijzing.
Als een bron van alternatieve cel voor gebruik in klinische toepassingen, MSCs en in het bijzonder, BMSCs, zijn onderzocht voor gebruik in weefselregeneratie sinds hun initiële beschrijving in 199522. MSCs worden verondersteld om ingezetene regeneratieve cellen die worden in bijna elke gevacuoliseerd weefsel23 gevonden kunnen. Bij isolatie van de gewenste bron, MSCs kunnen gemakkelijk worden uitgebreid in cultuur, hebben uitgebreide paracrine capaciteit, en vaak immunoprivileged of immunomodulerende eigenschappen24,25te bezitten. Hun veiligheid en de werkzaamheid hebben reeds te zien in verscheidene pre-klinische studies, met name voor cardiale regeneratie3,26.
Veel MSC differentiatie strategieën gebruik maken van farmacologische stoffen, zoals 5-azacytidine22 en DMSO27, en groei of morfogenisch factoren, zoals BMP's5,7,28,29 of angiotensine-II30, met variabele efficiëntie. Deze strategieën, zijn echter niet gebaseerd op de obstakels die een naïeve regeneratieve cel is waarschijnlijk tegenkomen na homing of wordt geleverd aan de site van letsel in vivo. Meer fysiologisch relevante strategieën, terwijl moeilijker te definiëren en manipuleren, zijn gebaseerd op de vooronderstelling dat MSC differentiatie kan worden opgewekt door middel van signalen uit het weefsel communicatie zelf. Eerdere studies hebben aangetoond dat de blootstelling aan de cardiale cel lysates31 of ventriculaire myocard32,33, of rechtstreeks contact met primaire cardiomyocytes in vitro15,34, kan de expressie van cardiale markers in MSCs verhogen. Anderen hebben aangetoond dat spontane cardiomyogenesis na behandeling van cardiale letsel met MSCs35,36,,37,38, hoewel gedeeltelijk, de fusie van BMSCs en cardiomyocytes39,40 het ontluikende myocardium gegenereerd. Om onze kennis, hebben functionele, spontaan aanbestedende cardiomyocytes van menselijke MSCs (hMSCs) van elke bron weefsel nog niet is gerapporteerd.
De huidige consensus is dat alle MSCs uit gerelateerde cellen23 voortvloeien. Young MSCs met pericyte eigenschappen kunnen worden geïsoleerd uit de regio gerelateerde van menselijke navelstreng weefsel41,42,43. In vergelijking met BMSCs bezitten HUCPVCs meer differentiatie potentiële en verschillende andere regeneratieve voordelen, zowel in vitro41,44 en in vivo45,46,47. Met name hebben de bron wordt de moeders-foetale interface, HUCPVCs aanzienlijk lager immunogeniciteit in vergelijking met volwassen bronnen van MSCs. Ons onderzoek richt zich op de karakterisering en de pre-klinische toepassingen van FTM HUCPVCs, de jongste bron van MSCs onderzocht, die wij hebben eerder getoond te zijn toegenomen proliferatieve en hogere multilineage differentiatie capaciteiten, met inbegrip van de cardiomyogenic afstamming41.
Hier presenteren we een protocol die totale vorming en primaire cardiale cel feeder lagen combineert zoals inductieve krachten te bereiken van de differentiatie van de volledige cardiomyogenic van MSCs. aggregaten leveren een 3D-omgeving, die beter voorwaarden in vivo in vergelijking met 2D aanhangend culturen modellen. Met behulp van cardiale feeder lagen biedt een omgeving die representatief is voor de site van de ultieme transplantatie voor de MSCs. We laten zien dat jongere bronnen van MSCs geïsoleerd van pre- of postnatale umbilical koorden een hogere capaciteit formulier aggregaten en hebben te bereiken van de cardiale fenotype in vergelijking met volwassen BMSCs, terwijl nog het handhaven van hun immuun-voorrecht. Naast de steile verhoging van markers van cardiale bloedlijn en de geïnduceerde expressie van intracellulaire (dat wil zeggen, cTnT en MYH6) en celoppervlak eiwitten (dat wil zeggen, SIRPA en Cx43) specifiek voor cardiomyocytes, we laten zien dat het potentieel van de differentiatie van FTM HUCPVCs met deze methode kan worden aangewend en dat zij aanleiding geven kunnen tot spontaan verdragsluitende cardiomyocyte-achtige cellen.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Voor celafsplitsing</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Voor HUCPVC- en BMSC-kweekmedia.</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd anti-human/muis CD49f-antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Integrine marker voor FC</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd menselijk Cx43/GJA1-antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>Connexin 43 marker voor FC</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd HLA-A2-antilichaam</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Immunogeen marker voor FC</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-HLA-G [MEM-G/9]-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>Immunogeen marker voor FC</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd muis anti-menselijk SIRPA/CD172a-antilichaam</td><td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Cardiac marker voor FC</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd menselijk TRA-1-85/CD147-antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Menselijk celmarker voor FC en FACS</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd menselijk TRA-1-85/CD147-antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Menselijk celmarker voor FC en FACS</td></tr><tr><td>Anti-connexin 43/GJA1-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Voor ICC</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG (H+L) gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Voor ICC</td></tr><tr><td>Anti-sarcomeer alfa actinine [EA-53]-antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Voor ICC</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgM zware ketting gekruist geabsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>Voor ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP konijnantilichaam</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Voor ICC</td></tr><tr><td>Ezel anti-konijn IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Voor ICC</td></tr><tr><td>Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1)-antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Voor ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Voor beeldvorming van aggregaten.</td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge microbuisjes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Voor het kleuren van MSC's met fluorescerende kleurstof.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Open source beeldverwerkingssoftware.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor celafscheiding.</td></tr><tr><td>Botserum mesenchymale stromale cellen</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>BMSC's</td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. Om oplossingen voor ICC te bereiden</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Let op: BrdU is een sterke teratogeen en vermoedelijke mutageen. Zorg ervoor dat u de juiste training heeft en raadpleeg de SDS voor gebruik.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor flowcytometrie.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Voor de bereiding van cDNA voor qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA-kleurstof</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Fluorescente beeldvorming van celcytoplasma</td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Voor ratten primaire cardiomyocytenkweekmedium.</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>D-PBS, zonder Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Fluorescente microscoop in huis</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>In huis. Voor flowcytometrie.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Component van celkweekmedium.</td></tr><tr><td>IDT Prime Time qPCR-sondes</td><td>Integrated Data Technologies</td><td>FAM fluorofoor</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Voor opslag van cellen die ICC ondergaan</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor flowcytometrie.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Voor celafscheiding.</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5425S</td><td>NGS. Gebruikt in blokkeeroplossing voor ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Om monsters voor ICC te bereiden</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100-oppervlakteactieve stof</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Als onderdeel van de permeabiliseringsoplossing bij het voorbereiden van cellen voor ICC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% oplossing, EM-kwaliteit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Voor het fixeren van cellen voor ICC.</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Component van celkweekmedium.</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sigma</td><td>Aangepaste standaard DNA-oligo's, ontzoutd, 0,2 &mu;mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum Spinning Disk Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio hiPS-cel afgeleide cardiomyocyten</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Positieve controle voor qPCR</td>

