Protocollen voor C-Brick DNA Standard Assembly met behulp van Cpf1

De volgende video's beschrijven een procedure voor het gebruik van de C-Brick standaard om DNA-onderdelen te assembleren met behulp van CRISPR-geassocieerd eiwit, Cpf1. Deze methode kan de ontwikkeling van DNA-assemblage op het gebied van synthetische biologie bevorderen. Bijvoorbeeld door het constructie van complexe genetische circuits te vergemakkelijken.

Het grote voordeel van deze methode is dat het sequentie-onafhankelijk is en iteratieve assemblage van DNA-constructen mogelijk maakt. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat Cpf1 werd geleid door enkelvoudig siRNA en katalytisch DNA dat werd weggestapeld. Hierdoor werden DKN's gegenereerd.

Shi-Yuan Li, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om de crRNA-sjablonen te repareren, suspendeer de individuele oligonucleotiden in RNase-vrij water tot een concentratie van 10 micromolar. Voeg in een 0,2 milliliter PCR-buis topstreng-oligonucleïde, bodemstreng-oligonucleïde en 10x annealing buffer toe zoals beschreven in het bijbehorende document.

Zorg ervoor dat het totale volume 50 microliter is. Deze tabel toont zes verschillende bodemstreng-oligonucleïden, die elk afzonderlijk gekoppeld moeten worden met de topstreng, T7-F. De kleine letters vertegenwoordigen de sequentie die moet worden getranscribeerd in de gidssequentie van crRNA.

Plaats de PCR-buis in een thermocycler. Voer het annealing-programma uit met een initiële denitratie bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, en vervolgens een afkoeling van 95 tot 20 graden Celsius met een daling van één graad Celsius per minuut. Direct na annealing, voer onmiddellijk transcriptie uit door het geannealeerde product te combineren met RNase-vrij water, T-7 transcriptiebuffer, NTP-mengsel, recombinant RNase-remmer en T-7 RNase-polymerase in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Incubeer de reactie in een waterbad bij 37 graden Celsius overnacht. De volgende dag, gebruik een RNA-opruiming en concentratiekit om het getranscribeerd RNA te zuiveren. Gebruik een UV-Vis-spectrofotometer om het RNA te kwantificeren.

Verdun vervolgens het RNA tot een concentratie van 10 micromolar. Als de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt, bewaar ze dan bij 80 graden Celsius. De constructie van C-Brick-onderdelen kan op verschillende manieren worden bereikt.

In dit deel van de video worden drie chromoproteïnecassettes, cjBlue, eforRed en amilGFP, geassembleerd met behulp van de naadloze assemblagemethode. Begin met het ontwerpen en bestellen van de oligonucleotiden voor PCR-amplificatie van de chromoproteïnecassettes. Wanneer de oligonucleotiden aankomen, suspendeer ze in ultrapuur water tot een concentratie van 10 micromolar.

Vervolgens, om de PCR-reacties op te zetten, plaats 0,2 milliliter PCR-buizen op ijs. Voeg ultrapuur water, twee XPCR-buffer, DNTP's, voorwaartse en achterwaartse primers, chromoproteïnesjabloon en hooggetrouwe DNA-polymerase toe. Plaats de buizen direct in de thermocycler en voer het programma uit.

Gebruik de monsters onmiddellijk, of bevriest en bewaart ze bij 20 graden Celsius. Na amplificatie, zuiver de PCR-producten met behulp van een kit. Vervolgens, om de C-Brick standaardvector met BamH1 te verteren, voegt u ultrapuur water, plasmide, 10x buffer en BamH1 toe aan de buis.

Incubeer gedurende maximaal twee uur bij 37 graden Celsius in een waterbad. Zuiver de gelinieerde vector met behulp van een gelopruimingskit. Na de opruiming, combineer de gelinieerde vector, het PCR-product, 5x naadloze assemblagebuffer en naadloze assemblage-enzym uit een naadloze assemblagekit in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Zorg ervoor dat het totale volume 10 microliter is. Plaats dit in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 30 minuten. Na de incubatie, gebruik de monsters onmiddellijk of bevriest ze op ijs en bewaart ze bij 20 graden Celsius.

Voeg 10 microliter van het construct toe aan 90 microliters van e coli DH10B. Voer een chemische transformatie uit. Verspreid vervolgens de getransformeerde cellen op een LB-plaat en incubeer bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, selecteer verschillende klonen om in vijf milliliter vloeibare LB-buizen te kweken en incubeer ze bij 37 graden Celsius op een shaker bij 220 rpm overnacht. Extraheer het plasmide met behulp van een plasmidevoorbereidingskit. Identificeer vervolgens de juiste klonen door Sanger-sequencing.

Weet dat de constructie van C-Brick-paden ook kan worden bereikt door de reactieve PCI-toepassing, of door restrictie in de onmiddellijke vertering van T4 DNA-ligase medium tot ligatie. Vervolgens, om de C-Brick-vector met Cpf1 te verteren, combineer RNase-vrij water, 10x Cpf1-buffer, het plasmide, recombinant RNase-remmer en Cpf1 in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Om een ​​vreemde DNA-fragment in de T1- en T2-sites in te voegen, voegt u één microliter crRNA T2 toe en incubeer de buis in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Vervolgens, terwijl de buis in het waterbad blijft, voegt u één microliter crRNA T1 toe, één microliter Cpf1 en incubeert u gedurende nog eens 30 minuten. De crRNA T2 wordt eerst toegevoegd, omdat de twee herkenningsplaatsen dichter bij het vector-DNA liggen. Cpf1-binding op de T1-plaats kan de bedden van de T2-plaats beïnvloeden.

Ook, als de T2'plaats de T2-plaats zou vervangen, zou de T2'plaats worden verstoord als de crRNA T1 eerst werd toegevoegd. Voeg één microliter thermogevoelige alkalische fosfatase toe en incubeer de buis in een 37 graden Celsius waterbad gedurende nog eens een uur. Voer agarosegelelektroforese uit en zuiver de vector met behulp van een gelopruimingssysteemkit.

Gebruik de monsters onmiddellijk, of bevriest en bewaart ze bij 20 graden Celsius. Om het DNA-fragment van belang met Cpf1 te verteren, combineer RNase-vrij water, 10x Cpf1-buffer, plasmide, recombinant RNase-remmer en Cpf1 in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Om een ​​vreemde DNA-fragment in de T1- en T2-sites in te voegen, voeg