Name: Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer de analyse van microglia en monocyt-afgeleide macrofagen uit het centrale zenuwstelsel door flow cytometry bij volwassen muizen. Deze methode identificeert subpopulaties en hun markers voor neuroimmunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer en Bpifrance. Ons laboratorium wordt ook ondersteund door Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie en het programma &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Wij danken de hulp van de CELIS celcultuur kern faciliteit.

Alle methoden die hier beschreven zijn, zijn goedgekeurd door het Institusioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee bij het ICM-Instituut en door het Darwin Frans Etisch Diercommissie en zijn onder het protocol 01407.02 behandeld. 1. Bereiding <ol><li> Bereid de spijsverteringscocktail in een 1,5 ml buis door het volgende voor elke muis te combineren: 1 ml fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS); 123 μL spijsverteringsenzym (zie tabel van materialen) bij 13 wunsch / ml (voorraadoplossing), uiteindelijke concentratie 1,6 wunsch / ml; En 5 μl DNase I (zie tabel van materialen) bij 100 mg / ml (voorraadoplossing), uiteindelijke concentratie 0,5 mg / ml. </li></ol> 2. Perfusie en Dissectie <ol><li> Euthanize de muizen met een dodelijke dosis pentobarbital (100 μl bij 400 mg / ml). </li><li> Plaats het dier in de rugstand en nat het lichaam met 70% ethanol. </li><li> Snijd de ventrale huid met fijne schaar net onder het xyphoide proces om de thoracale holte bloot te stelleny. </li><li> Maak een incisie in het diafragma en snijd de zijdelingse aspecten van de ribbekooi met een fijne schaarser in een rooster naar de radiale richting om het hart bloot te stellen (en voorkom dat andere organen worden gesneden). Identificeer de linker ventrikel (LV) en het rechter atrium (RA). </li><li> Plaats een vlinderkatheter met een 25 G-naald in de LV. Maak een incisie op de RA met een fijne schaar en begin bij de bloedstroom perfusie bij 10 mL / min doorstroming door de LV met 20 mL PBS om cellen en bloed uit vaten te verwijderen; Succesvolle perfusie wordt genoteerd door het blancheren van de longen en de lever als bloed ontheemd wordt. </li><li> Decapiteer het dier met een middelste schaar. Dissecteer de wervelkolom met fijne schaar en scheid het van het lichaam door de buikwandmuskulatuur op de ventrale kant van de wervelkolom te verwijderen en door de wervelkolom aan de basis van de staart te snijden. </li><li> Plaats een 10 ml spuit met PBS en een gemonteerde 200 μL pipettip in de lumbale zijde vanDe wervelkolom en spoel het ruggenmerg aan de cervicale kant. OPMERKING: De 200 μL pipettip is met een schaar aan het breedste punt (ongeveer 1 cm) gesneden en stevig op een 10 ml spuit die eerder met PBS is gevuld, ingebracht. </li><li> Verwijder de huid boven de schedel en gebruik tang om de hersenen bloot te stellen. Plaats een schaarblad aan de basis van de schedel en snijd het kran na de sagittale hechting. Plaats kleine tang in de snede en lig de schedel voorzichtig op. Dissect de hersenen van het hoofd van de muis en verwijder de olfactorische bol en cerebellum. </li><li> Verzamel de hersenen en het ruggenmerg in een 1,5 ml buis die 1.128 ml PBS bevat met spijsverteringskrokie (van stap 1.1). </li></ol> 3. Cell Dissociation <ol><li> Snijd de hersenen en ruggenmerg in de 1,5 ml buis (stap 2.9) in 1-2 mm 3 stukken met een kleine schaar ( afbeelding 1 ). </li><li> Incubeer de 1,5 ml buis die de gehaktweefsels gedurende 30 minuten in een incuba bevatBij 37 ° C met 5% CO 2 . OPMERKING: Bereid de dichtheidsgradiënt op in deze stap. </li><li> Voeg 20 μL 0,5 M EDTA (voorraadoplossing), eindconcentratie 10 mM, toe aan de 1,5 ml buis om de enzymatische reactie te stoppen. </li><li> Maak een celvering voorzichtig door pipettering omhoog en omlaag met een 5 ml pipet. </li><li> Pas de celsuspensie door een nylon gaas (70 μm poriegrootte) in een 50 ml buis met behulp van de zuiger van een 10 ml spuit. </li><li> Was het nylon gaas met 20 ml 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS. </li><li> Centrifuge gedurende 7 minuten (300 xg) bij kamertemperatuur (18 ° C). Gooi de supernatant door aspiratie en ga verder naar de volgende stap. Wees uiterst voorzichtig bij het verwijderen van de supernatant; Verstoor de pellet niet, die gemakkelijk door de aspiratiepipet kan worden gezocht. </li></ol> 4. Dichtheid Gradiënt <ol><li> Berei een voorraadoplossing van het dichtheidsgradiëntmedium op door de juiste hoeveelheid 10x PBS toe te voegen aan het dichtheidsgradiëntmedium. OPMERKING: voeg een deel 10X PBS toe aan negen delen dichtheidsgradiënt medium. </li><li> Verdun het voorraaddichtheidsgradiëntmedium met 1x PBS voor de verschillende percentages zoals beschreven in Tabel 1 . </li><li> Resulteer de pellet (vanaf stap 3.7) met 4 ml 30% dichtheidsgradiëntmedium en overbrengen naar