in vitro differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele cardiomyocyte-achtige cellen

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardinfarct en de daaropvolgende ischemische cascade resulteren in de uitgebreide verlies van cardiomyocytes, wat leidt tot congestief hartfalen, de belangrijkste oorzaak van kindersterfte wereldwijd. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een veelbelovende optie voor cel-gebaseerde therapieën ter vervanging van de huidige, invasieve technieken. MSCs kunnen onderscheiden in mesenchymale lineages, met inbegrip van de soorten van de cardiale cellen, maar volledige differentiatie in functionele cellen nog niet is bereikt. Vorige methoden van differentiatie waren gebaseerd op farmacologische agenten of groeifactoren. Meer fysiologisch relevante strategieën kunnen echter ook MSCs cardiomyogenic transformatie ondergaan. Hier presenteren we een methode van de differentiatie met MSC aggregaten op cardiomyocyte feeder lagen cardiomyocyte-achtige aanbestedende cellen produceren.
Menselijke navelstreng gerelateerde cellen (HUCPVCs) is gebleken dat een grotere differentiatie potentiële dan vaak onderzocht MSC typen, zoals beenmerg MSCs (BMSCs). Als een ontogenetisch jongere bron onderzochten we de mogelijkheden van de cardiomyogenic van eerste-trimester (FTM) HUCPVCs in vergelijking met oudere bronnen. FTM HUCPVCs zijn een roman, rijke bron van MSCs die hun in utero immunoprivileged eigenschappen behouden wanneer gekweekt in vitro. Met behulp van dit protocol van de differentiatie, de FTM en de term bereikt HUCPVCs aanzienlijk verhoogde cardiomyogenic differentiatie ten opzichte van BMSCs, zoals aangegeven door de verhoogde expressie van cardiomyocyte markers (dat wil zeggen, myocyte versterker factor 2 C, cardiale troponine T, zware ketting cardiale myosin, signaal regelgevende proteÃ¯ne α en connexin 43). Ze onderhouden ook aanzienlijk lager immunogeniciteit, zoals blijkt door hun lagere HLA-A expressie en hogere HLA-G expressie. Toepassing van differentiatie aggregaat gebaseerde, toonde FTM HUCPVCs verhoogde totale vorming potentiële en gegenereerde verdragsluitende cellen clusters binnen 1 week na co cultuur op cardiale feeder lagen, steeds de eerste MSC-type te doen.
Onze resultaten tonen aan dat deze strategie van de differentiatie effectief van het potentieel van de cardiomyogenic van jonge MSCs, zoals FTM HUCPVCs benutten kan, en dat in vitro pre differentiatie zou een mogelijke strategie suggereert te vergroten hun regeneratieve werkzaamheid in vivo.

