Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten
June 15th, 2017
De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.
Het algemene doel van dit protocol is om de procedures te beschrijven die nodig zijn voor de succesvolle generatie van genetisch gemodificeerde muizen door micro-injectie van eicellen. Dit protocol kan onderzoekers en technisch personeel die betrokken zijn bij het gebied van muizenontstaan, maar ook bij gen-targeting, helpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze is gebaseerd op de directe injectie van muizen-eicellen, zowel voor willekeurige integratie, maar ook voor gen-targeting, waardoor de generatie van genetisch gemodificeerde muizen in slechts zes weken mogelijk is.
Om een enkele guide RNA voor te bereiden, selecteer na het kiezen van de gewenste twee doelsequenties en het maken van primers volgens het tekstprotocol, een lineair DNA-sjabloon door de PX330-plasmide te verdunnen tot 10 nanogram per microliter in nucleasevrij water. Bereid een master mix voor, voeg de polymerase toe aan het einde, en bewaar op ijs. Meng vervolgens en verdeel de oplossing in acht PCR-buisjes.
Voeg een microliter van PXR330 toe aan elke buis en voer het volgende programma uit. Gebruik vervolgens een PCR-zuiveringskit, een manifold en een vacuümbron om het PCR-product te zuiveren. Voeg vijf volumes bindingsbuffer toe aan één volume van het PCR-monster en meng.
Plaats de siliconenmembraanspinakolom op de manifold. Om DNA te binden, breng alle acht monsters toe op de kolom, in vacuüm. Om het monster te wassen, voeg 0,75 milliliter wasbuffer toe aan de kolom en vacuüm.
Vervolgens centrifugeer de kolom gedurende 60 seconden bij 12.000 keer G om resterend ethanol te verwijderen. Plaats de kolom in een schone 1,5 milliliter microcentrifugebuis en voeg vervolgens, om het DNA te elueren, 30 microliter nucleasevrij water toe aan het midden van de membraan. Laat de kolom een minuut staan en centrifugeer deze, 12.000 keer G gedurende 60 seconden.
Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de DNA-concentratie te meten. Om in vitro transcriptie uit te voeren met behulp van een t7 RNA-synthesekit, bereid de master mix voor en incubeer de reactie in een thermocycler bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Voeg 28 microliter nucleasevrij water en twee microliter DNAse toe en incubeer de reactie nog eens 15 minuten.
Om het RNA te zuiveren, lost u het poeder op dat zich in de meegeleverde spinkolom en 650 microliter nucleasevrij micro-injectiebuffer bevindt. Verwijder voorzichtig alle luchtbellen, sluit de buis af en hydrateer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf tot 15 minuten. Verwijder de blauwe dop aan de onderkant en plaats de kolom in een buisje van twee milliliter.
Centrifugeer vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 750 keer G bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de kolom in een verse 1,5 milliliter buis en breng 50 microliter van de RNA-oplossing druppelsgewijs aan op het centrum, zonder de kolomwand aan te raken. Spin vervolgens de kolom gedurende twee minuten bij 750 keer G.
Meet de RNA-concentratie en beoordeel de kwaliteit van het RNA volgens het tekstprotocol. Verdun het case negen mRNA tot 50 nanogram per microliter en de sgRNA's tot 12,5 nanogram per microliter voor gen-knockout experimenten, met behulp van nucleasevrij micro-injectiebuffer. Voeg het donortemplate toe met een concentratie van 200 nanogram per microliter, voor genoombewerking op basis van homologiegerichte reparatie en bewaar het op ijs.
Gebruik de aspiratoormondstuk om de eicellen te wassen met vier verse druppels caseïne-aminozuren. En breng ze over naar een laatste druppel casome acht medium, overdekt met minerale olie. Om pronucleaire injectie voor willekeurige integratie uit te voeren, gebruik onder de stereomicroscoop het aspiratoormondstuk om ongeveer 50 eicellen over te brengen naar een druppel m2 medium, overdekt met minerale olie die zal worden gebruikt als injectiekamer.
Breng de injectiekamer over naar een omgekeerd microscoop en injecteer de bevruchte eicellen met een paar picoliters van de injectiemix. De pronucleus zal opzwellen als de injectie succesvol is. Voer cytoplasmatische injectie uit voor gen-targeting, gebruik een mondstuk om ongeveer 50 eicellen over te brengen naar een druppel casome A, bevattende vijf microgram per milliliter cytochalasin B en incubeer de eicellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf minuten.
Breng de eicellen over naar de injectiekamer en injecteer vervolgens, bij zeer lage druk, een paar picoliters van de injectiemix in het cytoplasma. Gebruik waar mogelijk de compensatiedruk van de geautomatiseerde micro-injector. Na de injectie, gebruik het mondstuk om de eicellen terug te brengen in een druppel casomeaminozuren.
