Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Het algemene doel van dit protocol is om de procedures te beschrijven die nodig zijn voor het succesvol genereren van genetisch gemodificeerde muizen via micro-injectie van oocyten. Dit protocol kan onderzoekers en technisch personeel ondersteunen die betrokken zijn bij zowel het veld van muisgenese als bij gene targeting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze gebaseerd is op de directe injectie van muisoocyten, zowel voor willekeurige integratie als voor gene targeting, waardoor genetisch gemodificeerde muizen in slechts zes weken kunnen worden gegenereerd.

Om een enkel gids-RNA voor te bereiden, na het selecteren van de gewenste twee doelsequenties en het maken van primers volgens het tekstprotocol, synthetiseert u een lineair DNA-sjabloon door het PX330-plasmide te verdunnen tot 10 nanogram per microliter in nucleasevrij water. Bereid een mastermix, waarbij u de polymerase als laatste toevoegt, en bewaar deze op ijs. Meng vervolgens de oplossing en verdeel deze over acht PCR-buisjes.

Voeg één µL PXR330 per buis toe en voer het volgende programma uit. Gebruik vervolgens een PCR-zuiveringskit, een manifold en een vacuümbron om het PCR-product te zuiveren. Voeg vijf volumes bindingsbuffer toe aan één volume van het PCR-monster en meng dit.

Plaats de spinzuil met siliconen membraan op het collectiemanifold. Om DNA te binden, brengt u alle acht monsters onder vacuüm aan op de zuil. Om het monster te wassen, voegt u 0,75 milliliter wasbuffer toe aan de zuil en past u vacuüm toe.

Centrifugeer de kolom vervolgens 60 seconden bij 12.000 ×g om resterende ethanol te verwijderen. Plaats de kolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg, om het DNA te elueren, 30 µL nucleasevrij water toe in het midden van het membraan. Laat de kolom één minuut staan en centrifugeer deze vervolgens 60 seconden bij 12.000 ×g.

Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de DNA-concentratie te meten. Om in vitro transcriptie uit te voeren met een t7 RNA-synthesekit, bereidt u de mastermix en incubeert u de reactie in een thermocycler bij 37 degree celsius gedurende drie uur. Voeg 28 microliters nucleasevrij water en twee microliters DNAse one toe, en incubeer de reactie nogmaals 15 minuten.

Om het RNA te zuiveren, lost u het poeder in de meegeleverde spincolumn op in 650 microliters nucleasevrije micro-injectiebuffer. Sluit de buis af nadat u zorgvuldig alle luchtbellen heeft verwijderd en laat de oplossing vijf tot 15 minuten hydrateren bij kamertemperatuur. Verwijder de blauwe dop aan de onderzijde en plaats de column in een buis van twee milliliter.

Centrifugeer de buis vervolgens gedurende twee minuten bij 750 ×g op kamertemperatuur. Plaats de kolom daarna in een nieuwe buis van 1,5 mL en breng 50 µL van de RNA-oplossing druppelgewijs aan in het centrum, zonder de wand van de kolom aan te raken. Centrifugeer de kolom vervolgens twee minuten bij 750 ×g.

Meet de RNA-concentratie en beoordeel de kwaliteit van het RNA volgens het tekstprotocol. Verdun het Cas9-mRNA met nucleasevrije micro-injectiebuffer tot 50 nanogram per microliter en de sgRNA's tot 12,5 nanogram per microliter voor gene-knockoutexperimenten. Voeg het donor-template toe in een concentratie van 200 nanogram per microliter voor genoomredigering op basis van homology-directed repair en bewaar dit op ijs.

Gebruik het mondstuk van de aspirator om de oocyten te wassen met vier verse druppels caseïne-aminozuren. Breng ze vervolgens over naar een laatste druppel casome eight-medium, bedekt met minerale olie. Om pronucleus-injectie uit te voeren voor willekeurige integratie, gebruikt u onder de stereomicroscoop het mondstuk van de aspirator om ongeveer 50 eicellen over te brengen naar een druppel M2-medium, bedekt met minerale olie, die als injectiekamer zal dienen.

