Effecten van allogene Platelet-Rich Plasma (PRP) op het genezingsproces van verdeelde Achilles pezen voor ratten: een methodologische beschrijving

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van een enkele injectie van bloedplaatjesrijk plasma, of PRP, te observeren op het herstelproces en de resistentie van chirurgisch doorgesneden achillespezen bij ratten op verschillende tijdstippen. Deze methode kan helpen bij het snel beantwoorden van vragen binnen het musculoskeletale vakgebied over peeslaesies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de chirurgische, biomechanische en PRP-progressieprocedures goed gestandaardiseerd zijn.

De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot het gebruik van PRP bij mensen, aangezien dit type laesie en het proces van peesgenezing bij ratten en mensen vergelijkbaar zijn. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de PRP-bereiding voor musculoskeletale letsels, kan deze injectietechniek ook worden toegepast op andere systemen, zoals hart- of huidaandoeningen. Een visuele demonstratie van de methode is zeer belangrijk, omdat chirurgische en biomechanische stappen een consistente reproduceerbaarheid vereisen om optimale resultaten te behalen.

Begin met het wegen en het voorzien van een oormerk bij de rat. Nadat het passende sedatieniveau via een teenknijptest is bevestigd, worden waterdruppels op de hoornvliezen van het dier aangebracht en wordt het haar van het linkerachterpoot verwijderd. Desinfecteer de blootgestelde huid met een 1:10 verdunning van iso-Betadine-oplossing en plaats het dier in zijligging op een verwarmingsmat van 20 graden Celsius onder een dissectiemicroscoop, waarbij het linkerachterpoot zich in superieure positie bevindt.

Pak de poot van het linker achterlid vast met een pincet en maak een laterale huidincisie van 20 tot 25 millimeter rond de achillespees. Disseceer de fascia met een fijne schaar om het achillespeescomplex bloot te leggen en verwijder de plantarispees. Snijd de achillespees transversaal door, vijf millimeter proximaal van de calcaneale aanhechting, en verwijder een gedeelte van vijf millimeter lang.

Gebruik vervolgens resorbeerbaar hechtmateriaal en zet voort met het hechten om de fascie en de huid te sluiten, en plaats de rat onder een warmtebron met monitoring tot volledig herstel. Terwijl de ontvangende dieren herstellen, verzamel je 20 milliliters volbloed uit één donorrat-hart per experimenteel dier in individuele buisjes met 3,2% gebufferd natriumcitraat. Om het plaatjesrijk plasma te verkrijgen, centrifugeer je het bloed en gebruik je een plastic transferpipet om de bovenste PRP-bevattende fase voorzichtig te oogsten in een tweede plastic buisje.

Bepaal het volume van het verzamelde PRP en meet het aantal bloedplaatjes met een hematologie-analyzer. Centrifugeer het PRP opnieuw en breng het supernatant voorzichtig over naar een nieuwe plastic buis. Het resterende volume in de PRP-buis moet ongeveer 2/3 zijn van het volume dat nodig is om 2,5 × 10⁶ bloedplaatjes per microliter te bereiken.

Resuspendeer vervolgens voorzichtig het plaatjespellet door middel van pipetteren. Meet het aantal bloedplaatjes van dit geconcentreerde plaatjesrijk plasma en voeg indien nodig het juiste volume autoloog plaatjesarm plasma toe om de doelconcentratie te bereiken. Activeer de bloedplaatjes met 50 µL calciumchloride per milliliter PRP gedurende ongeveer één uur bij kamertemperatuur.

Laad vervolgens de bloedplaatjes in een spuit van één milliliter die is uitgerust met een naald van 21 gauge en injecteer 50 µL van de bloedplaatjes direct in de hechtingsplaats van elk dier. Bij het juiste experimentele eindpunt scheert u het linker achterbeen van het geanestheseerde proefdier en plaatst u de rat onder een dissectiemicroscoop zoals zojuist gedemonstreerd. Houd de poot met de vingers vast en maak een incisie van 10 mm in de chirurgische plaats om de musculus triceps suralis bloot te leggen.

Om de achillespees te verwijderen, snijdt u het hielbeen (calcaneus) transversaal door, vijf tot 10 millimeter distaal van het aanhechtingspunt, en dissekeert u een stuk van de musculus triceps surae dat groot genoeg is om in de cryo-bek te passen. Gebruik een pincet om het monster direct in de bovenbek van de cryo-bek te plaatsen en sluit het instrument. Plaats de cryo-bek verticaal in een universele trekbank en fixeer het hielbeen tussen de onderste klemmen.

Om de dwarsdoorsnede te berekenen, worden de camera's loodrecht op elkaar geplaatst. Voeg vloeibare stikstof toe aan beide bekkens van de bovenkaak om de spier tot een grootteorde stijver te bevriezen dan de pees, zodat deze tijdens de trekproef niet vervormt. Wanneer de vrieszone de rand van de metalen klem bereikt, wordt de verplaatsingssnelheid van de machine ingesteld op een constante snelheid van 1 mm per seconde tot aan breuk, waarna de trekproef wordt gestart en de maximale treksterkte in Newtons met een computer wordt geregistreerd.

Om rekening te houden met verschillen in de dwarsdoorsneden van de genezende pezen, dient de maximale treksterkte te worden genormaliseerd naar een eenheidsoppervlak dat de mechanische spanning vertegenwoordigt die het weefsel ondergaat. Wanneer de pees vervolgens scheurt, moeten de gescheurde peesmonsters direct worden ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard worden bij -80 °C tot aan de RNA-extractie en RTPCR-analyse. In dit representatieve experiment was er op elk getest tijdstip een grotere kracht nodig om peesscheuring op te wekken in de PRP-geïnjecteerde groep dan in de controlegroep die met zoutoplossing was behandeld, wat wijst op een robuuster genezingsproces of betere mechanische eigenschappen bij de PRP-behandelde dieren.

Hoewel de PRP-groep een grotere intra-groepsspreiding vertoonde dan de zoutoplossingsgroep, werd vastgesteld dat de dwarsdoorsnede van de pezen groter was in de groep met PRP-injecties op dag 15 en 30 na het opwekken van de laesie. Verder onthulde Masson's trichroomkleuring een hogere aanwezigheid van fibrillair collageen, een sleutelcomponent in de morfologie en sterkte van pezen, bij PRP-behandelde dieren op dag 5 en 15, waarbij op dag 30 na injectie een vergelijkbare kleuringsintensiteit in beide groepen werd waargenomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u standaard laesies bij ratten opwekt en hoe u de pees bemonstert om het genezingsproces na een PRP-injectie te evalueren.