Name: Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGCs) door Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer primaire murine retinale ganglioncellen isoleren met flow cytometrie voor onderzoek naar netvliesdegeneratie. Deze gestandaardiseerde methode biedt een betrouwbare aanpak voor visieonderzoek en helpt bij het begrijpen van mechanismen achter visusverlies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de heer Tim Higgins, Senior Illustrator van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Biochemie, bedanken voor technische video assistentie; Dr. Matthew W. Wilson voor discussies en de leden van de laboratoria Jablonski en Morales-Tirado voor hun nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de Alcon Research Institute Young Onderzoeker Award (VMM-T), de Universiteit van Tennessee Research Foundation (VMM-T), het National Eye Institute EY021200 (MMJ), de Gerwin Fellowship (VMM-T); De Gerwin Pre-doctoral Society (ZKG), het ministerie van Defensie Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T) en de onbeperkte subsidie ​​van onderzoek om blindheid te voorkomen.

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

FACS is de gewenste techniek om celpopulaties te zuiveren. Andere isolatiemethoden omvatten immunopanning, magnetische kralen en complement-fixatie-uitputting. Het voordeel van FACS over deze andere methodologieën is gebaseerd op de gelijktijdige identificatie van celoppervlakmarkers met verschillende intensiteitsgraden. De fluorescerende intensiteit van het molecuul is evenredig aan de hoeveelheid eiwituitdrukking. Tot nu toe was de isolatie van RGCs uitsluitend gebaseerd op Thy1 (CD90) positiviteit en CD48 negativitei...

