Name: Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer micro-injectie van muizen-oöcyten voor genetische modificatie en CRISPR-gentargeting. Dit protocol genereert gemodificeerde muizen in zes weken met kwaliteitscontrole en genotypering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken het personeel van de dierenfaciliteit (BRC) voor hun lopende ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council en de Australian Research Council.

Alle procedures zijn goedgekeurd door de University of New South Wales Animal Care and Ethics Committee. 1. Bereiding van het transgeen (willekeurige integratie) <ol><li> Analytische agarosegel-elektroforese. <ol><li> Digest het plasmide om het transgen te accentueren door gebruik te maken van geschikte enzymen (1 u incubatie) of snel verteerbare enzymen (15 tot 30 min incubatie) in een thermocycler volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie figuur 2A en zijn legende). </li><li> Giet een 1% tris-acetaat-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TEA) agarosegel, gekleurd met 0,5-1,0 μg / ml ethidiumbromide (EtBr). OPMERKING: Wees voorzichtig bij het gebruik van EtBr; Het is een krachtige mutage. Gebruik geschikte persoonlijke beschermende uitrusting (raadpleeg het veiligheidsinformatieblad). </li><li> Laad een 1 kb molecuulgewicht aan. </li><li> Laad de gelineariseerde fragmenten ( dwz transgen en ruggengraat). </li&gt; <li> Doe de elektroforese bij 100 V gedurende 45 minuten. </li><li> Visualiseer de gel op een ultraviolette (UV) transilluminator om te controleren of de spijsvertering volledig is en om de juiste grootte van het transgen te bevestigen ( dwz 7.333 bp, zie figuur 2A ). </li></ol></li><li> Preparatieve agarosegel-elektroforese. <ol><li> Giet een 1% TAE-agarosegel, gekleurd met een laag-toxiciteitsgelvlek. Laad 8 porties (1 μg elk) gelineariseerd transgeen zonder een molecuulgewichtmarkering en voer de elektroforese bij 100 V gedurende 45 minuten. Gebruik een scalpel om alle 8 bands die overeenkomen met het gelineariseerde transgen, te accijnzen. </li><li> Extract het DNA met behulp van een gel extractie kit door de aanbevelingen van de fabrikant te volgen (zie de tabel van materialen ). <ol><li> Smelt de gelfragmenten gedurende minstens 15 minuten bij 50 ° C in 1,5 ml buizen. Precipiteer het met isopropanol en voeg vervolgens de bindingsbuffer toe. </li><li> Combineer de hele DNA door het allemaal in één kolom te pipetteren. Uitsluiten in nuclease-vrije microinjectiebuffer (8 mM Tris-HCl en 0,15 mM EDTA). Filter door een 0,22 μm microcentrifugefilter en centrifuge gedurende 60 s bij 12.000 x g. </li></ol></li><li> Meet de concentratie en de kwaliteit van het DNA met behulp van een spectrofotometer. Controleer of de A260 / A280-verhouding ongeveer 1,8 bedraagt ​​( dat wil zeggen geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen). Verdun tot 3 ng / μL in nuclease-vrije microinjectiebuffer, aliquot (20-50 μl) en vries bij -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Synthese van CRISPR Components (Gene Targeting) <ol><li> Cas9 mRNA. <ol><li> Verdun het Cas9 mRNA (verkregen uit een commerciële bron, zie de Tabel van Materialen ) tot een concentratie van 1 μg / μL in nuclease-vrije microinjectiebuffer. </li><li> Aliquot in 2 μL en gratis<html> Ze bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Single-guide RNA (SgRNA). <ol><li> Identificeer de gewenste twee-target genomische sequenties (gidsen) met behulp van een computergebruikswerktuig waardoor minimaal potentiële off-target-activiteit 17 mogelijk is . <ol><li> Voor genknock-out selecteer systematisch twee gidsen die een paar honderd base-pairs (bp) bevinden, in tegengestelde richtingen, en omvat het startcodon van het gen van belang. Voor homologie directe reparatie, selecteer twee overlappende gidsen (indien mogelijk), in tegengestelde richtingen. OPMERKING: Bijvoorbeeld, de volgende handleidingen zijn recentelijk succesvol gecojecteerd om de eerste exon van het TPM4.2 gen te verstoren : Gids 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Gids 