Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Het algemene doel van deze procedure is om wereldwijde methyleringsprofielen te bestuderen en differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's te identificeren bij patiënten met chronische lymfatische leukemie met behulp van next-generation sequencing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de epigenetica, zoals de identificatie van potentiële CLL-specifieke signatuurgenen voor de pathogenese en prognose van de ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze volledige genoombrede dekking van CpG-methylering biedt op een onbevooroordeelde en PCR-onafhankelijke manier.

Gebruik als eerste een commercieel verkrijgbare DNA-extractiekit om genomisch DNA te isoleren uit de monsters van de patiënt en normale perifere bloedmononucleaire cellen, volgens het protocol van de fabrikant. Nadat het genomisch DNA is gekwantificeerd zoals beschreven in het tekstprotocol, worden 5 µg genomisch DNA van elk monster verdund tot een totaal volume van 200 µL met TE-buffer, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 25 ng/µL. Voer vervolgens sonicatie uit in speciaal ontworpen buisjes, met behulp van een sonicator, gedurende in totaal 30 cycli van 30 seconden aan en 30 seconden uit.

Centrifuge de buisjes na elke vijf cycli kort om de monsters naar de bodem te verzamelen. Controleer het sonicatiebereik voor alle monsters met behulp van DNA-elektroforese, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de magnetische streptavidine-beads voor te bereiden, moeten deze eerst worden resuspendeerd vanuit de stockbuis die bij de kit is geleverd.

Pipetteer de kraaltjes voorzichtig op en neer om een homogene suspensie te verkrijgen. Plaats voor elke vijf microgram gefragmenteerd DNA-monster 50 microliter van de kraaltjes in afzonderlijke, schone en gelabelde buisjes van 1,5 milliliter. Voeg 50 microliter 1X bead wash buffer toe om een eindvolume van 100 microliter te bereiken.

Plaats de buisjes gedurende één minuut op een magnetische standaard om alle magnetische beads te laten concentreren tegen de binnenwand van de buis aan de zijde van de magneet. Verwijder de vloeistof met een pipet van 200 microliter zonder de beads aan te raken. Verwijder vervolgens de buisjes van de magnetische standaard, voeg 250 microliters 1X bead wash buffer toe en meng de beads voorzichtig met een pipet.

Nadat deze stappen ten minste vier keer voor alle monsters zijn herhaald, worden de monsters tot slot geresuspendeerd in 250 microliters 1X bead wash buffer. Bewaar de monsters op ijs. Om het MBD-biotine-eiwit aan de gewassen beads te binden, wordt eerst 35 microliters eiwit aan afzonderlijke buisjes toegevoegd, waarna het totale volume wordt aangevuld tot 250 microliters met 1X bead wash buffer.

Voeg 250 µL verdund MBD-eiwit toe aan de 250 µL gewassen beads en laat deze bij kamertemperatuur end-over-end roteren. Nadat de beads gedurende één uur met het eiwit zijn gemengd, worden de eiwitgebonden magnetische streptavidine-beads gewassen door de buisjes gedurende één minuut op het magnetisch rek te plaatsen. Verwijder de vloeistof met een pipet zonder de beads aan te raken.

Voeg vervolgens 250 µL 1X bead wash buffer toe en plaats de buisjes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een rotatiemixer. Herhaal de wasstap nog twee keer voordat de gewassen MBD-biotine-beads opnieuw worden gesuspendeerd in 200 µL 1X bead wash buffer, zodat de beads gereed zijn voor de capture van gemethyleerd DNA. Voeg in een schoon, DNase-vrij buisje van 1,5 mL 100 µL bead wash buffer en 180 µL van het gefragmenteerde genomisch DNA toe.

Vul het uiteindelijke volume aan tot 500 µL met DNase-vrij water. Voeg 380 µL DNase-vrij water toe aan de resterende 20 L gefragmenteerd genomisch DNA. Vries de monsters in om ze later verder te verwerken en als input-DNA-controles te gebruiken.

Plaats de buisjes met gewassen MBD-biotine-beads gedurende één minuut op een magneethouder en verwijder de vloeistof zonder de beads te verstoren. Voeg vervolgens 500 µL gefragmenteerd genomisch DNA toe, verdund in bead-wasbuffer. Sluit alle buisjes stevig af met paraffinefolie en laat ze een nacht bij 4 °C rusten op een end-to-end rotatiestandaard bij 8 tot 10 omwentelingen per minuut.

