Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation

Het doel van dit experiment is om de haalbaarheid aan te tonen van het fotoactiveren van een enzym met behulp van nabij-infrarode bestraling. Gecaged proteïnekinase A is geïmmobiliseerd op het oppervlak van upconversion-nanodeeltjes die in cellen zijn gemicro-injecteerd, waarna de door kinase geïnduceerde respons in levende cellen wordt waargenomen na nabij-infrarode bestraling. Traditionele fotoactivatie vereist fototoxisch UV-licht en zal onvermijdelijk ongewenste chemische reacties en soortgelijke responsen co-induceren; echter, met onze gebruiksvriendelijke opties, zoals nabij-infrarode bestraling, kunnen dergelijke reacties niet worden getriggerd vanwege de lage energie.

Het upconversie-nanodeeltje kan bio-vriendelijke fotonen met lage energie in het nabij-IR-spectrum effectief omzetten in UV-fotonen met hoge energie om een chemische reactie nabij het oppervlak van het deeltje te triggeren zonder directe UV-bestraling. Kinase speelt een sleutelrol bij oncogenese; deze techniek kan ons helpen om meer informatie over signaaltransductie te onderzoeken met veel minder storende ruis door UV-fototoxiciteit en de bijbehorende nevenreacties. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in dit vakgebied tegen problemen aanlopen bij het aanpassen van instrumenten en de optische opstelling voor upconversietoepassingen.

Begin met het installeren van een 4x objectief lens naast de cuvethouder van de fluorospectrometer, zodat de laser in het midden van de cuvet kan worden gefocust. Plaats een instelbare 980 nanometer laserdiode onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de objectief lens. Installeer een volledig reflecterende spiegel op het snijpunt van het lichtpad van de objectief lens en de laser.

Vergeet niet een geanodiseerde metalen plaat te plaatsen om het excitatievenster van de spectrometer te blokkeren ter bescherming van de interne onderdelen. Plaats vervolgens een cuvet met silica-gecoate upconversion-nanodeeltjesoplossing in de houder. Een heldere upconversion-straal is zichtbaar wanneer de laser wordt ingeschakeld.

Zet de spectroscopie in luminescentiemodus, met de laagste PMT-spanning tijdens de uitlijning. Stel de spiegel- en laserpodia zo in dat de straal door het midden van de cuvet loopt, zodat de PMT het sterkste signaal oppikt. Installeer na het plaatsen van een dichroïsche spiegel en een excitatiefilter een 980 nanometer lasersdiodes in het lichtpad van de onderste laag.

Plaats een collimator tussen de laser en de spiegel om te helpen bij het diffunderen en vergroten van het NIR-bestralingsgebied in het brandvlak. Gebruik vervolgens een oplossing van upconversion-nanodeeltjes om de nabij-infraroodbundel te visualiseren. Pas de positie van de laserstage aan om de nabij-infraroodlichtbundel te centreren om de uitlijning te voltooien.

Voer de synthese van caged-PKA uit en demobiliseer de caged-PKA/UCNP om caged-PKA/UCNP te genereren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de activiteit van beide constructen vóór UV-fotolyse te meten, wordt de afname van de NADH-absorbentie in het assaymengsel in de loop van de tijd gemeten na toevoeging van 2 µL PKA-oplossing aan het assaymengsel. Herhaal de meting voor PKA/UCNP.

Voer vervolgens UV-fotolyse uit bij 200 milliwatts per vierkante centimeter van caged-PKA en caged-PKA/UCNP, in een ijswaterbad, om er zeker van te zijn dat PKA kan worden geactiveerd. De PKA-activiteit wordt bepaald door een gekoppelde enzymassay met pyruvaatkinase en lactaatdehydrogenase. Met een afname in NADH-absorbentie wordt de meting over een bepaalde tijd uitgevoerd na toevoeging van de PKA-oplossing.

Incubeer de cellen tijdens de micro-injectieperiode in L15-medium met 10% foetaal runderserum voor een stabiele pH-controle buiten de incubator. Configureer de naaldtrekker voor een kegelvormige tip met een diameter van ongeveer 1,5 microns voor het latere openen van de tip. Om de tip te openen, plaatst u de naald in de micro-injector, brengt u de naaldpunt in contact met de rand van een objectglas en beweegt u deze vervolgens voorzichtig met de knop op de microscooptafel.

Deze vibratiekracht is voldoende om de tip licht te breken en de opening te vergroten. Controleer de naaldopening om te bevestigen dat deze een externe diameter heeft van 1,3 tot 1,5 micron, wat kan worden geverifieerd met microscopiebeelden met een 40x objectief. Stel vervolgens de injectiedruk in op 50 tot 75 hectopascal met een overdrukinterval van 200 tot 300 milliseconden en stel de constante compensatiedruk in op 15 tot 30 hectopascal om terugstroming van het medium in de naald te voorkomen.

