Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Het algemene doel van deze methode is om te bepalen of twee of meer intercellulaire verbindingseiwitten gezamenlijk lokaliseren binnen cellen en om verder hun fysieke interactie te beoordelen via co-immunoprecipitatie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de biologie van het borstklierveld, inclusief de rollen die verbindingen spelen bij normale ontwikkeling en ziekten zoals borstkanker. Het grote voordeel van deze techniek is dat het significante informatie kan verschaffen over eiwit-eiwit interactie in vivo tegen relatief lage kosten.

Om co-immuno fluorescente kleuring uit te voeren, haal de juiste microscopische slides uit de vriezer. Fixeer onmiddellijk de secties door ze 15 minuten in vier procent formaldehyde bij kamertemperatuur te dompelen. Dompel vervolgens de slides in fosfaatgebufferde zoutoplossing bij kamertemperatuur.

Laat de slides daar staan totdat je doorgaat naar de volgende stap. Cirkel elke sectie van de slide met een commercieel verkrijgbare hydrofobe barrière of een waterafstotende laboratoriumpen. Voeg onmiddellijk druppels PBS toe aan het weefsel en plaats de slide in een menselijke histologiekamer voor de rest van de procedure.

Blokkeer elke weefselsectie met 100 tot 200 microliter van drie procent Rundeserumalbumine-Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% polysorbaat-20, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Terwijl de monsters blokkeren, bereid de primaire en secundaire antilichaamoplossingen voor door de antilichamen te verdunnen in TBS 0,1% polysorbaat-20. Nadat de blokkeeroplossing is verwijderd door aspiratie, incubeer de secties in 100 tot 200 microliter van de verdunde primaire antilichaamoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de primaire antilichaamoplossing door aspiratie en was de secties met 250 tot 500 microliter TBS 0,1% polysorbaat-20 gedurende vijf minuten. Verwijder de wasoplossing door aspiratie voordat je de wasstap twee keer herhaalt. Aspeer de wasoplossing en incubeer de secties met 100 tot 200 microliter van de juiste Fluoro-4 geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de secundaire antilichaamoplossing door aspiratie, was de secties met 250 tot 500 microliter TBS 0,1% polysorbaat-20 gedurende vijf minuten. Verwijder de wasoplossing en herhaal twee keer. Herhaal deze stappen met de juiste combinatie van primaire en secundaire lichamen voor eventuele aanvullende eiwitten van belang.

Na het verwijderen van de laatste was, voer de kleuring van de kernen uit door de sectie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in te kweken met 100 tot 200 microliter van één milligram per milliliter DAPI en TBS 0,1% polysorbaat-20. Aspeer de DAPI-oplossing en monteer de slides met een wateroplosbaar, niet-fluorescerend montagemiddel en dekglasjes. Plaats de slides plat in een koelkast van vier graden Celsius gedurende minimaal acht uur.

Ga door naar de fluorescentiemicroscopische beeldvorming zoals beschreven in het tekstprotocol. Verzamel 500 tot 1000 microgram van het lysate en verdun het in PBS tot elk een eindvolume van 200 microliter in elke 1,5-milliliterbuis. Voeg het antilichaam tegen het antigeen van belang toe aan de eerste buis met lysate en houd het op ijs.

Incubeer de buizen een nacht bij vier graden Celsius op een buisrolmixer op lage snelheid. De volgende dag voeg je 50 microliter magnetische kralen toe aan nieuwe 1,5-milliliterbuizen voor voorwas. Plaats de buizen met de kralen op de magnetische standaard en laat de kralen naar de magneet migreren.

Verwijder het opslagbuffer van de kralen met een 200-microliter pipette. Was de kralen door 500 microliter PBS 0,1% polysorbaat-20 toe te voegen en de buizen krachtig gedurende 10 seconden te vortexen. Doe de buizen vervolgens terug op de magnetische standaard en laat de kralen naar de magneet migreren.

Verwijder het overtollige wasbuffer door te pipetteren met een 200-microliter pipette. Voeg het lysate-antilichaamreactiecomplex toe aan de kralen en incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur op de rolmixer. Na de incubatie plaats je de buizen op de magnetische standaard en laat je de kralen naar de magneet migreren.

Zuig met een 200-microliter pipette het lysate en het afval af en plaats de buizen op ijs. Was de kralen twee keer door 500 microliter PBS toe te voegen, de buizen op de magnetische standaard te plaatsen en het vocht te verwijderen zoals eerder. Tijdens de wasstappen, vermijd het vortexen en houd de monsters op ijs.

Was de kralen eenmaal met PBS 0,1% polysorbaat-20 zonder te vortexen en gooi de laatste wasbuffer weg met behulp van een 200-microliter pipettetip. Voeg voor het elueren 20 microliter 0,2 molaar zure glycine toe aan de buizen en schud ze gedurende zeven minuten op de rolmixer. Na centrifugeren bij hoge snelheid gedurende enkele seconden, verzamel het supernatant in een frisse, ijskoude buis.

Herhaal de was- en elutiestappen voor elke buis. Voeg vervolgens 10 microliter 4x buffer toe aan het 40-microliter geëlueerde monster. Voeg onmiddellijk een molaire Tris toe aan de geëlueerde monsters, een druppel per keer, totdat de kleur blauw wordt, en ga dan verder met de volgende buizen.

Kook de geëlueerde monsters gedurende 10 minuten bij 70 tot 90 graden Celsius. Laad de bereide lysaten en de geprecipiteerde monsters zij aan zij in een SDS-PAGE acrylamidegel. Laat de gel draaien in loopbuffer bij 100 volt gedurende ongeveer 95 minuten, of totdat de rand van de migrerende eiwitten de bodem van de gel bereikt.

Transfer vervolgens de gels naar een nitrocellulose of PVDF membraan met behulp van een standaardprotocol. Blokkeer vervolgens het membraan gedurende een uur op een rocker op lage snelheid in vijf procent droge melk TTBS. Om te identificeren of de precipitatie succesvol was, sondeer het