Plaats na de bindingsreactie tussen het DNA en de MBD-beads de buisjes gedurende één minuut in het magnetische rek om alle beads tegen de binnenwand van de buis te concentreren. Verwijder de supernatant met een pipet zonder de beads aan te raken en bewaar deze fractie van het ongebonden DNA op ijs. Voeg vervolgens 200 µL 1X bead wasbuffer toe aan de beads en plaats de buisjes gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op het rotatiestandaard.

Verwijder de vloeistof met behulp van het magnetisch rek en herhaal de wasstap nog twee keer om het resterende unbound DNA te verwijderen. Voeg na de laatste wasbeurt 200 microliters van de in de kit meegeleverde high-salt elutiebuffer toe om het DNA te elueren. Plaats de buisjes vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op het roteerrek.

Plaats ze na incubatie gedurende één minuut op het magnetische rek en gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig over te brengen naar een nieuwe, schone buis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 200 µL high-salt elutiebuffer toe aan de beads en herhaal de elutie door de buisjes nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur te roteren. Voeg het tweede eluaat toe aan dezelfde buis die de 200 µL van het eerste eluaat bevat.

Om het DNA te precipiteren, voegt u één µL glycogeen, 40 µL 3 M natriumacetaat, pH 5.2, en 800 µL ijskoude absolute ethanol toe aan 400 µL geëlueerd DNA. Voeg de reagentia ook toe aan de eerder ingevroren 400 µL input DNA-controlemonsters. Meng de buisjes goed door te vortexen voordat u ze overnight incubeert bij -80 °C.

Centrifuge de buisjes de volgende dag 30 minuten bij 12 000 ×g en 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder het pellet te verstoren. Voeg vervolgens 500 µL 70% ethanol toe en vortex de buisjes.

Centrifuge de buisjes opnieuw onder dezelfde condities, maar gedurende 15 minuten, en verwijder vervolgens het supernatant voorzichtig met een pipet. Centrifugeer de buisjes daarna op maximale snelheid gedurende één minuut bij kamertemperatuur en verwijder het resterende ethanol volledig met een pipetpunt. Laat het pellet vijf minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

Voeg ten slotte 10 µL DNase-vrij water toe aan het DNA-pellet voordat u overgaat tot de kwantificering van gemethyleerd DNA, MBD-sequencing en analyse zoals beschreven in het tekstprotocol. De analyse identificeerde verschillende differentieel hyper- en hypogemethyleerde regio's die verrijkt waren in CLL-monsters vergeleken met normale controles. Deze differentieel gemethyleerde regio's werden toegewezen aan verschillende klassen eiwitcoderende en niet-coderende genen.

Ten slotte toonde de data-analyse een aanzienlijke overlap aan tussen de CLL-geassocieerde differentieel gemethyleerde regio's die verkregen zijn uit twee verschillende vergelijkingen met normale controles. Hier werden alle CpG-sites die zich bevinden in doelregio's van twee differentieel gemethyleerde genen gevalideerd in een groot aantal CLL-monsters middels pyrosequencing. Het optimale sonicatiedomein dat vereist is voor deze methode wordt hier geïllustreerd.

Dit bereik van gefragmenteerd DNA is ideaal en geschikter voor next-generation sequencing doeleinden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure zijn de cruciale factoren die het uiteindelijke DNA-herstel beïnvloeden de kwaliteit en de hoeveelheid van het gebruikte input-DNA en het bereik van het gefragmenteerde DNA na sonicatie.

We hebben besloten deze methode te gebruiken omdat dit de eerste wereldwijde methyleringsstudie naar CLL is die is gebaseerd op immunoprecipitatie voor het verrijken van gemethyleerd DNA, waarbij alle gemethyleerde regio's in het hele genoom worden bestreken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot prognose of therapie, aangezien de geïdentificeerde differentieel gemethyleerde signatuurgenen kunnen dienen als wereldwijde normale biomarkers en epigenetische doelwitten voor therapie. Na deze procedure kan het verrijkte gemethyleerde DNA worden gebruikt voor andere downstream-toepassingen, zoals hybridisatie of het uitvoeren van microarrays, om eenvoudig de metalomen tussen twee monsters of ziekte-entiteiten te vergelijken met behulp van een vaste set CpG-sites die op de arrays aanwezig zijn.

Ten slotte is dit een kosteneffectieve techniek om een groot aantal patiëntenmonsters te analyseren op gemethyleerde sequenties over het gehele genoom, inclusief geannoteerde sequenties die eiwitcoderende genen beslaan, cũng als niet-geannoteerde sequenties die repetitieve elementen en lange niet-coderende RNA's beslaan.