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Bestel een reeks primers zoals beschreven in Tabel 1 . </li><li> Synthese een lineaire DNA-sjabloon. <ol><li> Verdun px330Ref &quot;&gt; 12 plasmide tot 10 ng / μl in nuclease-vrij water. </li><li> Bereid de master mix zoals aangegeven in Tabel 1 . Voeg het polymerase aan het einde toe en hou de meermix op ijs. </li><li> Meng en verdeel dit in 8 PCR buizen (19 μL / buis). Voeg 1 μL px330 per buis toe en voer de PCR onder de volgende omstandigheden: 1 min bij 98 ° C; 40 cycli van 98 ° C gedurende 10 s, 64 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 15 s; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Houd bij 4 ° C. </li><li> Reinig de PCR-producten met een PCR-zuiveringsset (zie de Tabel van Materialen ), een verdeelstuk en een vacuümbron (voor snellere verwerking). Breng de maximale vacuümsterkte ( dwz 8 mbar) aan. <ol><li> Voeg 5 volumes (100 μl) bindingsbuffer toe aan 1 volume van het PCR-monster en meng. </li><li> Plaats een (voorziene) siliciumdioxide membraan spin kolom in een (voorziene) 2 ml collectibuis voor centrifugering, of op de manifold voor vacuümprocesing. Om DNA te binden, past alle 8 monsters achtereenvolgens toe op de kolom en vacuüm of centrifugeer gedurende 60 s bij 12.000 xg voor elke lading. </li><li> Om te wassen, voeg 0,75 ml wasbuffer (buffer PE) toe aan de kolom en vacuüm of centrifuge gedurende 60 s bij 12.000 x g. Centrifugeer de kolom gedurende 60 s bij 12.000 xg om resterende ethanol te elimineren. </li><li> Plaats de kolom in een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Om het DNA te elueren, voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan het midden van het membraan, laat de kolom gedurende 1 minuut staan ​​en centrifugeer gedurende 60 s bij 12.000 g. </li></ol></li><li> Meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer; Typisch zou de concentratie 100 ng / μl of hoger moeten zijn. Controleer of de A260 / A280-verhouding ongeveer 1,8 bedraagt ​​( dat wil zeggen geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen). </li></ol></li><li> In vitro transcriptie met behulp van een T7 RNA synthese kit. <ol><li> Bereid tHij mengt, zoals aangegeven in tabel 1 , en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C in een thermocycler. Voeg 28 μL nuclease-vrij water en 2 μl DNase I toe en incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij 37 ° C in een thermocycler. </li></ol></li><li> RNA zuivering met behulp van spin kolommen. <ol><li> Los de poeder in de voorziene spinkolom op in 650 μL nuclease-vrije microinjectiebuffer. Verwijder alle luchtbellen zorgvuldig. Pak de buis en hydrateren gedurende 5 - 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de blauwe dop onderaan en plaats de kolom in een 2 ml buis. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 750 xg en kamertemperatuur. Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml buis en plaats druppelsgewijs 50 μL van de RNA-oplossing, zonder de kolomwand aan te raken. Spoel de kolom gedurende 2 minuten bij 750 x g. </li><li> Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (de typische opbrengst van een reactie is 30-50 μg). Controleer of de A260 / A280-verhouding een a isRond 2,0 ( dus geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen). Bewaar de sgRNA&#39;s bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Bepaal de kwaliteit van het RNA met behulp van de 1% TAE gels die routinematig gebruikt worden voor DNA elektroforese. Run 200-400 ng van het DNA sjabloon en het bijbehorende sgRNA parallel. De RNA-band (≈ 100 bp) moet iets groter zijn dan de DNA-band (zie Figuur 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Donor Template <ol><li> Commercieel gesynthetiseerde enkelstrengige oligonucleotiden (ssOligos, zie de Tabel van Materialen ) voor puntmutaties bestellen of voor de integratie van kleine sequenties tot 50 bp; Homologie armen zijn typisch 60-90 bp lang. </li><li> Voor grotere invoegingen gebruik een donorplasmide als een sjabloon. Genereer een geschikt plasmide met behulp van de klassieke