een 15 ml buis. </li><li> Plaats een Pasteur pipette in de bodem van de 15 ml buis en langzaam onderlaag 4 ml 37% dichtheidsgradiënt medium. </li><li> Voeg 4 ml 70% dichtheidsgradiëntmedium toe zoals hierboven beschreven. </li><li> Centrifugeer het verloop gedurende 40 minuten (800 xg) bij kamertemperatuur (18 ° C). Zorg ervoor dat de centrifuge met minimale of geen rem stopt, zodat de interfase niet wordt gestoord. OPMERKING: De buis wordt gestratificeerd. De cellen gelaagd bij de 70% - 37% dichtheidsgradiëntinterface zijn de mononucleaire immuuncellen (microglia en macrofage subpopulaties); De bovenste niveaus zijn respectievelijk celresten en myelin ( figuur 2 ). </li><lI&gt; Gebruik een transferpipette, verwijder de laag van myelin voorzichtig. </li><li> Verzamel 3-4 ml van de 70-37% dichtheidsgradiënt interfase die de macrofage subpopulatie cellen bevat in een schone 15 ml buis. </li><li> Was de cellen 3x met PBS, totaal volume van 15 ml. Zorg ervoor dat het dichtheidsgradiëntmedium dat de cellen bevat, tenminste driemaal verdund worden met PBS en gedurende 7 minuten (500 xg, 4 ° C) met de rem &quot;aan&quot; centrifugeren. </li><li> Resuspendeer de celpellet met 1 ml PBS voor celmerken of voor andere functionele assays. </li></ol> 5. Celtikettering voor flowcytometrie <ol><li> Breng de cellen over (stap 4.10) in een flowcytometriebuis. </li><li> Voeg 1 μl fixeerbare dode celvlekreagens toe aan elk celmonster verkregen in stap 4.10. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. </li><li> Was de cellen eenmaal met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten (300 xg, 4 ° C). </li><li> Verwijder de supernatant en resuspende de celpelletje met400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide. </li><li> Voeg 1 μg CD16 / CD32 antilichamen toe aan 100 μl van de cellen om de Fc receptoren te blokkeren. Incubeer 10-15 minuten op ijs, beschermd tegen licht. </li><li> Bereid de primaire antilichamenmix in PBS 1% BSA, 0,1% azide of PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponine, voor celpermeabilisatie voor intracellulaire kleuring. </li><li> Voeg 100 μL primair antilichamen mix (2x) toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. OPMERKING: Alle antilichamen moeten worden getitreerd voordat u het experiment uitvoert om optimale resultaten te garanderen. </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten (300 xg, 4 ° C). Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Voeg 100 μl van een secundair antilichaam toe als de primaire antilichamen niet direct geconjugeerd zijn met een fluorofoor, en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij 4 ° C). Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Repareer deCellen met 100 μl 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. OPMERKING: Let op: PFA is giftig. Gebruik in een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij 4 ° C. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Resuspendeer de celpellet met 200 μl PBS en ga verder naar flow cytometrie acquisitie en analyse. Volg de gate strategie in Figuur 3 . </li></ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).</li>
<li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages%3A+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocyte-derived+macrophages%3A+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).</li>
<li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li>
<li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li>
<li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25107477">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression%2C+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li>
<li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li>
<li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX%283%29CR1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li>
<li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li>
<li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer%27s+disease+models%3A+effects+of+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia%3A+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li>
<li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22079990">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
<li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li>
<li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-associated+microglia+and+macrophages%2Fmonocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li>
<li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Het is aangetoond dat de microglia en MDM verschillende functies en fenotypen in het CNS hebben en daarom zijn de identificatie en analyse van deze macrofage subpopulaties essentieel om de neurologische ziekten 9 , 18 , 25 beter te begrijpen. Flowcytometrie analyse met behulp van twee markers (CD11b en CD45) maakt het onderscheid mogelijk tussen elke subpopulatie ( Figuur 3C ). Deze strategie werd ...

