Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Het algemene doel van deze procedure is om globaal methylatieprofilering te bestuderen en differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfatische leukemie te identificeren met behulp van next-generation sequencing. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica, zoals identificatie van de potentiële CLL-specifieke signaalgenen voor ziektepathogenese en prognose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze volledige genomische dekking biedt van CpG-methylering op een onbevooroordeelde en PCR-onafhankelijke manier.

Gebruik om te beginnen een commercieel verkrijgbaar DNA-extractiekit om genomisch DNA te isoleren uit de patiënt en normale perifere bloedmononucleaire celmonsters volgens het protocol van de fabrikant. Na het kwantificeren van het genomische DNA zoals beschreven in het protocol, verdun 5 microgram genomisch DNA van elk monster tot een totaal van 200 microliters met TE-buffer, wat een uiteindelijke concentratie van 25 nanogram per microliter geeft. Voer vervolgens sonificatie uit in speciaal ontworpen buisjes, met behulp van een sonicator, voor een totaal van 30 cycli van 30 seconden aan en 30 seconden uit.

Na elke vijf cycli kortjes de buisjes centrifugeren om de monsters naar de bodem te verzamelen. Controleer het sonificatiebereik voor alle monsters met behulp van DNA-elektroforese zoals beschreven in het protocol. Om de magnetische streptavidin-kralen voor te bereiden, schorten ze eerst opnieuw op vanuit het voorraadbuisje dat door de kit wordt geleverd.

Pipetteer voorzichtig de kralen op en neer om een homogene suspensie te verkrijgen. Voor elke vijf microgram gefragmenteerd DNA-monster, plaats 50 microliters van de kralen in afzonderlijke, schone en gelabelde 1,5-milliliterbuisjes. Voeg 50 microliters van 1X bead wash buffer toe om een eindvolume van 100 microliters te bereiken.

Plaats de buisjes gedurende één minuut op een magnetische standaard om alle magnetische kralen te concentreren op de binnenwand van het buisje tegenover de magneet. Verwijder de vloeistof zonder de kralen aan te raken, met behulp van een 200 microliter pipette. Vervolgens verwijderen van de buisjes van de magnetische standaard, voeg 250 microliters van 1X bead wash buffer, en meng de kralen voorzichtig met een pipette.

Nadat deze stappen minstens vier keer zijn herhaald voor alle monsters, resuspendeer de monsters uiteindelijk in 250 microliters van 1X bead wash buffer. Houd de monsters op ijs. Om het MBD-biotine-eiwit aan de gewassen kralen te binden, voegt u eerst 35 microliters eiwit toe aan aparte buisjes en breng het totaalvolume op 250 microliters met behulp van 1X bead wash buffer.

Voeg 250 microliters van verdund MBD-eiwit toe aan de 250 microliters gewassen kralen en laat ze op kamertemperatuur draaien. Na het mengen van de kralen in eiwit gedurende één uur, wast u de eiwit-gebonden magnetische streptavidin-kralen door de buisjes gedurende één minuut op de magnetische standaard te plaatsen. Verwijder de vloeistof zonder de kralen aan te raken met behulp van een pipette.

Voeg vervolgens 250 microliters van 1X bead wash buffer toe en plaats de buisjes gedurende vijf minuten op een rotatiemixer bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap nog twee keer voordat de gewassen MBD-biotine-kralen worden gesuspendeerd in 200 microliters van 1X bead wash buffer, waardoor de kralen klaar zijn voor methyleerde DNA-opvang. Voeg in een schone 1,5-milliliter DNase-vrije buis 100 microliters van milliliter bead wash buffer en 180 microliters van het gefragmenteerde genomische DNA toe.

Breng het eindvolume op 500 microliters met DNase-vrij water. Voeg 380 microliters DNase-vrij water toe aan de resterende 20 liter van het gefragmenteerde genomische DNA. Vries de monsters in om ze later verder te verwerken en te gebruiken als input DNA-controles.

Plaats de buisjes met gewassen MBD-biotine-kralen gedurende één minuut op een magnetische standaard en verwijder de vloeistof zonder de kralen te verstoren. Voeg vervolgens 500 microliters van gefragmenteerd genomisch DNA toe, verdund in bead wash buffer. Sluit alle buisjes goed af met paraffinefolie en laat ze een nacht op een eind-aan-eind rotatiestandaard op 4 graden Celsius staan bij 8 tot 10 rotaties per minuut.

Na de DNA- en MBD-kraalbindingsreactie, plaatst u de buisjes gedurende één minuut op de magnetische standaard om alle kralen op de binnenwand van het buisje te concentreren. Verwijder de supernatantvloeistof met een pipette zonder de kralen aan te raken en bewaar deze ongebonden DNA-monsterfractie op ijs. Voeg vervolgens 200 microliters van 1X bead wash buffer toe aan de kralen en plaats de buisjes gedurende drie minuten op de roterende standaard bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de vloeistof met behulp van de magnetische standaard, herhaalt u de was nog twee keer om de resterende ongebonden DNA te verwijderen. Na de laatste was, voegt u 200 microliters van hoog-zout elutiebuffer toe, zoals aangegeven in de kit, om het DNA te elueren. Plaats vervolgens de buisjes gedurende 15 minuten op de roterende standaard bij kamertemperatuur.

Na incubatie, plaatst u ze gedurende één minuut op de magnetische standaard en gebruikt u een pipette om de supernatant voorzichtig over te brengen naar een nieuw, schoon 1,5-milliliterbuisje. Voeg vervolgens 200 microliters van hoog-zout elutiebuffer toe aan de kralen en herhaalt u de elutie door de buisjes gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur te draaien. Voeg de tweede elutie toe aan hetzelfde buisje dat de 200 microliters van de eerste elutie bevat.

Om het DNA te precipiteren, voegt u één microliter glycogeen, 40 microliters drie molar natriumacetaat, pH 5,2, en 800 microliters ijskoud absoluut ethanol toe aan 400 microliters geeluid DNA. Voeg ook de reagentia toe aan de eerder ingevroren 400 microliters van input