kloneringsmethode of de novo synthese uit aCommerciële bron. OPMERKING: Minimaal 800 bp per homologie arm wordt aanbevolen. De grootte van de ruggengraat heeft geen invloed op de efficiëntie van homology direct repair (HDR). </li></ol> 4. Spuitmengsel <ol><li> Verdun het Cas9 mRNA tot 50 ng / μL en de sgRNA&#39;s tot 12,5 ng / μl (25 ng / μl in totaal) onder gebruikmaking van nuclease-vrije microinjectiebuffer voor gen-knock-out experimenten. Voeg de donorsjabloon (ssOligo of plasmide) toe bij een concentratie van 200 ng / μL voor experimenten met genoomredigering op basis van homologie directe reparatie. OPMERKING: Verdunningsvolumes kunnen gemakkelijk worden bepaald met behulp van online gereedschappen, zoals een resuspensieregelaar 18 . </li><li> Houd elke portie op ijs tijdens de microinjectiesessie en wis daarna af (doe de injectiemengsel niet opnieuw bevriezen). </li></ol> 5. Scrotale Vasectomie OPMERKING: Twee soorten vasectomie worden vaak uitgevoerd in muizen: buik- en scrotale buikspieren. Het laatsteIs minder invasieve en is eerder beschreven 15 . <ol><li> Autoclaaf alle chirurgische instrumenten in roestvrij staal. </li><li> Bepaal het gewicht van de muis met behulp van een weegschaal en verdov de mannen door intraperitoneale (ip) injectie met injecteerbare verdoving (ketamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg). </li><li> Controleer het verlies van de klinkreflex van de teen en als de muis zacht is, plaats het op de bovenkant van een verwarmingsblok. </li><li> Desinfecteer de huid rond de testes met afwisselende doekjes van een actueel antiseptisch middel zoals chlorhexidine en 70% ethanol. </li><li> Duw de testes in de scrotal sac en maak een huid incisie met een scalpel. </li><li> Visualiseer de testis, cauda epididymis en vas deferens. </li><li> Grijp de vaatdeferens met pincet, houd deze vast en scherp aan elke kant van de tang om 3 mm van de vaatdeferens te verwijderen. </li><li> Voer dezelfde procedure uit op de tweede testis. </li><li> Sluit de huidinsnijdingen met wondklemmen en controleer deMuis nauwgezet tot volledig herstel. </li></ol> 6. Superovulatie (Oocytes Donors) en Time-paring (Pseudo-zwangere Vrouwen) OPMERKING: De techniek om een ​​geschikt aantal bevruchte oocyten te genereren en geploegde pleegvrouwen voor reimplantatie te hebben is elders 15 beschreven. <ol><li> Spuit 10 vrouwelijke ip met 5 IE van de zwangere merens serumgonadotropine (PMSG, in 100 μl) omstreeks 12 uur op dag 1. </li><li> Spuit de vrouwelijke ip met 5 IE van menselijke chorionische gonadotropine (hCG in 100 μl) 46-48 uur later (omstreeks 11 uur op dag 3). </li><li> Zet de vrouwtjes onmiddellijk met eengezins mannen overnacht. </li></ol> 7. Pronucleaire (willekeurige integratie) en cytoplasmatische (Gene-targeting) injecties <ol><li> Vang de superovultaire muizen door cervicale ontwrichting, ontbloot de buik en toegang tot de eierstokken en oviducten, zoals eerder beschreven 15 . Dissect de oVellen en oogsten van de cumulus-oocyt-complexen (COC&#39;s) onder een stereomicorscoop 15 . Plaats ze in een druppel kalium simplex optimalisatie medium aangevuld met aminozuren (KSOMaa) volgens de traditionele methode 15 . </li><li> Reinig de oocyten door ongeveer 1 μl hyaluronidase (10 mg / ml) toe te voegen aan de druppel KSOMaa-medium met behulp van een aspirator mondstuk en plaats de schotel in een 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende 30 s tot 1 min. </li><li> Was de oocyten met 4 verse druppels KSOMaa-medium door het mondstuk van de aspirator te gebruiken en over te brengen naar een laatste druppel KSOMaa-medium dat overgaat met minerale olie (ongeveer 2 ml). Plaats de schotel in de 37 ° C / 5% CO 2 incubator totdat de oocyten klaar zijn voor injectie. </li><li> Pronucleaire injectie (willekeurige integratie). <ol><li> Visualiseer de eieren onder de stereoscopische microscoop en overzetten ongeveer 50 eieren naar de injectiekamer (a droP van M2 medium bedekt met minerale olie) met behulp van het aspirator mondstuk. </li><li> Breng de injectiekamer over naar de omgekeerde microscoop