Laad het caged-PKA/UCNP-complex met TAMRA-kleurstof in de achterste positie van de naald. De geladen naald wordt vervolgens geplaatst op een hydraulische micromanipulator met één as, onder een hoek van 30 graden tot 45 graden. Controleer de naald met de microscoop om er zeker van te zijn dat er na het laden van het monster geen luchtbellen zijn ontstaan.

Nadat de naald in het medium is ondergedompeld, schakelt u over naar de fluorescentiemodus om te bevestigen dat er een plotselinge afgifte van kleurstof plaatsvindt wanneer de injectiedruk wordt toegepast, en een langzame afgifte van kleurstof wanneer de compensatiedruk constant wordt toegepast. Schakel vervolgens over naar de fasecontrast-brightfieldmodus om te beginnen met de micro-injectie van de cellen. De schokgolf van het membraan kan worden waargenomen bij succesvolle injecties.

Was de cellen twee keer en controleer de geïnjecteerde cellen op co-geïnjecteerde TAMRA-fluorescentie om succesvol gemicro-injecteerde cellen te lokaliseren. Cellen met UCNP-opname maar zonder signaal van de co-geïnjecteerde kleurstof duiden erop dat het celmembraan tijdens de injectie is gescheurd en moeten worden uitgesloten van verdere experimenten. Bestraal de cellen gedurende 15 minuten met een laserdiode van 980 nanometer in het lichtpad van de onderste laag, gefocust door een 10x objectief.

Houd na elke vijf minuten bestraling een donker interval van vijf minuten aan om opwarming te voorkomen. Indien een kortere activatietijd nodig is, zoals seconden of zelfs fracties van seconden, schakel dan over naar een 40x objectief voor een hogere gefocuste fotonendichtheid. Fixeer de cellen na fotolyse en celherstel gedurende 20 minuten in één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS, alvorens verder te gaan met kleuring met alexa 594.

Visualiseer ten slotte de door NIR geïnduceerde desintegratie van stressfibers. Na NIR-bestraling vertonen cellen die zijn gemicro-injecteerd met caged-PKA/UCNP, zoals aangegeven door de witte pijlen, upconversion-emissie. Desintegratie van stressfibers, veroorzaakt door een succesvolle PKA NIR-fotoactivatie, stelt meer f actin bloot en resulteert bijgevolg in een sterke groene kleuring nabij de UCNP.

Een negatieve controle waarbij de cellen worden gemicro-injecteerd maar in het donker blijven, vertoont geen desintegratie van stressvezels. Het niveau van f actin-blootstelling na NIR-fotoactivatie kan worden gekleurd met alexa 594, waarna dit met image J wordt geanalyseerd en gekwantificeerd. Intensiteitscurves van f actin-kleuring langs de rode pijl werden uitgezet, wat kwantitatieve informatie verschaft over de desintegratie van stressvezels, die kan worden gecorreleerd aan de NIR-geïnduceerde PKA-activiteit. Zodra men bekend is met micro-injectie, kan deze techniek binnen één dag worden uitgevoerd, inclusief de preparatie en de kwaliteitscontrole van caged-PKA/UCNP.

Met onze instructies voor de instrumentmodificaties en de experimenten kan de gewenste reactie worden getriggerd door nabij-IR, met een hoge ruimtelijk-temporele resolutie vergelijkbaar met traditionele UV-titratie-methoden, maar zonder de fototoxiciteit; het is niet schadelijk. Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed begrip heeft van hoe een enzym-nanodeeltjescomplex in een cel kan worden gebracht via micro-injectie en hoe het enzym kan worden foto-geactiveerd met cel-compatibel nabij-IR-licht. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van de chemische biologie die licht moeten gebruiken om gewenste enzymatische reacties in levende cellen te triggeren voor ruimtelijk-temporele resolutie wanneer de cel geen UV-fototoxiciteit kan tolereren.

Na deze procedure kunnen andere bio-effectoren worden gekoppeld aan upconversie-nanodeeltjes om aanvullende vragen te beantwoorden die spatiotemporele fotoactivatie vereisen. Als de bio-effector extracellulair werkt, is micro-injectie zelfs niet nodig. Het nabij-IR-fotoactivatieplatform kan bovendien een grotere penetratiediepte in weefsel bieden en kan daarom worden toegepast bij kleine dieren om gewenste reacties op het gegeven tijdstip en op de specifieke locatie uit te lokken.