De microglia zijn de parenchymale weefsel-ingezeten macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen twee belangrijke functionele rollen: immuniteitsverdediging en onderhoud van de CNS homeostase. In tegenstelling tot de MDM, die voortdurend worden vernieuwd van de hematopoietische stamcellen in het beenmerg, onderscheiden de microglcellen zich van primitieve hematopoietische stamcellen die afkomstig zijn uit de dooierzak (YS) die de hersenen coloniseerde tijdens de embryonale ontwikkeling 1 , 2 , 3 . Bij knaagdieren speelt de transcriptiefactor Myb een cruciale rol in de ontwikkeling van alle botmengsel afgeleide monocyten en macrofagen, maar voor YS-afgeleide microglia is deze factor onafwendbaar en differentiatie blijft afhankelijk van de transcriptiefactor PU.14. In het gezonde CNS zijn microglia dynamische cellen die hun omgeving constant sconenNning en opmeting voor invallende pathogenen of weefselschade 5 . De detectie van dergelijke signalen initieert een weg om het letsel op te lossen. De microglia verandert snel van een geamplificeerde morfologie naar een amoeboid, die gevolgd wordt door fagocytose en vrijlating van verschillende mediators, zoals pro- of anti-inflammatoire cytokinen. Zo kan, afhankelijk van hun microomgeving, geactiveerde microglia een spectrum van verschillende primingstaten 6 verwerven. De microglia beïnvloedt de ontwikkeling en de voortgang van veel neurologische aandoeningen. In de knaagdiermodellen van de ziekte van Alzheimer (AD) 7 , Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) 8 , Multiple Sclerose (MS) 9 of Parkinsonziekte (PD) 10 , blijkt de microglia een dubbele rol te spelen, hetzij veroorzaken van nadelige neurotoxiciteit of het optreden van Op een neuroprotectieve manier, die afhankelijk is van oN de specifieke ziekte, het ziekte stadium en of de ziekte werd beïnvloed door het systemische immuuncompartiment 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De meeste van de CNS-letsels waargenomen in de bovengenoemde ziekten bevatten een heterogene populatie van myeloïde cellen, waaronder niet alleen parenchymale microglia, maar ook perivasculaire en meningale macrofagen, evenals CNS-infiltrerende MDM. Deze celtypen kunnen differentieel bijdragen aan de pathofysiologische mechanismen die verband houden met verwonding en reparatie 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . De huidige uitdaging voor onderzoekers die deze ziektemodellen bestuderen, is om vast te stellen of de perifere monocyten en macrofagen het CNS infiltreren en zoDe inwoner microglia van deze cellen. Inderdaad, de microglialcellen zijn zeer plastic; Wanneer ze geactiveerd worden, herhalen de microglia markers die gewoonlijk worden uitgedrukt door perifere monocyten en macrofagen. Het probleem is derhalve gebaseerd op het identificeren van markers die de residente microglia kunnen onderscheiden van de infiltrerende monocyten en macrofagen. De discriminatie van deze populaties op hersenplakken door immunohistologische toepassingen is beperkt door het gebrek aan specifieke antilichamen. Flowcytometrie-analyse is echter een efficiënte techniek om de expressie van verschillende markers te beoordelen en celpopulaties te onderscheiden (bijvoorbeeld lymfocyten, macrofagen / MDM CD11b + CD45 high en microglia CD11b + CD45 med ), evenals subpopulaties 16 van de cel , 17 , 18 . Dit protocol beschrijft de procedures voor het isoleren van deMononucleaire cellen uit het CNS van de muis in neurologische ziekte modellen door gebruik te maken van een geoptimaliseerde, enzymatische weefdissociatie en een dichtheidsgradiëntcentrifugatie; Evenals een methode voor het differentiëren van de microglia- en MDM-populaties in het CNS door gebruik te maken van flowcytometrie. Een andere benadering is om de myelin te elimineren en de cellen te zuiveren door gebruik te maken van magnetische kralen geconjugeerd aan specifieke antilichamen 19 , 20 , 21 . Het verwijderen van myelin met behulp van anti-myelin magnetische kralen is duurder en beïnvloedt de levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde cellen 22 . Deze stap en de volgende immunomagnetische scheiding van de microglia beperken verdere studies van specifieke immuuncellenpopulaties 21 , 22 . Deze procedures bieden een makkelijke manier om de macrofage subpopulaties bij ziekteontwikkeling te bestuderen, enHet bepalen van de geneesmiddeleffecten of genmodificaties op macrofagenfenotypen en activeringsstaten.