en injecteer de bevruchte oocyten (twee zichtbare pronuclei) met een paar picoliters van de injectiemix, gericht op een pronucleus (elk van de pronuclei kan worden gericht). Visualiseer een succesvolle injectie door de zwelling van de pronucleus in acht te nemen. </li></ol></li><li> Cytoplasmische injectie (gen targeting). <ol><li> Zet ongeveer 50 eieren over op een druppel KSOMaa die 5 μg / ml Cytochalasin B bevat met behulp van het mondstuk en incubeer gedurende 5 minuten in de 37 ° C / 5% CO 2 -cubator. </li><li> Breng de eieren naar de injectiekamer met behulp van het mondstuk. </li><li> Spuit enkele picoliters van de injectiemengsel in de cytoplasma bij zeer lage druk (50-100 hPa), met behulp van de compensatiedruk van de geautomatiseerde microinjector waar mogelijk. </li><li> Vervolgens na injectie de oocyten terug in een druppel KSOMaa (met behulp van het mondstuk) en houd ze in de 37 ° C / 5% CO 2 incubator, totdat deze geladen is voor reimplantatie in het oviduct van pseudo-zwangere vrouwtjes. </li></ol></li></ol> 8. Reimplantatie <ol><li> Autoclaaf alle chirurgische instrumenten in roestvrij staal. </li><li> Bepaal het gewicht van de muis met behulp van de weegschaal en verdov de vrouwen door intraperitoneale (ip) injectie met injecteerbare verdoving (ketamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg). </li><li> Controleer het verlies van de klinkreflex van de teen en als de muis zacht is, plaats het op de bovenkant van een verwarmingsblok. </li><li> Knip een groot gedeelte van de vacht om de dorsale middenlijn van de vrouwelijke muis. </li><li> Desinfecteer de blootgestelde huid met wisselende doekjes van een actueel antiseptisch middel zoals chlorhexidine en 70% ethanol. </li><li> Ontdek het voortplantingsstelsel volgens traditionele methode 15 . Maak een 1 cm lange huidinsnijding evenwijdig aan de dorsale middenlijn, snij de spier en pak de vetkussen wiDoe een tang en trek de ovary voorzichtig uit totdat de bevestigde ovulaat en de baarmoeder duidelijk zichtbaar zijn. </li><li> Bevestig het vetpaneel met een schroefklem. Visualiseer het oviduct onder de stereoscopische microscoop en maak gebruik van een paar microsensjes een snede in de wand van het oviduct enkele millimeter stroomopwaarts van de ampulla. </li><li> Onder de stereoscopische microscoop laadt u 25 microinjecteerde eieren in de glazen capillaire die verbonden is met het mondstuk (de inwendige diameter van de capillaire moet ongeveer 120 μm breed zijn). Introduceer de glazen capillaire in het oviduct en verdrijf totdat een luchtbelletje in de ampulla zichtbaar is. </li><li> Verwijder de glazen capillaire voorzichtig en plaats het voortplantingsstelsel terug in de buik. Soteer de incisie met 3-0 niet-absorbeerbare chirurgische hechtingen, sluit dan met wondklemmen. Monitor de muis nauwlettend tot volledig herstel. </li></ol> 9. Genotyping Strategies / Sequencing OPMERKING: Isoleer de genomicDNA uit 2 mm staart of oorbiopsies, in overeenstemming met de relevante dieretische regelgeving. <ol><li> Snelle genomische DNA-extractie (willekeurige integratie). <ol><li> Licht de weefselmonsters (~ 2 mm) bij 95 ° C gedurende 1 uur in 100 μl alkalisch lysisreagens (25 mM natriumhydroxide en 0,2 mM EDTA, pH = 12). </li><li> Voeg 100 μL neutraliserend reagens (40 mM Tris-HCl, pH = 5) toe. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 g en 4 ° C. </li></ol></li><li> Hoge kwaliteit genomische DNA-extractie (gen targeting). <ol><li> Voeg 500 μl staartbuffer (50 mM Tris, pH = 8; 100 mM EDTA, pH = 8; 100 mM NaCl; 1% SDS; 0,5 mg / ml protease K, vers toegevoegd). </li><li> Incubeer overnacht bij 55 ° C. </li><li> Meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex). </li><li> Voeg 250 μL verzadigd NaCl (6 M) toe en meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex). </li><li> Spin 5-10 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C en giet het supernatant in een nieuwe buis. </li&gt; <li> Voeg 500 μl isopropanol toe en meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex). </li><li> Spin gedurende 10 minuten bij 