Verplaats de injectiekamer naar een omgekeerde microscoop en injecteer de bevruchte oocyten met enkele picoliters van het injectiemengsel. De pronucleus zal opzwellen als de injectie succesvol is. Voer cytoplasmatische injectie uit voor gene targeting; gebruik een mondpipet om ongeveer 50 eieren over te brengen naar een druppel casome A, bevattend 5 µg/mL cytochalasin B, en incubeer de eieren gedurende vijf minuten bij 37 °C en 5% CO2.

Breng de eitjes over naar de injectiekamer en injecteer vervolgens, bij een zeer lage druk, enkele picoliters van het injectiemengsel in het cytoplasma. Gebruik waar mogelijk de compensatiedruk van de geautomatiseerde micro-injector. Gebruik na de injectie het mondstuk om de oocyten terug te brengen naar een druppel casome-aminozuren.

Houd ze bij 37 °C en 5% CO₂ tot ze worden geladen voor reimplantatie in de eileider van de pseudodrachtige vrouwtjes. Nadat een gevorkt vrouwtjesmuis is geanestheseerd volgens het tekstprotocol, wordt de voortplantings tract blootgelegd door met een scalpel een snee van één centimeter lang parallel aan de dorsale middellijn te maken, om de reimplantatie onder steriele omstandigheden uit te voeren. Snijd vervolgens met een schaar door de spier en gebruik een pincet om het vetkussen vast te pakken.

Trek de eierstok voorzichtig naar buiten, totdat de vastzittende eileider en baarmoeder duidelijk zichtbaar zijn. Gebruik vervolgens een vatklem om het vetkussentje te fixeren. Gebruik onder de stereomicroscoop een microschaartje om een incisie te maken in de wand van de eileider, enkele millimeters stroomopwaarts van de ampulla.

Laad daarnaast onder de stereomicroscoop 25 geïnjecteerde eitjes in de glazen capillair die aan het mondstuk is verbonden. Voer vervolgens de glazen capillair in de eileider en drijf de eitjes uit totdat er een luchtbel zichtbaar is in de ampulla. Om te bevestigen dat de reimplantatie is geslaagd, moet u controleren op de aanwezigheid van de luchtbel in de ampulla; dit garandeert dat alle eitjes op de juiste locatie zijn uitgestoten en er geen eitjes in de glazen capillair zijn achtergebleven.

Verwijder voorzichtig de glazen capillair en plaats het voortplantingskanaal terug in de buikholte. Gebruik vervolgens drie nullen, niet-absorbeerbare chirurgische hechtingen om de incisie te hechten en sluit daarna de huid met wondclips. Plaats de muis op een warmteonderlegger om hypothermie te voorkomen en injecteer subcutaan een analgeticum.

Houd de muis in de gaten tot het volledige herstel is voltooid. Voer tot slot genoomtypering en sequencing uit volgens het tekstprotocol. Deze figuur toont analytische gels die de kwaliteit van de transgeen-purificatie en de sgRNA-synthese aantonen, welke cruciaal zijn voor het succesvol genereren van genetisch gemodificeerde muizen.

Hier wordt een typische uitslag getoond van een micro-injectiesessie voor willekeurige integratie. De genotyperingsprimer moet zich op het transgen bevinden en zodanig zijn ontworpen dat er een fragment van 200 tot 800 basenparen wordt gegenereerd. In deze uitslag voor gen-targeting zijn de primers geselecteerd om te hybridiseren met het genomisch DNA buiten het gebied dat uiteindelijk door de twee gidsen wordt uitgesneden.

Deze strategie maakt de directe identificatie van heterozygote en homozygote knock-out founders mogelijk. Zoals hier wordt geïllustreerd, wanneer elke stap van het protocol is geoptimaliseerd, zou het percentage transgene pups voor willekeurige integratie 10% tot 25% moeten bedragen, wat relatief laag is in vergelijking met het vermogen van de CRISPR-componenten om het muisgenoom te bewerken. Bij het gebruik van CRISPR voor gene targeting is het aantal founders over het algemeen hoger, variërend van 25% tot 100%; het is niet ongebruikelijk om een volledig nageslacht te verkrijgen dat succesvol homozygoot is wanneer bewerking met CRISPR is toegepast.

Na de ontwikkeling stelt deze techniek onderzoekers in vakgebieden zoals bijvoorbeeld neurowetenschappen of kankeronderzoek in staat om nieuwe maskermodellen te gebruiken om pathologische mechanismen te ontdekken en dit uiteindelijk te vertalen naar therapeutische strategieën.