Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation

Het doel van dit experiment is om de haalbaarheid aan te tonen om enzymen te fotoactiveren met behulp van nabij-infrarood straling. Caged-protein kinase A wordt geïmmobiliseerd op het oppervlak van upconversie nanodeeltjes die micro-geïnjecteerd worden in cellen en de kinase-geïnduceerde respons in levende cellen wordt waargenomen na nabij-infrarood straling. Traditionele fotoactivering vereist fototoxisch UV-licht en zal onvermijdelijk ongewenste chemische reacties en vergelijkbare reacties veroorzaken, echter, in onze vriendelijke opties, zoals nabij-infrarood straling, kan de reactie niet worden geactiveerd vanwege de lage energie.

Het upconversie nanodeeltje kan effectief een biovriendelijke lage energie nabij-IR foton omzetten in een hoog energie UV foton om een chemische reactie nabij het nanodeeltjeoppervlak te activeren zonder directe UV-straling. Kinase speelt een sleutelrol in oncogenesis, deze techniek kan ons helpen meer signaaltransductie-informatie te onderzoeken met veel minder interfererende ruis van UV-fototoxiciteit en de bijbehorende reactie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in dit veld moeilijkheden ondervinden bij het aanpassen van instrumenten en optische opstelling voor upconversietoepassing.

Om te beginnen, installeer een 4x objectieflens naast de cuvettehouder van de fluorospectrometer, zodat de laser in het midden van de cuvette kan worden gefocust. Plaats een instelbare 980 nanometer laserdiode 90 graden tegen de objectieflens. Installeer een volledige reflectiespiegel en de kruispunten van de lichtbaan van de objectieflens en de laser.

Vergeet niet een geanodiseerde metalen plaat te plaatsen om het excitatie-venster van de spectrometer te blokkeren om de binnendelen te beschermen. Plaats vervolgens een cuvette met silica gecoate opconversie nanodeeltjesoplossing in de houder. Een heldere upconversiebundel kan worden gevisualiseerd wanneer de laser wordt ingeschakeld.

Schakel de spectroscopie naar luminescentiemodus, met de laagste PMT-spanning tijdens de uitlijningen. Pas de spiegel en laserfasen aan zodat de bundel door het midden van de cuvette gaat voor de PMT om het sterkste signaal op te vangen. Na het installeren van een dichroische spiegel en een excitatiefilter, installeer een 980 nanometer laserdiode in de onderste laaglichtbaan.

Voeg een collimator toe tussen de laser en de spiegel om de NIR-bestraling in het brandpunt te verspreiden en te vergroten. Gebruik vervolgens een opconversie nanodeeltjesoplossing om de nabij-infrarode bundel te visualiseren. Pas de positie van de laserfase aan om de nabij-infrarode lichtbundel te centreren om de uitlijning te voltooien.

Voer caged-PKA-synthese uit en demobiliseer de caged-PKA/UCNP, om caged-PKA/UCNP te genereren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de activiteit van beide constructies vóór UV-fotolyse te meten, meet u de afname in NADH-absorbenten in de assaymix gedurende de tijd na de toevoeging van twee microliter PKA-oplossing aan de assaymix. Herhaal de meting voor PKA/UCNP.

Voer vervolgens UV-fotolyse uit bij 200 milliwatt per vierkante centimeter van caged-PKA en caged-PKA/UCNP, in een ijswaterbad, om ervoor te zorgen dat PKA kan worden geactiveerd. De PKA-activiteit wordt bepaald door een pyruvate kinase lactate dehydrogenase enzym-gekoppelde assay. Met een afname in NADH-absorbenten, wordt deze gemeten gedurende de tijd na de toevoeging van PKA-oplossing.

Incubeer de cellen in 10% foetaal bovien serum bevattend L15-medium tijdens de micro-injectieperiode voor stabiele pH-controle buiten de incubator. Configureer de naaldtrekker voor een kegelvormige punt met een diameter van ongeveer 1,5 micron voor latere puntopening. Voor het openen van de punt, installeer de naald op de micro-injector, beweeg de naaldpunt in contact met de rand van een dia en volg met een lichte knop op de microscoopstand.

Deze trillingskracht is voldoende om de punt licht te breken en de opening te vergroten. Onderzoek de naaldopening om er zeker van te zijn dat deze een buitendiameter heeft van 1,3 tot 1,5 micron, wat kan worden bevestigd door microscoopbeelden met behulp van een 40x objectieflens. Stel vervolgens de injectiedruk in van 50 tot 75 hectopascals met een gecomprimeerde interval van 200 tot 300 milliseconden en stel de constante compensatiedruk in op 15 tot 30 hectopascals om te voorkomen dat medium terugstroomt in de naald.

Laad het caged-PKA/UCNP complex met TAMRA-kleurstof op de achterpositie van de naald. De geladen naald wordt vervolgens ingesteld op een hydraulische micromanipulator met een hoek van 30 graden tot 45 graden. Controleer de naald met een microscoop om er zeker van te zijn dat er geen luchtbelletjes ontstaan na het laden van het monster.

Nadat de naald in het medium is ondergedompeld, schakel naar de fluorescentiemodus om een plotselinge kleurstoffentlasting te bevestigen wanneer injectiedruk wordt toegepast en een langzame kleurstoffentlasting wanneer compensatiedruk constant wordt toegepast. Schakel vervolgens over naar de fasecontrasterende heldere veldmodus om micro-injectie van cellen te starten. De membraanschokgolf kan worden waargenomen bij succesvolle injecties.

Was de cellen twee keer en controleer de geïnjecteerde cellen op co-geïnjecteerde TAMRA-fluorescentie om met succes micro-geïnjecteerde cellen te lokaliseren. Cellen met UCNP-toegang maar zonder een co-geïnjecteerd kleurstofsignaal, geven aan dat de celmembraan tijdens de injectie is gescheurd en moeten worden uitgesloten van verdere experimenten. Bestraal de cellen met een 980 nanometer laserdiode in de onderste laaglichtbaan, gefocust door een 10x objectieflens gedurende 15 minuten.

Laat een interval van vijf minuten tussen elke vijf minuten bestraling zitten om oververhitting te voorkomen. Als een kortere activeringstijd nodig is, zoals seconden of zelfs subseconden, schakel dan eenvoudig naar een 40x objectieflens voor een hogere focusfotondens. Na fotolyse en celherstel, fixeer de cellen in één milliliter of 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten, voorafgaand aan verdere alexa 594-kleuring.

Visualiseer tenslotte de