12.000 xg en kamertemperatuur. </li><li> Dek de supernatant (de pellet is onzichtbaar en stokt aan de buis). </li><li> Was met 1 ml 70% ethanol. </li><li> Spin 5-10 minuten bij 12.000 xg en kamertemperatuur. Verwijder de supernatant met zorg, want de witte pellet is niet meer kleverig en kan verloren gaan. </li><li> De lucht droog dit voor ~ 1 uur. </li><li> Voeg 400 μl TE-buffer (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH = 8) toe. </li><li> Los het DNA op 55-60 ° C gedurende 2 uur op. </li></ol></li><li> Primer ontwerp. <ol><li> Ontwerp primers minimaal 20 bp lang met behulp van een computergereedschap 19 . OPMERKING: Voor willekeurige integratie moeten de primers hybridiseren met het transgeen, waardoor een duidelijk fragment van 200-800 bp wordt genereerd. Voor gen targeting, ontwerp de primers, zodat ze hybridiseren met het genomische DNA, waardoor een aparte f wordt genereerdStel een paar honderd bp om de snijplaatsen. Voor grote inserties kunnen de primers op het transgen zitten, maar bevestiging van de gerichte integratie moet vervolgens worden uitgevoerd met behulp van primerwandeling of een soortgelijke techniek. </li></ol></li><li> PCR genotypering. <ol><li> Voor elke genomische modificatie, ontwerp een nieuw PCR protocol en test het empirisch. Overweeg de lengte van het gegenereerde fragment en de smeltemperatuur (Tm) van elk paar primers. </li></ol></li><li> Sequencing. <ol><li> Voor gen targeting, stuur PCR producten naar een Sanger sequencing service provider. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li>
<li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li>
<li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarantz+Henig%2C+R+%22The+Monk+in+the+Garden%22">The Monk in the Garden</a>. , Mariner books. (2000).</li>
<li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li>
<li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li>
<li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li>
<li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li>
<li>Ittner, L. M., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>CRISPR DESIGN. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://crispr.mit.edu">http://crispr.mit.edu</a> (2017).</li>
<li>Integrated DNA Technologies. Resuspension Calculator. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017).</li>
<li>BioTools at UMass Medical School. Primer3: WWW primer tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi">http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</a> (2017).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li>
<li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency%2C+aneuploidy+rates%2C+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout%2C+single-amino-acid-substituted%2C+and+floxed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88(2001).</li>
<li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431(2016).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li>
<li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li>
<li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li>
<li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+culture+medium%3A+making+informed+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li>
<li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="https://www.omicsgroup.org/journals/cloning-transgenesis-abstract.php?abstract_id=50992">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li>
</ol>

De auteurs verstrekken academische transgenese diensten in muizen via het University of New South Wales Mark Wainwright Analytical Center.

Kritieke stappen binnen het protocol De opkomst van genetisch gemodificeerde muizen is technisch uitdagend. Het hier gepresenteerde protocol is echter een geoptimaliseerde en vereenvoudigde methode waarmee men de techniek in recordtijd kan beheersen en oplossen. Er zijn twee stappen nodig om de techniek succesvol af te ronden. Ten eerste kan de synthese van lineaire DNA templates (voor de synthese van sgRNAs) worden bereikt zonder magnesiumchloride (MgCl2). Het wordt echter sterk aanbevolen om ...