RGC&#39;s zijn terminale gedifferentieerde neuronen, en daarom zijn primaire cellen nodig voor experimenten. De ontwikkeling van een protocol voor het isoleren en verrijken van primaire murine retinale ganglioncellen (RGC&#39;s) is essentieel om de mechanismen van RGC gezondheid en degeneratie in vitro te onthullen. Dit is vooral belangrijk voor studies die proberen potentiële therapieën te genereren om de RGC-functie te bevorderen en hun dood te minimaliseren. De degeneratie van RGC&#39;s is geassocieerd met retinale degeneratieve ziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en normale veroudering. Hoewel de specifieke cellulaire mechanismen die het RGC-verlies hebben, onduidelijk zijn, zijn er een aantal risicofactoren geïdentificeerd. Gebrek aan zuurstof bij de optische zenuwkop 1 , 2 , 3 veroorzaakt RGC-dood 4 en fungeert als de verstoring van de homeostase tussen de activatie van excitatoire en iInhibitorische receptoren binnen individuele RGC&#39;s 5 , 6 . Een reeks uitdagingen belemmert de vooruitgang naar het gebruik van deze cellen voor diepgaande studies. Ten eerste is het aantal RGC&#39;s aanwezig in een murina retina klein. RGC&#39;s vertegenwoordigen minder dan 1% van de totale retinale cellen 7 , 8 , 9 . Ten tweede zijn de meeste RGC-specifieke markers intracellulaire eiwitten 10 , 11 , 12 . Selectie op basis van deze markers laat de cellen niet levensvatbaar, wat de stroomafwaartse functionele analyses uitsluit. Tenslotte zijn de beschikbare protocollen langdurig en ontbreken standaardisatie 13 , 14 . Vroege RGC isolatieprotocollen waren gebaseerd op immunopanning methoden. Barres et al. 15 Aangepast aan de klassieke immuunAnningstechniek en voegde een tweede stap toe, die monocyten en endotheelcellen uit het grootste deel van retinale cellen uitgesloten voorafgaand aan positieve selectie op basis van immunopositiviteit tegen anti-thymocytantigeen (aka Thy1), een celoppervlakmarkering. Jaren later, Hong et al. Gecombineerde magnetische kraal isolatie technieken met cel sortering strategieën om RGC&#39;s te isoleren met hogere zuiverheid 16 . Het gebruik van magnetische kralen wordt nog steeds in veel wetenschappelijke toepassingen gebruikt. Samen verbeterden magnetische kralen en flowcytometrieprotocollen de zuiverheid van geïsoleerde cellen. Echter, deze zuiveringssystemen zijn nog niet gestandaardiseerd voor de isolatie van murine RGC&#39;s uit gedissocieerde retinae. Flowcytometrie is een krachtige analytische methode die de optische en fluorescentie eigenschappen van cel suspensies meet. Cellen worden zowel kwantitatief als kwalitatief geanalyseerd met een hoge mate van gevoeligheid, waardoor een multidimensionale analyse van de celbevolkingatie. Cellulaire discriminatie is gebaseerd op twee hoofd fysieke eigenschappen: celgrootte of oppervlakte en granulariteit of interne complexiteit 17 . Een multidimensionale analyse kan worden uitgevoerd door het combineren van antilichamen die zijn gemarkeerd met fluorochromen die soortgelijke excitatie golflengten en verschillende emissies hebben. Flowcytometrie is snel, reproduceerbaar en gevoelig. Multitpe lasers maken het mogelijk om nog meer multidimensionale analyses van enkele cellen door flowcytometrie toe te passen. Zo is het een aantrekkelijke methodologie voor de studie van cytologische monsters. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt de multidimensionale fenotypische verschillen die zijn geïdentificeerd door flowcytometrie om individuele cellen te sorteren in verschillende subpopulaties. In het laatste decennium zijn meerdere oppervlak- en intracellulaire eiwitten geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de selectie van cellen, inclusief neuronen. Aanvankelijke studies die RGC&#39;s van ratten wilden isoleren, gebruikt Thy1 als een ganglion celL marker. Helaas heeft Thy1, aka CD90, meerdere isoformen in andere knaagdier soorten 18 , 19 , 20 en wordt uitgedrukt door meerdere retinale cel typen 19 , 20 , waardoor het een niet-specifieke marker voor RGC&#39;s is. Een andere oppervlakte marker, CD48, is gevonden op monocytische populaties in het netvlies, waaronder macrofagen en microglia. Met behulp van deze twee oppervlaktemerkers werd een gewijzigde RGC-handtekening-Thy1 + en CD48 negcellen ontwikkeld 15 , 16 , 21 , 22 . Helaas zijn deze twee selectiecriteria niet voldoende om te kiezen voor een zeer verrijkte RGC-populatie. Om deze onvervulde behoefte aan te pakken, werd een flow cytometry protocol ontwikkeld 23 gebaseerd op multi-layered positieve en negatieve selectiecriteria usiNg bekende celoppervlakmarkers om primaire murine RGC&#39;s te verrijken en te zuiveren.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clone MC-480</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clone HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Clone VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Clone 30-H12</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Purified Anti-mouse CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III block, Clone 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Live cell/ Dead cell discrimination</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>U.S. origin</td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Multi-species Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Add serum to media prior to culture.</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ-PT Model</td><td>Stereo Microscope</td></tr><tr><td>Sorvall Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>All centrifugation performed&nbsp; at RT</td></tr><tr><td>Base Plate &ndash; Dissection Pan</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>A wax plate can also be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; inches</td></tr><tr><td>Iris Scissors, Straight</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; inches</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Polypropylene tubes</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Polypropylene tubes</td></tr><tr><td>BD FACS Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Polypropylene tubes</td></tr><tr><td>40 mm dishes</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Tissue culture treated</td></tr><tr><td>70 &mu;m nylon strainer</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>40 &mu;m nylon strainer</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>&nbsp;BD 10 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>Disposable Syringe without needle</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>sterile</td></tr><tr><td>Wheaton Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>No Liner</td></tr><tr><td>BD 30 G needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1 inch</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hemocytometer</td></tr><tr><td>Gibco Trypan blue 0.4% Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Fluorescence Imaging with a 20X objective</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Used to make 70% Ethanol</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Rack LTS 1000 mL &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Blue Rack Sterile Tips</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Green Rack Sterile Tips</td></tr><tr><td>Rack LTS 20 mL &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Sterile Tips</td></tr><tr><td>FACSAria II Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Custom order</td></tr><tr><td>LSR II Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Custom order</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml;ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml;ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epithelial Cells</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>House keeping gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Photoreceptors</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolar, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion Cells</td></tr><tr><td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion Cells</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm004363

