Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode
12 juli 2017
Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.
Het algemene doel van deze computerondersteunde methode is om de vertakkingsdichtheid en het vertakkingsverval van de melklier objectief te kwantificeren, twee belangrijke ontwikkelingsindicatoren bij knaagdieren, door een aangepaste Sholl-analyse toe te passen op whole-mount beelden van de melklier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het veld van de melklierbiologie, zoals de vraag hoe blootstelling aan chemicaliën de ontwikkeling van de melklier kan beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van opensourcesoftware om fundamentele kenmerken van de melklierontwikkeling objectief te kwantificeren.
Zorg voor deze procedure over beelden van whole-mounts waarop het klierepitheel bij een vaste vergroting te zien is. Open eerst een afbeelding in ImageJ. Selecteer vervolgens de freehand tool.
Trek een omtrek rond het klierepitheel en maak het omliggende gebied vrij. Trek vervolgens een omtrek rond de lymfeknoop en verwijder dit deel van de afbeelding met het knipcommando. Als de achtergrond van de afbeelding zwart is, moet deze worden omgezet naar wit.
Klik op Bewerken, vervolgens op Opties en dan op Kleuren. Selecteer in het dialoogvenster wit uit het vervolgkeuzemenu van de achtergrondopties. Hoewel de achtergrond mogelijk zwart blijft, zal deze als wit worden behandeld bij het verwerken van de afbeelding.
Scheid nu de kleurkanalen in drie grijswaardenbeelden van acht bit. Selecteer vervolgens het kanaal met het beste contrast, wat doorgaans het blauwe kanaal is. Trek nu de achtergrond af van het geselecteerde kleurkanaal.
Kies vervolgens de gewenste parameters en bekijk een voorvertoning van de wijzigingen. Vink 'light background' en 'preview' aan in het dialoogvenster en pas vervolgens het aantal pixels aan tot het gewenste contrast is bereikt. Als er extra contrast nodig is, gebruik dan de optie 'Unsharp Mask'.
Controleer het voorbeeld in het dialoogvenster en pas de pixelstraal en het masker-gewicht aan tot het gewenste contrast is bereikt. Verwijder na het toepassen van het onsharp mask-filter de rand die door het filter is ontstaan. Klik op de knop met de dubbele rode pijl in de werkbalk en selecteer Tekengereedschappen.
Kies vervolgens de Gum-tool. Pas de diameter aan door met de rechtermuisknop op de knop van de Gum-tool te klikken en houd daarna de linkermuisknop ingedrukt om de rand te wissen. Tijdens het wissen is slechts één niveau van Ongedaan maken mogelijk, wees dus voorzichtig.
Verwijder na het toepassen van een van de filters de resterende ruis handmatig. Raadpleeg een kopie van het originele beeld en verwijder de geïdentificeerde ruis door eerst op de knop met de dubbele rode pijl in de werkbalk te klikken en de tekentools te selecteren. Kies vervolgens het gum-instrument.
Pas de diameter aan door met de rechtermuisknop op de knop van het gumhulpmiddel te klikken. Houd vervolgens de linkermuisknop ingedrukt om ruis te wissen. Tijdens het wissen is slechts één stap ongedaan maken mogelijk, dus wees voorzichtig.
Pas vervolgens de drempelwaarde van de afbeelding aan. Verschuif de schuifregelaars om de minimale en maximale drempelwaarden aan te passen om het beeld van de klier te verbeteren. Klik daarna op Toepassen.
Verwijder automatisch extra ruis met een van de twee methoden. De eerste optie is om het despeckle-commando te gebruiken. De tweede optie is om het remove outliers-commando te gebruiken.
Bij dit proces wordt een pixel alleen vervangen door de mediaan van de directe omgeving als de pixel meer afwijkt van de mediaan dan een door de gebruiker gedefinieerde drempelwaarde. Gebruik nu de oorspronkelijke afbeelding voor vergelijking om delen van het klierepitheel te reconstrueren die door drempelwaarde-instelling en ruisonderdrukking waren verwijderd. Let er bij het reconstrueren van de afbeelding op dit zorgvuldig en minimaal te doen om de integriteit van de afbeelding te behouden.
Selecteer het spuitbus-instrument uit de tekengereedschappen. Klik met de rechtermuisknop op de knop van het spuitbus-instrument om de grootte van het instrument aan te passen en vul vervolgens zorgvuldig de ontbrekende secties van de klier in met de linkermuisknop. Maak vervolgens een geskeletiseerd beeld van de klier voor de Sholl-analyse.
Zet de afbeelding eerst om in een binair formaat. Skeletoniseer vervolgens de afbeelding. Hierbij worden herhaaldelijk pixels van de randen van de binaire afbeelding verwijderd totdat deze is gereduceerd tot een vorm met een breedte van één pixel.
Dilateer nu de afbeelding één keer om de gaten te dichten die zijn ontstaan door het thresholden en skeletoniseren. Sla de afbeelding vervolgens op als een nieuw bestand met behulp van het commando 'opslaan als'. Controleer tot slot de nauwkeurigheid van de skeleton-afbeelding ten opzichte van het origineel door de twee afbeeldingen over elkaar heen te leggen.