Diermodellen, zowel bij gewervelde dieren als in ongewervelden, hebben bijgedragen tot het onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer 1 , 2 . Ze zijn ook waardevolle hulpmiddelen om te zoeken naar ziekteveranderende middelen en uiteindelijk nieuwe behandelstrategieën te ontwikkelen in de hoop op een genezing. Hoewel elk model intrinsieke beperkingen heeft, is het gebruik van dieren als gehele systemische modellen van vitaal belang voor biomedisch onderzoek. Dit komt doordat de metabolische en complexe fysiologische omgeving niet volledig in de weefselkweek kan worden gesimuleerd. Tot op heden blijft de muis de meest voorkomende zoogdiersoort die wordt gebruikt voor genetische manipulatie omdat het meerdere voordelen heeft. De fysiologische processen en genen die verband houden met ziekten worden sterk bewaard tussen muizen en mensen. De muis was het eerste zoogdier om zijn volledige genoom sequenced (2002) te hebben, een jaar voor het menselijk genoMij ​​(2003). Naast deze rijkdom genetische informatie heeft de muis goede fokcapaciteiten, een snelle ontwikkelcyclus (6 weken van bevruchting tot speen) en een redelijke omvang. Al deze voordelen, in combinatie met fysiologische indicatoren, zoals onderscheidende coat kleuren (vereist voor het oversteken van strategieën), maakte de muis een aantrekkelijk model voor genetische manipulatie. Met name in de vroege tijd van de moderne genetica begon Gregor Mendel met muizen te werken voordat ze naar planten 3 gaan . Gene transfer technieken resulteerden in de generatie van de eerste transgene muis over drie decennia geleden 4 , oorspronkelijk gemaakt met behulp van virale levering. Echter, onderzoekers realiseerden snel dat een van de belangrijkste uitdagingen van de muis transgenese het onvermogen was om het lot van het exogene DNA te controleren. Omdat de virale afgifte van transgenen in muis-oocyten resulteerde in meerdere kopieën willekeurig geïntegreerd in het genoom, de mogelijkheidY van het opstellen van de volgende transgene lijnen was beperkt. Een dergelijke beperking werd overwonnen toen Gordon et al. Genereerde de eerste transgene muislijn door microinjectie 5 , 6 . Dit begon het tijdperk van recombinante DNA technologie, en de parameters die het resultaat van een microinjectiesessie beïnvloeden zijn in grote mate bestudeerd 7 . Hoewel microinjectie geen controle biedt op de integratieplaats van het transgeen (dat uiteindelijk resulteert in specifieke expressieniveaus voor elke oprichtermuis), blijft het voornaamste voordeel van pronucleaire microinjectie de vorming van concatemers ( dat wil zeggen arrays van meerdere kopieën van het transgene, Gekoppeld in serie) voor genomische integratie 5 . Dit kenmerk is door de jaren heen gebruikt om duizenden transgene muislijnen te vormen die een gen van belang uitdrukken. Sindsdien is transgenese, de aRtmatige modificatie van het genoom van een organisme, is uitgebreid gebruikt om de rol van enkele genen bij het optreden van ziekten te identificeren. Een verdere belangrijke prestatie bij het manipuleren van het muisgenoom werd bereikt toen Mario Capecchi succesvol een enkel gen in de muis ontwricht, waardoor het tijdperk van gen targeting 8 werd geopend. Echter, grote nadeel kwam snel uit ES-cel gebaseerde gen targeting, met inbegrip van de uitdagingen van het cultiveren van ES cellen, de ietwat variabele mate van chimerisme en de lengte van het proces ( dat wil zeggen 12-18 maanden, minimum, om de muis te verkrijgen) . Onlangs zijn vooruitgang geboekt in nieuwe technologieën, zoals geanimeerde endonucleasen (bijvoorbeeld zinkvinger nucleasen (ZFN), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALEN) en clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR / Cas9)) Versnellen het proces van gen targeting in micE 9 , 10 . Deze endonucleasen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd in muis-oocyten door microinjectie, waardoor de generatie van gen-gerichte muizen in zo weinig als 6 weken mogelijk wordt. Sinds het eerste rapport over het gebruik van CRISPR voor genoombewerking 11 , heeft dit bacteriële adaptieve immuunsysteem ZFN en TALEN vervangen door zijn vele voordelen, waaronder het gemak van de synthese en het vermogen om meerdere loci tegelijk te richten (aangeduid als &quot;multiplexing &quot;). CRISPR werd voor het eerst gebruikt voor gen targeting in muizen 12 en is sindsdien toegepast op ontelbare soorten, van planten tot mensen 13 , 14 . Tot op heden is er geen rapport van een enkele soort resistent tegen CRISPR genoom bewerking. De twee hoofdbeperkende stappen van de generatie transgene muizen zijn de injectie van oocyten en de reimplantatieVan deze oocyten in pseudo-zwangere vrouwtjes. Hoewel deze techniek is beschreven door ons 15 en anderen 16 , hebben de recente technische verbeteringen in de muisembryologie en genoverdrachtstechnieken het proces om genetisch gemodificeerde muizen te generen, omgezet. Deze verbeteringen zullen hierin beschreven worden.