isolatie van primaire murine retinale ganglioncellen (rgc&#39;s) door flow cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegeneratieve ziekten hebben vaak een verwoestende invloed op de getroffen personen. Retinal ganglion cell (RGC) verlies is betrokken bij een reeks ziektes, waaronder diabetische retinopathie en glaucoom, naast normale veroudering. Ondanks hun belang zijn RGC&#39;s tot nu toe extreem moeilijk te bestuderen, onder meer doordat ze slechts een klein percentage van de grote verscheidenheid van cellen in het netvlies bevatten. Bovendien gebruiken huidige isolatiemethoden intracellulaire markers om RGC&#39;s te identificeren, die niet-levensvatbare cellen produceren. Deze technieken omvatten ook lange isolatieprotocollen, zodat er geen praktische, gestandaardiseerde en betrouwbare methoden zijn om RGC&#39;s te verkrijgen en te isoleren. Dit werk beschrijft een efficiënte, uitgebreide en betrouwbare methode om primaire RGC&#39;s van muizenretinae te isoleren met behulp van een protocol gebaseerd op zowel positieve als negatieve selectiecriteria. De gepresenteerde methodes maken het mogelijk om de toekomstige studie van RGC&#39;s te beantwoorden, met als doel het beter te begrijpen van de hoofdvakDaling van de gezichtsscherpte die voortvloeit uit het verlies van functionele RGC&#39;s in neurodegeneratieve ziekten.

<html> De diepgaande studie van RGC&#39;s wordt belemmerd door vele factoren, waaronder hun lage frequentie en het ontbreken van een robuuste en gestandaardiseerde methodologie voor hun isolatie. Figuur 1 toont de methodologie die wordt gebruikt voor retinae isolatie. Variaties in de enucleatieprocedure bestaan ​​op basis van het soort analyse, zoals als de enucleatie onderdeel uitmaakt van in vivo experimenten 27 . Enucleatie...

