In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de cardiomyogene inductie van mesenchymale stamcellen te induceren en waar te nemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van mesenchymale stamcellen, zoals welke remedies kunnen worden geïnduceerd door omgevingssignalen om functionele cardiomyocyten te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het aggregatenvorming en cardiale foetale lagen toepast, in plaats van farmacologische middelen of genetisch materiaal.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van hart- en vaatziekten omdat het ingaat op het cardiomyogene potentieel van mesenchymale stamcellen. Het demonstreren van deze procedure met mij zal zijn, Miss Farwah Iqbal, een promovenda van ons laboratorium, Max Librach en Nadav Gasner, beide stagiaires van ons laboratorium. Na het isoleren van rattenpopjes volgens het tekstprotocol, snijd de ventriculi doormidden en breng ze over naar een 10 centimeter schaal met 10 milliliters PBS en pinstripe op ijs, om het bloed weg te laten spoelen.

Gebruik vervolgens gebogen schaar om de ventrikelwanden in kleine stukken met een diameter van twee tot drie millimeter te snijden. Gebruik een serologische pipet om de hartstukken van 10 tot 12 dieren over te brengen naar een 50 milliliter buis en laat ze bezinken. Verwijder zoveel mogelijk PBS P/S, zonder hartstukken te verwijderen.

Voeg vervolgens 10 millimeter vers PBS P/S toe. Om de cardiomyocyten te isoleren, gebruik na het bezinken van de hartstukken, 0,15% trypsine in PBS, om het PBS P/S te vervangen en incubeer het weefsel bij 37 graden Celsius met schudden, gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg.

Herhaal vervolgens de trypsine vertering nog drie keer, behalve, centrifugeer de supernatanten in 50 milliliter verzamelbuizen met 10 milliliters van 100%FBS. Centrifugeer vervolgens de celbuizen en zuig de supernatant op. Gebruik vervolgens DMEM-F12 met 10%FBS en 1%P/S om de cellen te resuspenderen en ze op een zes puttenplaat te zaaien.

Zodra de cellen zich hebben gehecht, vervang het medium met twee milliliter vers medium. Om voorgekleurde MSC's voor te bereiden, verwijder het medium van MSC-culturen die 70% tot 80% confluency hebben bereikt in 10 centimeter schalen en voeg drie milliliter celdissociatieoplossing toe. Incubeer de schalen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende vijf minuten.

Breng de gedissocieerde cellen over naar een 15 milliliter buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 400 x G. Zuig de supernatant op zonder het cellenpellet te verstoren en resuspendeer de cellen. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen.

Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 10 tot de zesde MSC's per milliliter, in DMEM-F12 met 10%FBS en 1%P/S. Voeg vervolgens aan de cellen in 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes levensvatbare, niet-overdraagbare fluorescente kleurstof toe en incubeer de MSC's gedurende een half uur. Na centrifugering van de buisjes gedurende vijf minuten bij 400 x G, zuig de supernatant op en resuspendeer het pellet op een concentratie van 1 x 10 tot de zesde MSC's per milliliter.

Breng vervolgens de MSC's over op cardiomyocyten met een concentratie van 10 x 10 tot de vierde cellen per put van de zes puttenplaat. Om aggregate co-cultures te maken, bereid een enkele celsuspensie van MSC's in alfa MEM, aangevuld met 10%FBS en 1%P/S. Start de aggregatenvorming door 25 microliter druppels celsuspensie op het binnenoppervlak van de deksels van 10 centimeter weefselcultuurschalen te plaatsen.

Plaats de deksels op hun onderdelen die PBS P/S bevatten. Incubeer de schalen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Observeer aggregatenvorming in de druppels na drie dagen onder een stereomicroscoop.

Als meer dan 80% van de druppels gevormde aggregaten bevatte, gebruik een micropipet van één milliliter om de druppels van de deksels te verzamelen en breng de aggregaten direct op primaire rat cardiomyocyten monolagen over. Incubeer de aggregate co-cultures gedurende maximaal twee weken. Ververs het volledige volume medium elke 72 uur.

Gebruik dagelijks helderveldmicroscopie om aggregaten te observeren die zich hechten aan foetale cellagen. Neem contracterende aggregaten op wanneer ze worden waargenomen. De actieve aggregaten samentrekken op een gesynchroniseerde manier, we suggereren een geleiding tussen hen door de foetale laag, die geen fysieke activiteit heeft.

Zuig het medium op en voeg twee milliliter PBS toe per put van de zes puttenschaal. Verwijder vervolgens de PBS en voeg twee milliliter dissociatieoplossing toe per put. Incubeer de schalen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende drie minuten.

Zoals hier getoond, vertoonden HMSC's van drie verschillende typen een vergelijkbare abundantie en uiterlijk in directe co-cultures. Twee tot drie dagen na het overbrengen van hangende druppels naar hartcellen in aggregate co-cultures, verschenen FTM's en term huck PBC's in grotere aggregaten vergeleken met die van BMSC's. In dit experiment toonde flowcytometrische analyse van CD49F expressie in ongedifferentieerde MSC's aan dat 96% van FTM huck PBC's, 89% van huck PBC's en 53% van BMSC's positief waren voor celoppervlakte CD49F.

Flowcytometrie op TRA won 85 cellen, toonde de upregulatie van de cardiomyocyte geassocieerde marker, SIRPA in FTM huck PBC's en term huck PBC's, maar niet in BMSC's uit directe cardiomyocyte co-cultures. Zoals hier te zien is, was cx43 upregulatie significant hoger in FTM huck PBC's vergeleken met term huck PBC's of BMSC's in directe co-cultures. Fluorescerende microscopie analyse onthulde dat differentiërende FTM en term huck PBC's beide cx43 upreguleerden.

Met term huck PBC's in een hoger aandeel dan FTM's. Fluorescerende microscopie onthulde echter dat cx43 positieve puncta werden waargenomen in het celmembraan van FTM huck PBC's en ze waren overwegend cytoplasma