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1.000 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecuulgewichtsmarker&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecuulgewichtsmarker&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Verdunnen tot 1x</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gelkleuring</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR zuiveringskit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumsysteem (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrije micro-injectiebuffer&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifugefilter&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR-expresserend plasmide (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA zuiveringsspinkolommen (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donorplasmide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryocultuurmedium</td><td>Zenith Biotech&nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Zenith Biotech&nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mondstuk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glas microcapillairen</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Irisschaar</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vesselaar</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wondclips&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clipsapplicatie&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Microschaar&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterisator</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Niet-absorbeerbare chirurgische hechtdraden (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese instelling</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopische microscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulatoren</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oöcyten manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Muizen C57BL/6J-stam</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen heeft significant bijgedragen tot studies op zowel fysiologische als pathologische in vivo processen. De pronucleaire injectie van DNA-expressieconstructen in bevruchte oocyten blijft de meest gebruikte techniek om transgene muizen te genereren voor overexpressie. Met de introductie van CRISPR technologie voor gen targeting, is pronucleaire injectie in bevruchte oocyten uitgebreid tot de generatie van zowel knock-out en knockin muizen. Dit werk beschrijft de voorbereiding van DNA voor injectie en het genereren van CRISPR-gidsen voor gen targeting, met bijzondere nadruk op kwaliteitscontrole. De genotyperingsprocedures die nodig zijn voor de identificatie van potentiële oprichters zijn kritisch. Innovatieve genotyping strategieën die gebruik maken van de &quot;multiplexing&quot; mogelijkheden van CRISPR worden hierin gepresenteerd. Chirurgische procedures worden ook beschreven. Samen zullen de stappen van het protocol het genereren van gen mogelijk makenEtisch gemodificeerde muizen en voor de daaropvolgende vestiging van muiskolonies voor een overvloed aan onderzoeksvelden, waaronder immunologie, neurowetenschappen, kanker, fysiologie, ontwikkeling en anderen.

Hieronder worden de werkstromen voor microinjectie in het geval van willekeurige integratie en CRISPR-gemedieerde gen targeting beschreven ( Figuur 1 ). <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figuur 1: Typische werkstroom voor de generatie van genetisch gemodificeerde muizen. Voor willekeurige integratie wordt het gezuiverde trans...

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Het algemene doel van dit protocol is om de procedures te beschrijven die nodig zijn voor het succesvol genereren van genetisch gemodificeerde muizen via micro-injectie van oocyten. Dit protocol kan onderzoekers en technisch personeel ondersteunen die betrokken zijn bij zowel het veld van muisgenese als bij gene targeting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze gebaseerd is op de directe injectie van muisoocyten, zowel voor willekeurige integratie als voor gene targeting, waardoor genetisch gemodificeerde muizen in slechts zes weken kunnen worden gegenereerd.Om een enkel gids-RNA voor te bereiden, na het selecteren van de gewenste twee doelsequenties en het maken van primers volgens het tekstprotocol, synthetiseert u een lineair DNA-sjabloon door het PX330-plasmide te verdunnen tot 10 nanogram per microliter in nucleasevrij water. Bereid een mastermix, waarbij u de polymerase als laatste toevoegt, en bewaar deze op ijs. Meng vervolgens de oplossing en verdeel deze over acht PCR-buisjes.Voeg één µL PXR330 per buis toe en voer het volgende programma uit. Gebruik vervolgens een PCR-zuiveringskit, een manifold en een vacuümbron om het PCR-product te zuiveren. Voeg vij

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

This video describes the pronuclear injection of lentiviral vectors into the perivitelline space of a fertilized mouse embryo. The lentivirus contains the transgene, which is incorporated into the genome of the fertilized embryo, eventually giving rise to transgenic mice.

Lentiviral Vector-Based Perivitelline Injection: A Method to Transduce the Gene of Interest Into Fertilized Single-Cell Mouse Oocytes

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Er wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat de uitputting van cytoplasmatische microtubuli organiserende centra in muizenoöcyten tijdens metafase I mogelijk maakt met behulp van een nabij-infrarode femtosecondelaser.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

De efficiëntie van de Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)-methode is vergelijkbaar met traditionele micro-injectie, waarbij zygoten moeten worden verzameld bij donorvrouwtjes en moeten worden overgedragen aan pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit protocol demonstreert zijn effectiviteit door CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutaties te introduceren in de ROSA26-locus op chromosoom 6.

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Leer micro-injectie van muizen-oöcyten voor genetische modificatie en CRISPR-gentargeting. Dit protocol genereert gemodificeerde muizen in zes weken met kwaliteitscontrole en genotypering.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Meer video's verkennen