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC&#39;s). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC&#39;s door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van een verrijkte, homogene populatie primaire retinale ganglioncellen van muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het vakgebied van de retinale ganglioncel over de mechanismen die ten grond liggen aan de afnemende gezichtsscherpte bij oudere populaties en bij populaties met degeneratieve netvliesziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snel, zichtbaar, reproduceerbaar en gestandaardiseerd protocol biedt voor de isolatie van verrijkte primaire retinale ganglioncellen van muizen.Het idee voor deze methode ontstond toen Sumana Chintalapudi, destijds promovendus in mijn laboratorium en eerste auteur van deze studie, tijdens onze journal club een artikel uit 2013 van Krishna Murtheadol presenteerde; hun studie toonde duidelijk aan dat de RGC5-cellijn, die oorspronkelijk was ontwikkeld als een geïmmortaliseerde ratretinale ganglioncellijn, niet langer van rat-oorsprong was en het RGC-fenotype niet meer bezat. Het werd ons duidelijk dat dit probleem een aanzienlijk gat sloeg in de beschikbare middelen voor de visieonderzoeksgemeenschap, inclusief ons eigen laboratorium. Sumana en ik namen contact op met Dr. Morales-Tirado en samen hebben wij met drieën een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van levende en sterk verrijkte RGC's.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de doelstellingen van deze methode zijn om een levende en sterk verrijkte celpopulatie te isoleren die ofwel als primaire cellen gekweekt kan worden, ofwel geïmmortaliseerd kan worden tot een cellijn. Om deze reden moet men zeer voorzichtig zijn om de cellen die men probeert te isoleren niet te beschadigen. Daarnaast moeten de parameters van de cel sorteermethode worden afgestemd op de specifieke cellen die men probeert te isoleren.Beide methoden vereisen specifieke vaardigheden. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Dr. Xiang Di Wang, onderzoeksmedewerker uit het laboratorium van Dr. Jablonski, en Mr. Zach Goldsmith, PhD-kandidaat uit mijn laboratorium. Om het oog te enucleeren, plaatst u eerst een pincet onder de oogbol.Pak de oogzenuw vast en trek deze omhoog. De oogbol wordt geënucleerd met de oogzenuw intact. Plaats het oog in een vial met PBS op ijs en enucleer het andere oog.Wanneer alle ogen zijn verzameld, plaatst u één oog in een Petrischaal met verse PBS onder een dissectiemicroscoop en gebruikt u een pincet om de oogbol voorzichtig bij de basis van de oogzenuw vast te pakken. Door met een scherpe naald van 30 gauge de cornea te doorprikken, kan het kamervocht weglopen, waardoor het gemakkelijker wordt om het oog met het pincet vast te houden. Terwijl u de cornea met het pincet vasthoudt, maakt u met een schaar een kleine incisie in het corneale weefsel en gebruikt u het pincet om de cornea en de sclera voorzichtig weg te pellen.Wanneer de oogbol halverwege is afgepeld, gebruik dan de pincet om het netvlies en de lens uit te rollen. Plaats het netvlies in een kleine Petri-schaal van 40 millimeter met PBS en 1% FPS in een veiligheidskast en was het netvlies drie keer in verse PBS plus FBS, waarbij voor elke wasbeurt nieuw medium wordt gebruikt. Wanneer alle ogen gewassen zijn, worden maximaal 12 netvliezen op een steriele nylon zeef van 70 micron geplaatst die bevochtigd is met PBS en FBS, waarna de netvliezen voorzichtig worden gemacererd met het uiteinde van een zuiger van een spuit van 10 milliliter met een cirkelvormige beweging.Zodra alle cellen zijn gedissocieerd, wordt het zeefje over een polypropyleen opvangbuisje geplaatst en wordt een P1000-pipet gebruikt om de cellen door het zeefje in het opvangbuisje te filteren. Spoel het zeefje met PBS en FBS en verzamel het spoelmiddel in het opvangbuisje. Voeg voldoende PBS plus FBS toe om het eindvolume aan te vullen tot één milliliter oplossing per retina en verzamel de cellen door middel van centrifugatie.Resuspendeer vervolgens de pellet in PBS plus FBS met een concentratie van één milliliter medium per vijf retinae, indien de immunolabeling onmiddellijk wordt uitgevoerd. Alternatief kunnen de cellen, geresuspendeerd in neuraal celmedium, overnacht bij vier graden Celsius in horizontale positie worden geïncubeerd. Om de retinalcellen te immunolabelen, centrifugeert u de suspensie van retinalcellen en resuspendeert u de pellet in 50 microliters vers PBS plus FBS in een faxbuis.Zet vijf keer 10⁶ cellen apart voor de ongelabelde negatieve controle. Blok vervolgens in elke buis elke aspecifieke Fc-receptorbinding met één µL anti-muis CD 16/32-antilichaam per 10⁶ cellen, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de blokkeringsincubatie de gewenste antilichaamcocktail toe aan de cellen door voorzichtig te pipetteren, gevolgd door een incubatie van 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.Was de cellen vervolgens twee keer in een eindvolume van PBS en FBS. Label de cellen gedurende nog eens 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht, met een geschikt secundair antilichaam, gevolgd door twee wasbeurten in PBS plus FBS zoals zojuist gedemonstreerd. Resuspendeer de pellets in vers PBS en FBS voor het tellen van de cellen.Om de compensatie aan te passen, voegt u drie druppels polystyreen microsferen toe aan één steriele fax-buis per florafor en één microgram van de betreffende florafor aan elke buis. Incubeer de microsferen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de