Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Het algemene doel van dit experiment is om de verschillende markers te beoordelen die worden uitgedrukt door macrofaag-subpopulaties binnen het centrale zenuwstelsel of CZS. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de neuro-immunologie te beantwoorden, zoals duperry-macrofagen terwijl we proberen CZS-dizzies te doen, en wat zijn de fenotipen van CZS in macrofagen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de isolatie van een groot aantal hoog gezuiverde macrofaag-subpopulaties, evenals een contificatie van macrofaag-subpopulatie-celmarkers.

Begin met het gebruik van fijne schaar om de ventrale huid net onder het xiphoïdproces te snijden om de thoraxholte bloot te leggen. Maak een incisie in het diafragma en snijd de laterale aspecten van het ribbenkast in een caudale tot rostrale richting om het hart bloot te leggen. Na het identificeren van de linker ventrikel en de rechter atrium, breng een vlinderkatheter met een 25 gauage naald in de linker ventrikel.

Maak een incisie op het rechter atrium en begin met het doordrenken van 20 milliliter PBS via de katheter met een snelheid van tien milliliter per minuut zodra het bloed begint te stromen. Een succesvolle doordrenking zal worden aangegeven door een verbleken van de longen en de lever terwijl het bloed wordt verplaatst. Gebruik vervolgens fijne schaar om de wervelkolom te dissecteren.

Verwijder de buikwandmusculatuur op de ventrale zijde van de wervelkolom en snijd de wervelkolom aan de basis van de staart om de wervelkolom te verwijderen terwijl deze wordt geoogst. Breng een tien milliliter spuit van PBS met een aangepaste 200 microliter pipettentip in de lumbale zijde van de wervelkolom. Spoel vervolgens het ruggenmerg aan de cervicale zijde.

Verwijder de huid boven de schedel en steek een punt van de schaar in de basis van de schedel. Snijd het schedeldak volgens de sagittale sutuur. Breng vervolgens kleine pincetten in de snede en verwijder voorzichtig de bovenkant van de schedel.

Dissecteer de hersenen uit de muizenkop en verwijder de reukbol en het cerebellum. Plaats vervolgens de hersenen en het ruggenmerg in een punt vijf milliliter buisje dat een punt eenentwintig twee acht milliliters verteringscocktail bevat. Om de cellen te dissociëren, gebruik kleine schaar om de hersenen en het ruggenmerg fijn te snijden in één tot twee kubieke millimeter stukken en plaats de stukken bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide gedurende 30 minuten.

Aan het einde van de incubatie, stop de vertering met 20 microliters nul punt vijf molaire EDTA, gevolgd door voorzichtig trituren met een vijf milliliter pipetten. Filter de resulterende celsuspensie door een 70 micron gaasfilter in een 50 milliliter conische buis met behulp van de plunjer van een tien milliliter spuit om eventueel overgebleven hersen- of ruggenmergweefsel voorzichtig te vermalen. Spoel de filter met twintig milliliters vijf procent FBS en PBS.

En verzamel de gefilterde cellen door centrifugatie. Aspibeer vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voor dichtheidsgradiëntscheiding van de cellen, suspenderen we de pellet met vier milliliters 30 procent dichtheidsgradiënt medium, en brengen de cellen over in een 15 milliliter conische buis.

Leg voorzichtig vier milliliters 37 procent dichtheidsgradiënt medium onder, gevolgd door vier milliliters 70 procent dichtheidsgradiënt medium onder het 37 procent dichtheidsgradiënt medium. Breng de buis over naar een tafelcentrifuge om de cellen te scheiden. De microglia en macrofaagcellen zullen zich bevinden op het grensvlak van de 70 en 37 procent dichtheidsgradiëntlagen.

De buis zal gestratifieerd lijken. Na voorzichtig het verwijderen van de bovenste laag myeline, breng drie tot vier milliliters van de microglia-macrofaag-interfase-laag over in een nieuwe 15 milliliter buis. Was vervolgens de immuuncellen met drie centrifuges in 15 milliliters PBS, waarbij het pellet na de laatste wasbeurt opnieuw wordt gesuspendeerd in één milliliter PBS.

Om de expressie van macrofaag-subpopulatiemarkers te beoordelen, breng de cellen over in een vijf milliliter flowcytometrieanalysebuisje, gevolgd door de toevoeging van één microliter fixeerbaar dood celkleuringsreagens. Na 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht, was de monsters in twee milliliters PBS en resuspendeer het pellet in 400 microliters fax-buffer per experimenteel analysebuisje. Splits de cellen in het juiste aantal vijf milliliter flowcytometrieanalysebuisjes.

Blokkeer vervolgens de niet-specifieke FC-receptorbinding met één microgram CD 16 CD 32 blokkerende antilichaamcocktail per 100 microliters cellen voor een incubatie van 10 tot 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Label vervolgens de cellen met 100 microliters van de juiste primaire antilichamen, voor een incubatie van 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in twee milliliters PBS vier keer.

Voeg vervolgens 100 microliters van de juiste secundaire antilichamen toe gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht, gevolgd door vier wasbeurten in PBS zoals zojuist is aangetoond. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de pellets voorzichtig in 100 microliters van één procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was vervolgens de cellen vier keer in PBS.

Resuspendeer de laatste pellets in 200 microliters vers PBS en analyseer de cellen door flowcytometrie. Hersen- en ruggenmerg-afgeleide microglia en monocyte-afgeleide macrofagen worden geïdentificeerd op basis van hun CD 11 B en CD 45-expressie. De expressie van CX3CR1 en Tmem119 door de CD 11 B-positieve CD 45-medium microgliale cellen maakt het mogelijk om deze celpopulatie verder te onderscheiden van de CD 11 C-positieve CD 45-hoge monocyte-afgeleide macrofagen, die geen van deze markers tot expressie brengen, maar wel CCR2.

Na dichtheidsgradiëntscheiding is 85 tot 95 procent van de cellen nog steeds levensvatbaar. Bij afwezigheid van dichtheidsgradiënt