Bewaar ze bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat ze worden geladen voor re-implantatie in de eileider van de pseudozwangere vrouwtjes. Nadat een verstopte vrouwelijke muis is verdoofd volgens het tekstprotocol, om re-implantatie onder steriele omstandigheden uit te voeren, legt u het voortplantingskanaal bloot door een snee van een centimeter lang parallel aan de dorsale middenlijn te maken met behulp van een scalpel. Snijd vervolgens met een schaar de spier door en gebruik een pincet om het vetkussen vast te grijpen.
Trek voorzichtig de eierstok eruit, totdat het aangehechte eileider en baarmoeder duidelijk zichtbaar zijn. Gebruik vervolgens een vatklem om het vetkussen te fixeren. Gebruik onder de stereomicroscoop een paar micro-schaar om een incisie in de wand van de eileider te maken, een paar millimeter stroomopwaarts van de ampulla.
Laad ook onder de stereomicroscoop 25 micro-geïnjecteerde eicellen in het glazen capillair dat is verbonden met het mondstuk. Breng vervolgens het glazen capillair in de eileider in en drijft de eicellen uit totdat er een luchtbel zichtbaar is in de ampulla. Om er zeker van te zijn dat de re-implantatie is geslaagd, moet u controleren op de aanwezigheid van de luchtbel in de ampulla, wat garandeert dat alle eicellen op de juiste locatie zijn uitgedreven en er geen in het glazen capillair achterblijven.
Verwijder voor
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de procedures voor het genereren van genetisch gemodificeerde muizen door middel van microinjectie van oöcyten. Het benadrukt het belang van kwaliteitscontrole en genotyperingsstrategieën in zowel klassieke transgenese als CRISPR-gemedieerde gentargeting.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Transgenese
- Gentargeting
Achtergrond
- Microinjectie is een sleuteltechniek voor het creëren van genetisch gemodificeerde organismen.
- Het maakt zowel willekeurige integratie van transgenen als gerichte genbewerking mogelijk.
- Kwaliteitscontrole is cruciaal voor succesvolle resultaten in genetische modificaties.
- CRISPR-technologie verbetert de precisie in gentargeting.
Doel van het onderzoek
- Om een gedetailleerd protocol voor microinjectie in muizenoöcyten te verstrekken.
- Om onderzoekers te helpen bij het efficiënt genereren van genetisch gemodificeerde muizen.
- Om de laatste ontwikkelingen in microinjectietechnieken te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van single guide RNA met behulp van geselecteerde doelsequenties.
- Synthese van een lineair DNA-template van het PX330-plasmide.
- Creatie van een master mix voor PCR-amplificatie.
- Directe microinjectie van oöcyten voor genmodificatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van genetisch gemodificeerde muizen in ongeveer zes weken.
- Demonstratie van effectieve kwaliteitscontrolemaatregelen.
- Validatie van genotyperingsstrategieën voor het bevestigen van modificaties.
- Verbeterd begrip van microinjectietechnieken.
Conclusies
- Microinjectie is een betrouwbare methode voor het creëren van genetisch gemodificeerde muizen.
- Kwaliteitscontrole en genotypering zijn essentieel voor succesvolle resultaten.
- Dit protocol kan dienen als een waardevolle bron voor onderzoekers in de genetica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Genetically modified mouse models generated via oocyte microinjection are foundational for validating disease mechanisms and interrogating therapeutic hypotheses in preclinical research. The integration of CRISPR-based gene targeting with rigorous genotyping and quality control enables rapid, reproducible creation of knockout and knockin models, directly impacting target validation and translational continuity. This capability supports risk-adjusted portfolio decisions and accelerates early discovery to preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional interrogation of gene targets in vivo for mechanistic de-risking.
- Supports generation of both overexpression and loss-of-function models for pathway clarification.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target confidence assessment in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Provides validated genetic backgrounds for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Ensures reproducibility and standardization through robust genotyping and quality control.
- Enables scalable colony establishment for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic models with disease mechanisms for translational biomarker development.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation using precise genome editing.
- Reduces biological risk by enabling predictive in vivo studies prior to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection-based workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical model generation, supporting seamless progression from hypothesis to in vivo validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and mechanistic de-risking via rapid generation of genetically defined models.
- Screening: Delivers reproducible, quality-controlled models for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative genotyping and sequencing outputs for robust founder identification and model characterization.
- Translational Research: Enables alignment of genetic modifications with disease-relevant endpoints for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for ongoing model generation across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility through rigorous quality control and genotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, CRISPR guide design, and genotyping analysis.
- Demands access to specialized instrumentation for oocyte handling and microinjection.
- Necessitates cross-team standardization of quality control and genotyping protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or disease models.
- Efficiency and founder rates depend on optimization of each procedural step.