<table><tbody><tr><td>5 month-old Mice</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Digestie-enzym</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I uit bovien pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Dichtheidsgradientmedium</td></tr><tr><td>Cell Strainer maat 70 &micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Pistonspuit 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpijp 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL buisje</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL buisje</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buisje</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyreen buisje met ronde bodem</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) zonder Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) zonder Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine oplossing 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 32% Oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Voorzichtig -Toxisch</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Rat anti-muis CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rat anti-muis CD45 (clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rat IgG2b, &kappa; Isotype Control RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-muis TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Ezel anti-konijn IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muis CD16/CD32 Gezuiverd</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Muis Fc Block</td></tr><tr><td>Fixable Dead Cell Stain Kits</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Muis CCR2 APC-geconjugeerd Antilichaam</td><td>R&amp;D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2B APC-geconjugeerd Isotype Control</td><td>R&amp;D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Muis CX3CR1 PE-geconjugeerd Antilichaam</td><td>R&amp;D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>Geit IgG PE-geconjugeerd Antilichaam</td><td>R&amp;D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Cel analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Data Analyse Software</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Standaard Patroontang</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schaar</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Tang</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van microglia en monocyt-afgeleide macrofagen uit het centrale zenuwstelsel door flow cytometry

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Talrijke studies hebben de rol van immuuncellen, in het bijzonder macrofagen, in pathologieën van het centrale zenuwstelsel (CNS) aangetoond. Er zijn twee belangrijke macrofage populaties in het CNS: (i) de microglia, die de inwendige macrofagen van het CNS zijn en afgeleid zijn van de bloedsomlooppromotoren tijdens embryogenese, en (ii) de monocyt-afgeleide macrofagen (MDM), die kunnen infiltreren Het CNS tijdens de ziekte en zijn afgeleid van beenmerg progenitors. De rollen van elke macrofage subpopulatie verschillen afhankelijk van de pathologie die wordt bestudeerd. Verder is er geen consensus over de histologische markers of de onderscheidende criteria die voor deze macrofage subpopulaties worden gebruikt. De analyse van de expressieprofielen van de CD11b- en CD45-markers door middel van flowcytometrie laat ons echter toe om de microglia (CD11b + CD45 med ) van de MDM (CD11b + CD45 high ) te onderscheiden. In dit protocol laten we zien dat de dichtheidsgradiëntcentrifugatieEn de flow cytometry analyse kan worden gebruikt om deze CNS macrofage subpopulaties te karakteriseren, en te onderzoeken verschillende markers van interesse uitgedrukt door deze cellen zoals we onlangs gepubliceerd. Zo kan deze techniek ons ​​begrip van de rol van macrofagen in muismodellen van neurologische aandoeningen verlenen en kunnen ook gebruikt worden om medicijn effecten op deze cellen te evalueren.

Na de dichtheidsgradiëntcentrifugatie en antilichamenkleuring werden de cellen verkregen op een stromingscytometer en geanalyseerd onder toepassing van een morfologische poortstrategie als volgt. Een eerste poort werd gedefinieerd in het dot plot Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Spreaded-Height (FSC-H) om enkele cellen van dubbele cellen te onderscheiden ( Figuur 3A ). De enkelvoudige cellen werden vervolgens gelicht op FOT-A versus...

Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Het algemene doel van dit experiment is om de verschillende markers te beoordelen die tot expressie komen door macrofaag-subpopulaties binnen het centrale zenuwstelsel of CZS. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuro-immunologie, zoals de aanwezigheid van macrofagen in het CZS en wat de fenotypen van macrofagen in het CZS zijn. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de isolatie van een groot aantal hooggezuiverde macrofaag-subpopulaties, evenals de kwantificering van celmarkers van macrofaag-subpopulaties.Begin met het gebruik van een fijne schaar om de ventrale huid net onder het xiphoïdusproces door te snijden om de borgholte bloot te leggen. Maak een incisie in het diafragma en snijd de laterale aspecten van de ribbenkast in caudale naar rostrale richting om het hart bloot te leggen. Nadat de linker ventrikel en het rechter atrium zijn geïdentificeerd, brengt u een vlindernaald met een 25 gauge naald aan in de linker ventrikel.Maak een incisie in het rechteratrium en begin met het perfuseren van 20 milliliters PBS via de katheter met een snelheid van tien milliliters per minuut zodra het bloed begint te stromen. Een succesvolle perfusie wordt aangegeven door het bleker worden van de longen en de lever naarmate het bloed wordt verdrongen. Gebruik vervolgens een fijne schaar om de wervelkolom te dissekeren.Verwijder de musculatuur van de buikwand aan de ventrale zijde van de wervelkolom en snijd de wervelkolom door bij de basis van de staart om de ruggengraat te verwijderen terwijl deze wordt geoogst. Plaats een spuit van 10 mL met PBS, voorzien van een aangepaste pipetpunt van 200 µL, in de lumbale zijde van de wervelkolom. Spoel vervolgens het ruggenmerg aan de cervicale zijde door.Verwijder de huid boven de schedel en steek één punt van de schaar in aan de basis van de schedel. Snijd de schedel open langs de sagittale naad. Steek vervolgens een kleine pincet in de incisie en verwijder voorzichtig de bovenkant van de schedel.Disseceer de hersenen uit de kop van de muis en verwijder de bulbus olfactorius en het cerebellum. Plaats vervolgens de hersenen en het ruggenmerg in een buisje van 1,5 ml met 1,128 ml digestiecocktail. Gebruik een klein schaartje om de hersenen en het ruggenmerg fijn te knippen in stukjes van 1 tot 2 mm³ om de cellen te dissociëren, en incubeer de stukjes 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.Stop aan het einde van de incubatie de digestie met 20 µL 0,5 M EDTA, gevolgd door voorzichtig tritureren met een pipet van 5 ml. Filter de resulterende cel-suspensie door een zeef met een maaswijdte van 70 µm in een conische buis van 50 ml, waarbij de plunjer van een spuit van 10 ml wordt gebruikt om eventueel overgebleven hersen- of ruggenmergweefsel voorzichtig te macereren. Spoel de zeef na met 20 ml 5% FBS en PBS.En verzamel de gefilterde cellen door centrifugatie. Aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant zonder het pellet te verstoren. Voor dichtheidsgradiëntscheiding van de cellen suspenderen we het pellet in vier milliliter 30 procent dichtheidsgradiëntmedium en dragen we de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter.Voeg voorzichtig vier milliliter dichtheidsgradiëntmedium van 37% toe, gevolgd door vier milliliter dichtheidsgradiëntmedium van 70% onder het medium van 37%. Plaats de buis in een benchtop-centrifuge om de cellen te scheiden. De microglia- en macrofaagcellen bevinden zich op de interface tussen de lagen van 70% en 37% dichtheidsgradiënt.De buis zal gelaagd verschijnen. Na het voorzichtig verwijderen van de bovenste laag myeline, brengt u drie tot vier milliliter van de interfaselaag met microglia-macrofagen over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Was daarna de immuuncellen met drie centrifugaties in 15 milliliter PBS, waarbij het pellet na de laatste wasbeurt wordt geresuspendeerd in één milliliter PBS.Om de expressie van markers voor macrofaag-subpopulaties te beoordelen, worden de cellen overgebracht naar een analysebuis van vijf milliliter voor flowcytometrie, waarna één microliter fixeerbare dead cell stain-reagens wordt toegevoegd. Na 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht, worden de monsters gewassen in twee milliliter PBS en wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 400 microliters faxbuffer per experimentele analysebuis. Verdeel de cellen over het juiste aantal analysebuizen van vijf milliliter voor flowcytometrie.Blok vervolgens de aspecifieke FC-receptorbinding met één microgram CD 16 CD 32 blokkerende antilichaamcocktail per 100 microliters cellen gedurende een incubatie van 10 tot 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Label daarna de cellen met 100 microliters van de geschikte primaire antilichamen, gedurende een incubatie van 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Was de cellen aan het einde van de incubatie vier keer in twee milliliters PBS.Voeg vervolgens 100 µL van de geschikte secundaire antilichamen toe gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht, gevolgd door vier wasbeurten in PBS zoals zojuist gedemonstreerd. Resuspendeer na de laatste wasbeurt de pellets voorzichtig in 100 µL van één procent paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de cellen vervolgens vier keer in PBS.Resuspendeer de uiteindelijke pellets in 200 µL verse PBS en analyseer de cellen via flowcytometrie. Microglia afkomstig uit de hersenen en het ruggenmerg en monocyt-afgeleide macrofagen worden geïdentificeerd op basis van hun expressie van CD 11 B en CD 45. De expressie van CX3CR1 en Tmem119 door de CD 11 B-positieve CD 45-medium microgliacellen maakt het mogelijk om deze celpopulatie verder te onderscheiden van de CD 11 C-positieve CD 45-high monocyt-afgeleide macrofagen, die geen van deze markers tot expressie brengen, maar wel CCR2 tot expressie brengen.Na dichtheidsgradiëntscheiding is 85 tot 95 procent van de cellen nog levensvatbaar. Zonder isolatie via dichtheidsgradiënt zijn de macrofaagsubpopulaties niet identificeerbaar in een forward bi-side scatter plot, vanwege de aanwezigheid van niet-macrofaagcellen en myelineresten. Aangezien het epitope dat door het anti-Tmem119-antilichaam wordt herkend intracellulair is, is permeabilisatie vereist voor de labeling van deze belangrijke microgliacelmarker.Houd er rekening mee dat permeabilisatie celkrimping induceert, waardoor de macrofaagsubpopulaties bij analyse van de forward scatter ten opzichte van de side scatter kleiner lijken. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in vijf uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure was het essentieel om de dichtheidsgradiënt zeer zorgvuldig op te stellen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve rt-PCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de signaleringspaden van macrofaagsubpopulaties te beantwoorden. Na de ontwikkeling hiervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om de activering van macrofaagsubpopulaties in muismodellen van neurologische ziekten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video kunt u testen uitvoeren of deze methode volgen voor de analyse van macrofaagsubpopulaties via flowcytometrie.Vergeet niet dat werken met paraformaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen, zoals het gebruik van een zuurkast, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

