Effecten van allogene Platelet-Rich Plasma (PRP) op het genezingsproces van verdeelde Achilles pezen voor ratten: een methodologische beschrijving

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van een enkele injectie van Platelet-Rich Plasma, of PRP, te observeren op de weerstand en het genezingsproces van chirurgisch gesneden Achillessnerven van ratten op verschillende tijdstippen. Deze methode kan helpen snelle vragen in het musculoskeletale veld over peeslaesies te beantwoorden. Het grote voordeel van deze techniek is dat de chirurgische, biomechanische en PRP-voortgangsprocedures goed gestandaardiseerd zijn.

De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot het gebruik van PRP bij mensen, omdat deze soorten laesies en het genezingsproces van pezen vergelijkbaar zijn tussen ratten en mensen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in PRP-voorbereiding voor musculoskeletale verwondingen, kan deze injectietechniek ook worden toegepast op andere systemen, zoals hart- of huidaandoeningen. Visuele demonstratie van de methode is erg belangrijk, omdat chirurgische en biomechanische stappen consistente reproduceerbaarheid vereisen om optimale resultaten te verkrijgen.

Begin met het wegen en oormerken van de rat. Na bevestiging van het juiste niveau van sedatie door het knijpen in de teen, breng waterdruppels aan op de oogleden van het dier en verwijder het haar van de linker achterpoot. Desinfecteer de blootgestelde huid met een verdunning van 1 op 10 van iso-Betadine-oplossing en plaats het dier op een verwarmingskussen van 20 graden Celsius onder een dissectiemicroscoop in de laterale rugligging, met de linker achterpoot in de superieure positie.

Pak de poot van de linker achterpoot met een pincet en maak een laterale huidincisie van 20 tot 25 millimeter rond de Achillessnerv. Gebruik fijne schaar om de fascia te disseceren om de Achillessnervcomplex te ontbloten en verwijder de plantarische pees. Snijd de Achillessnerv dwars, vijf millimeter proximaal van de calcaneale insertie, en verwijder een vijf millimeter lange portie.

Gebruik vervolgens resorbeerbaar garen en ga verder met het sluiten van de fascia en de huid met hechtingen, en plaats de rat onder een warmtebron met bewaking tot volledige herstel. Terwijl de ontvangende dieren herstellen, verzamel 20 milliliter vol bloed van één donorrattenhart per experimenteel dier in afzonderlijke buisjes met 3,2% gebufferde natriumcitraat. Om het trombocytenrijke plasma te verkrijgen, centrifugeert u het bloed en gebruikt u een plastic overdrachtspijp om voorzichtig de bovenste PRP-bevattende fase in een tweede plastic buis te verzamelen.

Bepaal het volume van het verzamelde PRP en meet het trombocytenaantal op een hematologie-analysator. Centrifugeer het PRP opnieuw en breng de supernatant voorzichtig over in een nieuwe plastic buis. Het resterende volume in de PRP-buis moet ongeveer 2/3 van het volume zijn dat nodig is om 2,5 keer 10 tot de zesde trombocyten per microliter te bereiken.

Schors vervolgens voorzichtig het trombocytenpellet met pipetten. Meet het trombocytenaantal van dit geconcentreerde trombocytenrijke plasma en voeg indien nodig het juiste volume autoloog trombocytenarm plasma toe om de doelconcentratie te bereiken. Activeer de trombocyten met 50 microliter calciumchloride per milliliter PRP gedurende ongeveer een uur op kamertemperatuur.

Laad vervolgens de trombocyten in een enkele milliliter spuit uitgerust met een 21-gauge naald en injecteer 50 microliter van de trombocyten rechtstreeks in de hechtingsplaats van elk dier. Op het juiste experimentele eindpunt, scheer de linker achterpoot van het geanesthetiseerde experimentele dier en plaats de rat onder een dissectiemicroscoop zoals net gedemonstreerd. Houd de poot met vingers vast, maak een 10-millimeter incisie in de chirurgische plaats om de triceps suralis bloot te leggen.

Om de Achillessnerv te verwijderen, snijdt u het calcaneale bot dwars, vijf tot 10 millimeter distaal van de bevestiging en dissecter een stuk van de triceps suralis groot genoeg om in de cryo-kaak te passen. Gebruik een pincet om het monster onmiddellijk in de bovenste kaak van de cryo-kaak te plaatsen en sluit het instrument. Plaats de cryo-kaak verticaal in een universele testmachine en bevestig het calcaneale bot tussen de onderste klemmen.

Om het dwarsdoorsnedeoppervlak te berekenen, plaats u camera's loodrecht op elkaar. Voeg vloeibare stikstof toe aan beide bovenste kaakbakken om de spier te bevriezen tot een orde van grootte stijver dan de pees, zodat deze niet vervormt tijdens de trektest. Wanneer de bevriezingszone de metalen klemrand bereikt, stelt u de verplaatsingssnelheid van de machine in op een constante snelheid van één millimeter per seconde tot breuk en begint u de trektest, met behulp van een computer om de uiteindelijke treksterkte in Newtons te registreren.

Om rekening te houden met verschillen in de dwarsdoorsnedeoppervlakken van de genezende pezen, normaliseer de uiteindelijke treksterkte naar een eenheidsoppervlak die de mechanische stress vertegenwoordigt die door het weefsel wordt ervaren. Wanneer de pees breekt, bevriest u de gebroken peesmonsters snel in vloeibare stikstof en bewaart u ze op negentig graden Celsius tot RNA-extractie en RTPCR-analyse. In dit representatieve experiment was een grotere kracht nodig om peesbreuk te induceren in de PRP-geïnjecteerde groep dan in de controle-groep die met zoutoplossing werd behandeld op elk getest tijdstip, wat wijst op een robuuster genezingsproces of betere mechanische eigenschappen binnen de PRP-behandelde dieren.

Hoewel de PRP-groep een hogere intra-groepspreiding vertoonde dan de zoutoplossingsgroep, werd de dwarsdoorsnedeoppervlakte van de pezen bepaald om groter te zijn in de PRP-geïnjecteerde groep op dagen 15 en 30 na inductie van de laesie. Verder onthulde Masson's trichrome-kleuring een hogere aanwezigheid van fibrillair collageen, een belangrijk onderdeel in peesmorfologie en sterkte, in PRP-behandelde dieren op dagen vijf en vijftien, met een vergelijkbare intensiteit van kleuring waargenomen in beide groepen op dag 30 na injectie. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u standaardlaesies bij ratten kunt induceren en de pees kunt bemonsteren om hun genezingsproces na een PRP-injectie te evalueren.