microsferen vervolgens in drie milliliter PBS en FBS en verwijder voorzichtig het supernatant.Resuspendeer de microsfeerpellets in 250 µL PBS en FBS en plaats de ongelabelde monsterbuis in de flowcytometer. Selecteer in de software van de flowcytometer 'experiment', 'compensation set up' en maak compensatiecontroles aan. Voeg de florafor-specifieke controles toe uit de getoonde lijst en klik op OK. Verifieer het forward scatter- en side scatter-licht en gate de initiële populatie.Plaats vervolgens de buis met de negatieve controle in de cytometer en klik op 'load'. Controleer of de populatie van belang of P1 wordt weergegeven en selecteer deze populatie. Klik met de rechtermuisknop op de P1-gate en selecteer 'calculate compensation'.Klik vervolgens op gegevens registreren. Wanneer de registratie is voltooid, klikt u op lossen om de buis te verwijderen en plaatst u de volgende controlebuis om de compensatiecontroles aan te passen. Wanneer alle controlemonsters zijn geregistreerd, maakt u een forward versus side scatter-plot voor de eerste experimentele buis en gate u de P1-populatie.Open vervolgens een pseudokleurplot van side scatter height versus side scatter width en gate de enkelvoudige cellen. Gebruik deze enkelvoudige cellen om een plot van forward scatter height versus forward scatter width te maken en gate deze om dubletten uit te sluiten. Genereer daarna een pseudokleurplot van CD48 versus CD90.2 en gate de CD90.2-positieve CD48-negatieve cellen om de monocyten te elimineren, gevolgd door een pseudokleurplot van CD57 versus CD15 om eventuele contaminanten van amacrine cellen te elimineren.Definieer nu de populaties die voor het monster moeten worden verzameld in het sorteerlay-outblad en sorteer de cellen. Gebruik aan het einde van de sortering een celaliquot van 2,5 x 10⁴ om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulatie te bevestigen. Na het homogeniseren van de retinae in de celzeef kunnen meerdere binnenste retinale cellen worden gevisualiseerd, hoewel de retinale ganglioncellen hun kenmerkende morfologie hebben verloren als gevolg van axotomie tijdens de celisolatieprocedure.Het klassieke oppervlaktefenotype dye one positief CD48 negatief is onvoldoende voor het identificeren en isoleren van muize retinale ganglioncellen, aangezien deze cellen genen tot expressie brengen die geassocieerd zijn met amacrinecellen, mullercellen, bipolaire cellen, horizontale fotoreceptoren en retinal pigment epitheelcellen. De gesorteerde cellen brengen tevens intracellulaire markers tot expressie die geassocieerd zijn met retinale ganglioncellen, zoals synucleïne gamma, BRN3A, TUJ1 en RBPMS, waarbij de intracellulaire lokalisatie van de markers verder is bevestigd door imaging flowcytometrie. Sommige van de gesorteerde cellen beginnen zelfs retinale ganglioncelmorfologie te vertonen na in vitro celkweek.Verder onthult kwantitatieve PCR-analyse van de sterk verrijkte gesorteerde celpopulatie een veelvoudige toename in de genen die coderen voor retina-ganglion-specifieke intracellulaire markers. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan zes uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de celsuspensie steriel moet blijven, de FC-receptoren in de celsuspensie geblokkeerd moeten worden om aspecifieke binding van de antilichamen te voorkomen, en dat de details of de strategie van de cel sortering met de operator van de cell sorter moeten worden besproken.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals QPCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over genexpressieprofielen te beantwoorden. Vergeet niet dat het werken met gespecialiseerde apparatuur, zoals een cel-sorteerder, een hooggespecialiseerde operator vereist. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de visus om te helpen bij het begrijpen van overlevings- en sterfmechanismen in retinale ganglioncellen, voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutica voor het behoud van het gezichtsvermogen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een verrijkte homogene populatie van primaire murine retinale ganglioncellen isoleert.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

This video demonstrates the procedure for isolating murine primary retinal ganglion cells (RGCs) by using flow cytometry. This method allows for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolating Murine Retinal Ganglion Cells Using Fluorescence-Activated Cell Sorting

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.

Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het isoleren van retinale gliacellen Müller uit muizenogen. Het protocol begint met enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door isolatie, zaaien en kweken van Müller-cellen.

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.

Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire retinale Müller-cellen van neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten. De procedure omvat enucleatie van de oogbollen, dissectie van netvliesweefsel, extractie en identificatie van cellen en belangrijke overwegingen voor latere celkweek.

Isolatie en kweek van primaire retinale Müller-cellen van Sprague-Dawley (SD) ratten

Leer primaire murine retinale ganglioncellen isoleren met flow cytometrie voor onderzoek naar netvliesdegeneratie. Deze gestandaardiseerde methode biedt een betrouwbare aanpak voor visieonderzoek en helpt bij het begrijpen van mechanismen achter visusverlies.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC's) door Flow Cytometry

Meer video's verkennen