analysis-microglia-monocyte-derived-macrophages-from-central-nervous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Kwantitatieve analyse van de inhoud van de cel binnen de nervus ischiadicus lymfkliertest is moeilijk te wijten aan de schaarste van het weefsel. Dit protocol beschrijft een methode voor de vertering van het weefsel en voorbereiding waarmee voldoende cellen voor stroom cytometry analyse van individuele muizen immuun cel populaties van zenuwen.

Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.

Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Het identificeren van microglia (MG) en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) in beschadigde ruggenmerg is moeilijk. In dit protocol werd flowcytometrie (FCM) gebruikt om respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø te identificeren. Deze technologie kan ook worden toegepast op andere ziekten van het centrale zenuwstelsel om de rol van MG en Mø te begrijpen.

Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol om de immuuncelfunctie na een ischemische beroerte te beoordelen met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van neuro-immuuninteracties mogelijk en kan worden aangepast voor het bestuderen van andere neurodegeneratieve ziekten, waardoor ons begrip van immuunresponsen bij beroertepathologie wordt vergroot.

Isolatie en flowcytometrische beoordeling van neuro-immuuninteracties in een mini-beroerte muizenmodel

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Leer de analyse van microglia en monocyt-afgeleide macrofagen uit het centrale zenuwstelsel door flow cytometry bij volwassen muizen. Deze methode identificeert subpopulaties en hun markers voor neuroimmunologisch onderzoek.

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Meer video's verkennen