HUCPVCs vertonen een hoger potentieel voor aggregaatvorming en hogere expressieniveaus van CD49f vergeleken met BMSCs:
Om de differentiatie van hMSC's (d.w.z. FTM HUCPVC's, term HUCPVC's en BMSC's) te induceren, werden enkelcel-suspensies van ongedifferentieerde MSC's of MSC-bevattende hanging drops (Tabel 1) overgebracht op monolagen van primaire cardiomyocyten van ratten om respectiev...

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is het induceren en observeren van de cardiomyogene inductie van mesenchymale stamcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mesenchymale stamcel, zoals welke remedies kunnen worden geïnduceerd door omgevingssignalen om functionele cardiomyocyten te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van aggregaatvorming en foetale hartlagen, in plaats van farmacologische middelen of genetisch materiaal.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hart- en vaatziekten, omdat het nader ingaat op het cardiomyogene potentieel van mesenchymale stamcellen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door mij, Miss Farwah Iqbal, een PhD-student van ons laboratorium, Max Librach en Nadav Gasner, beiden stagiaires van ons laboratorium. Nadat de onderdelen van de rattenpup zijn geïsoleerd volgens het tekstprotocol, snijdt u de ventrikels doormidden en brengt u deze over naar een schaal van 10 centimeter met 10 milliliter PBS en pinstripe op ijs, om het bloed weg te spoelen.Knip vervolgens met een gebogen schaar de ventrikelwanden in kleine stukjes met een diameter van twee tot drie millimeter. Breng met een serologische pipette de hartstukjes van 10 tot 12 dieren over naar een buis van 50 milliliter en laat ze bezinken. Verwijder zoveel mogelijk PBS P/S zonder daarbij hartstukjes te verwijderen.Voeg vervolgens 10 mm vers PBS P/S toe. Om de cardiomyocyten te isoleren, wordt na het bezinken van de hartstukjes het PBS P/S vervangen door 0,15% trypsine in PBS, waarna het weefsel 10 minuten lang wordt geïncubeerd bij 37 °C onder schudding. Verwijder het supernatant.Herhaal vervolgens de trypsinevertering nog drie keer, maar schenk de supernatanten af in opvangbuisjes van 50 milliliter die 10 milliliter 100%FBS bevatten. Centrifugeer daarna de buisjes met cellen en aspireer het supernatant. Gebruik vervolgens DMEM-F12 met 10%FBS en 1%P/S om de cellen te resuspenderen en zaai deze uit op een zeswellplaat.Zodra de cellen zijn gehecht, wordt het medium vervangen door twee milliliters vers medium. Om vooraf gekleurde MSC's voor te bereiden, wordt het medium verwijderd uit MSC-culturen die een confluentie van 70% tot 80% hebben bereikt in 10 centimeter schalen, waarna drie milliliters cel-dissociatie-oplossing wordt toegevoegd. Incubeer de schalen bij 37 degree celsius en 5%carbon dioxide gedurende vijf minuten.Breng de gedissocieerde cellen over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze 5 minuten bij 400 x G. Aspireer het supernatant zonder de celpellet te verstoren en resuspendeer de cellen. Gebruik vervolgens een automatische celteller om de cellen te tellen.Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 10⁶ MSC's per milliliter in DMEM-F12 met 10% FBS en 1% P/S. Voeg vervolgens aan de cellen in 1,5 milliliter centrifugebuisjes een levensvatbare, niet-overdraagbare fluorescente kleurstof toe en incubeer de MSC's gedurende een half uur. Centrifugeer de buisjes vervolgens 5 minuten bij 400 ×g, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet tot een concentratie van 1 x 10⁶ MSC's per milliliter.Breng vervolgens de MSC's over naar de cardiomyocyten met een concentratie van 10 x 10⁴ cellen per putje van de zes-putjesplaat. Bereid voor het maken van aggregaat-coculturen een suspensie van enkelvoudige MSC-cellen in alpha MEM, aangevuld met 10% FBS en 1% P/S. Start de vorming van aggregaten door druppels van 25 µL van de cel-suspensie op het binnenoppervlak van de deksels van 10 cm weefselkweekschalen te plaatsen.Plaats de deksels op de overeenkomstige bodems die PBS P/S bevatten. Incubeer de schaaltjes bij 37 degree celsius en 5%carbon dioxide. Observeer na drie dagen onder een stereomicroscoop de vorming van aggregaten in de druppels.Als in meer dan 80% van de druppels aggregaten zijn gevormd, gebruik dan een micropipet van één milliliter om de druppels van de deksels te verzamelen en breng de aggregaten direct over op primaire monoculturen van rat cardiomyocyten. Incubeer de aggregaat-coculturen tot twee weken. Vervang elke 72 uur het volledige volume medium.Gebruik dagelijks lichtveldmicroscopie om aggregaten te observeren die zich hechten aan foetale cellagen. Registreer samentrekkende aggregaten zodra deze worden waargenomen. De actieve aggregaten trekken synchroon samen, wat wijst op een geleidbaarheid tussen hen door de foetale laag, die zelf geen fysieke activiteit vertoont.Aspireer het medium en voeg twee milliliter PBS per well van de zes-wells plaat toe. Verwijder vervolgens de PBS en voeg twee milliliter dissociatie-oplossing per well toe. