Laboratoriumtechnieken die gebruikt worden om biotypes van te houden en te onderscheiden Vibrio cholerae Klinische en milieu-isolaten

Het algemene doel van deze techniek is om een verzameling protocollen te bieden die eenvoudig uit te voeren zijn en elke onderzoeker kunnen helpen om een bepaalde klinische of omgevingsisolaat van Vibrio cholerae te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het bacteriologieveld, zoals de specifieke genotypische en fenotypische kenmerken van elk Vibrio cholerae isolaat, vooral die van klinische relevantie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het elke onderzoeker in staat stelt om deze verzameling assays te gebruiken om op betrouwbare wijze klinische of omgevingsisolaten van Vibrio cholerae te karakteriseren en te onderscheiden.

Samen bieden deze assays een systematische aanpak die kan worden gebruikt als alternatief of in aanvulling op kostbare, arbeidsintensieve experimenten en de karakterisering van klinische en omgevingsisolaten van Vibrio cholerae. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de karakterisering van Vibrio cholerae biotypes, kan deze ook worden toegepast om de biochemische en metabolische capaciteiten van andere enterische bacteriën te karakteriseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen met tijdsbeheer omdat de incubatietijden die nodig zijn om optimale resultaten te garanderen, verschillen tussen biochemische assays.

Visuele demonstraties van de spotting- en stabbing-protocollen zijn cruciaal, omdat spatten vaak kan leiden tot kruisbesmetting en maximale afstand is vereist om samensmelting tussen culturen te voorkomen. Begin het protocol door 1,8 mL van de vloeibare overnachtcultuur gedurende twee minuten te pelletten door centrifugatie bij minimaal 8.600 xG in een steriele 2 mL microcentrifugebuis. Verwijder na centrifugatie het supernatant en hersuspendeer het celpellet in 900 mcL verse Luria-Bertani of LB-bouillon door te pipetten.

Voeg vervolgens 900 mcL steriele 60% volume-tot-volume glycerol toe aan de cultuur en meng door te vortexen. Breng de mengsel over in een steriele 2 mL cryogene buis en bewaar de stamcultuur bij 80 graden Celsius. Gebruik de stam door met een steriele inoculeerlus een kleine hoeveelheid bevroren stam te verwijderen en de bacteriën uit te streken om enkele kolonies op LB-agarplaten te verkrijgen.

Breng de bevroren stam onmiddellijk na gebruik terug naar 80 graden Celsius om te voorkomen dat de culturen volledig ontdooien. Incuber de platen met de deksel naar beneden gedurende 12-16 uur bij 37 graden Celsius. Verkrijg de eerder bereide plaat.

Inoculeer 4 mL vloeibare LB-bouillon in een steriele 10 mL cultuurbuis met een enkele kolonie door het oppervlak van de enkele kolonie aan te raken met een gesteriliseerde lus en de kolonie over te brengen in de vloeibare bouillon. Beïnvloede vervolgens de cultuur met aeratie in een shaker-incubator bij 225 rpm gedurende 12-16 uur bij 37 graden Celsius. Bereid een overnachtcultuur in vloeibare LB-bouillon voor.

De volgende dag pellet de cultuur en was de cellen door het celpellet opnieuw op te schorsen in 1,8 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing of PBS. Herhaal de wasprocedure drie keer. Volg de derde was met een laatste herschorsing in 1,8 mL 1x PBS.

Gebruik vervolgens een pipettentip om 1 mcL van de gewassen cultuur op het respectieve medium te spotten. Was het celpellet verkregen uit de overnachtcultuur. Inoculeer motiliteitsagarplaten door een inoculatiestabs in de gewassen vloeibare cultuur te steken en verticaal in het medium te steken.

Zorg ervoor dat de inoculatiestabs tijdens het steken van de agar niet buigt. Steriliseer tussen elke inoculatie de draadstabs met behulp van een Bunsenbrander. Beïnvloede de platen met de deksel naar boven gedurende 14-24 uur bij 37 graden Celsius.

Bewaak na 14 uur de motiliteitsplaten nauwgezet om de overgroei van culturen te voorkomen. Inoculeer 4 mL Methyl Red Voges-Proskauer of MR-VP-bouillon door 10 mcL van de eerder bereide overnachtcultuur te pipetten in 4 mL MR-VP-bouillon in een steriele cultuurbuis en beïnvloede met aeratie in een shaker-incubator bij 225 rpm gedurende 12-16 uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 150 mcL van 5%gewicht per volume Alpha-naftol en 50 mcL van 40%gewicht per volume kaliumhydroxide toe aan 1 mL aliquots van de MR-VP overnachtcultuur in respectievelijk steriele cultuurbuizen.

Vortex de buizen vervolgens kort. Laat de buizen tot vier uur staan bij kamertemperatuur totdat de kleurverandering zich ontwikkelt. Biotype-referentiestammen en representatieve El Tor-varianten werden opgenomen in PCR-gebaseerde genetische screenings en fenotypische assays om onderscheid te maken tussen de biotype-achtergrond van V.Cholerae klinische en omgevingsisolaten.

Wild-type klassiek O395 toonde klassieke ctxB- en tcpA-sequenties. Omgekeerd toonden wild-type El Tor-stammen N16961 en C6706 El Tor ctxB- en tcpA-sequenties. MQ1795 en BAA-2163 bevatten de klassieke biotype ctxB-subeenheid vergelijkbaar met 0395.

Toch bevatten beide El Tor-varianten de tcpA die kenmerkend is voor de El Tor-biotype-achtergrond. Wanneer gekweekt op LB-agarplaten aangevuld met polymyxine B, toonde de wild-type klassieke biotype-stam 0395 gevoeligheid voor polymyxine B, terwijl de wild-type El Tor-biotype-stam resistentie vertoonde. De representatieve El Tor-variantstammen toonden vergelijkbare resistentie tegen het antibioticum.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Vibrio cholerae biotypes kunt onderscheiden met behulp van het meervoudige assay-identificatiesysteem dat in dit manuscript is geschetst. Vergeet niet dat het werken met BSL-2-pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat correcte omgang met en verwijdering van alle materialen en afvalproducten moet worden afgedwongen volgens institutionele, lokale, staats- en federale regelgeving. Naast de protocollen die in dit manuscript zijn vermeld, kan verdere karakterisering van Vibrio cholerae-isolaten worden bereikt door onderzoek naar andere fenotypische eigenschappen zoals biofilmvorming en autoagglutinatie.