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende drie minuten.Zoals hier getoond, vertoonden HMSCs van drie verschillende typen een vergelijkbare abundantie en verschijning in directe co-culturen. Twee tot drie dagen na het overbrengen van hangende druppels op hartcellen in aggregaat co-culturen, verschenen FTMs en term huck PBCs in grotere aggregaten vergeleken met die van BMSCs. In dit experiment toonde flowcytometrische analyse van CD49F-expressie in ongedifferentieerde MSCs aan dat 96% van de FTM huck PBCs, 89% van de huck PBCs en 53% van de BMSCs positief waren voor het celoppervlakte-eiwit CD49F.Flowcytometrie op TRA won 85-cellen toonde een upregulatie van de met cardiomyocyten geassocieerde marker, SIRPA, aan in FTM huck PBC's en term huck PBC's, maar niet in BMSC's uit directe co-culturen met cardiomyocyten. Zoals hier te zien is, was de upregulatie van cx43 significant hoger in FTM huck PBC's vergeleken met term huck PBC's of BMSC's in directe co-culturen. Fluorescentiemicroscopische analyse onthulde dat differentiërende FTM- en term huck PBC's beide een upregulatie van cx43 vertoonden.Bij term-huck PBC's was het aandeel hoger dan bij FTM's. Fluorescentiemicroscopie onthulde echter dat cx43-positieve puncta werden waargenomen in het celmembraan van FTM-huck PBC's, terwijl deze in term-cellen overwegend cytoplasmatisch waren. Ten slotte, zoals hier te zien is, werd fluorescentiemicroscopie met hoge vergroting uitgevoerd op gesorteerde menselijke cellen na co-cultivatie, waarbij de hoge abundantie van cx43 in het plasmamembraan werd bevestigd.Zodra de methode onder de knie is, kunnen de belangrijkste stappen van deze procedure each in één uur worden voltooid, mits deze correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om aseptische voorzorgsmaatregelen in acht te nemen. De gebruikte primaire dierlijke weefsels kunnen namelijk contaminatie veroorzaken als ze niet correct worden behandeld.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals verdere cultivering van samentrekkende aggregaten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de levensduur van deze structuren. Na de ontwikkeling stelt deze techniek onderzoekers in het veld van MSC's in staat om het differentiepotentieel van jongere bronnen van mesenchymale stamcellen te verkennen, zoals extra-embryonaal weefsel. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u MSC-aggregaten bereidt en deze combineert met directe primaire foetale weefsellagen, op een wijze die een juiste inductie voor cardiomyogene differentiatie biedt.Vergeet niet dat het werken met BRDU extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals de juiste verwerking van cytotoxisch afval.

in-vitro-differentiation-human-mesenchymal-stem-cells-into-functional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.

In vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen (MES) cellen met behulp van de Opknoping neerzetten

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Het genereren van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen in vitro biedt toegang tot grote hoeveelheden hartweefsel in vitro voor fundamentele wetenschappen en klinische toepassingen. Dit protocol gebruikt de atrialiserende factor Grem2 om zowel het aantal verkregen cardiomyocyten te verhogen als om cardiomyocyten met een atriumfenotype te genereren.

Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.

Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Leer cardiomyogene differentiatie van mesenchymale stamcellen via omgevingsignalen en aggregaatvorming. Deze methode biedt een alternatief voor farmacologische benaderingen bij hartziekteonderzoek.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Meer video's verkennen