Selecteer in het dialoogvenster voor het toevoegen van afbeeldingen de skeletafbeelding en stel de opaciteit in op 30%. Sla de overlay vervolgens op als een nieuwe afbeelding voor toekomstig gebruik. Open eerst een skeletafbeelding en converteer de afbeelding naar een binair formaat. Definieer nu de schaal van de afbeelding.
Voer het aantal pixels per millimeter in, stel vervolgens zowel de bekende afstand als de pixel-beeldverhouding in op één, voer millimeters in als lengte-eenheid en activeer de globale optie om de schaal op alle afbeeldingen toe te passen. Bepaal vervolgens de eindstraal voor de Sholl-analyse met behulp van het lijntekeninstrument. Trek een lijn vanaf het begin van het primaire kanaal tot het meest distale punt van het klier-epitheel.
Druk vervolgens op de M-toets en de afstand van de lijn wordt weergegeven. Voer nu de instellingen voor de Sholl-analyse in. Selecteer eerst de opties in de sectie 'definition of shells', stel de beginstraal in op 0.00 millimeters en stel de stapgrootte van de straal in op 0.1 millimeters.
Stel het aantal monsters in op één. De lengte van de zojuist getekende lijn wordt automatisch ingevuld in het veld voor de eindstraal. Kies bij de opties voor meerdere monsters per straal voor het gemiddelde voor de integratie.
Stel voor de descriptoren en de opties voor curve-fitting de afkapwaarde van de omsluitende straal (enclosing radius cutoff) in op één. Kies 'infer from starting radius' voor het aantal primaire takken en selecteer de opties 'linear' en 'best fitting degree'. Selecteer vervolgens onder 'profiles without normalization' de optie 'most informative'.
Kies nu, onder de sectie met Sholl-methoden, 'area for normalized profile'. Selecteer ten slotte, in de sectie voor de output, 'create intersections mask' om een heatmap van de intersecties te maken. Open nu een previewvenster van de afbeelding met ringen en bevestig het analysegebied.
Als alles correct lijkt, klik dan op oké om de analyse uit te voeren. Het uitvoeren van de analyse creëert een lineair venster voor het Sholl-profiel, een semi-logaritmisch venster voor het Sholl-profiel, een venster met de Sholl-resultaten, waarin alle Sholl-uitvoerwaarden staan, en een venster met de bestandsnaam van de Sholl-profielen, waarin het aantal intersecties bij elke straal staat vermeld zoals bepaald door het polynoom. Om de MEA te meten, werkt u vanuit het skeletbeeld van de klier in ImageJ.
Open het polygoon-instrument en teken een polygoon rond de omtrek van de klier. Gebruik muisklikken om lijnsegmenten toe te voegen. Wanneer het gehele epitheliale gebied is omvat, dubbelklikt u om de polygoon te sluiten.
Druk vervolgens op de M-toets om een resultatenvenster te openen. De waarde in de kolom 'area' komt overeen met de MEA. Als het klierepitheel zich buiten de lymfeknoop uitstrekt, trek dan de oppervlakte van de lymfeknoop af van de MEA bij het berekenen van de vertakkingsdichtheid.
Het gebied van de lymfeklieren kan op dezelfde manier worden gemeten als het MEA. Met behulp van de beschreven methoden werden twee leeftijdsbeperkte groepen ratten geanalyseerd. De dieren in groep B werden behandeld met een stof die bekend staat om het veroorzaken van vroegtijdige ontwikkeling van de melkklieren.
Het plotten van het aantal vertakkingsintersecties langs de straal vanaf de klier illustreert de variatie in de resultaten. De resultaten van de Sholl-analyse onthulden een duidelijk verschil in het gemiddelde aantal intersecties tussen de groepen. De intersectiegegevens moeten echter worden genormaliseerd naar het oppervlak van de melkklier om conclusies te kunnen trekken.
De Sholl-analyse en de metingen van het epitheeloppervlak van de melkklieren leveren twee fysiologische parameters op die nuttig zijn voor het maken van een vergelijkende analyse. Duidelijk was dat de grootte van de klieren veel groter was in de behandelingsgroep. De Sholl-analyse geeft de waarde voor Sum N terug, die wordt gebruikt voor het berekenen van de vertakkingsdichtheid en de waarde voor k.
In de behandelgroep wijzen de hogere gemiddelde vertakkingsdichtheid en de lagere gemiddelde k-waarde, die een lagere snelheid van vertakkingsafname weerspiegelt, erop dat de behandelde dieren beter ontwikkelde klieren hadden dan de onbehandelde dieren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het verwijderen van ruis de meest cruciale stap is. Te veel of te weinig verwijdering kan de integriteit van de klier verstoren en de resultaten beïnvloeden.
Bij het gebruik van deze methode is het belangrijk om te beginnen met een ongeschonden volledige kliermound van de melkklier. Er kan geen nauwkeurig geskeletiseerd beeld worden verkregen als er onvolkomenheden zijn, zoals scheuren of plooien. Het maken van een nauwkeurig geskeletiseerd beeld vereist geduld en oefening.
Zodra men deze techniek beheerst, kan deze, mits correct uitgevoerd, in 15 tot 20 minuten per geanalyseerde klier worden voltooid.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een computerondersteunde methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingsdichtheid en -afname van de melkklier bij knaagdieren. Door gebruik te maken van een aangepaste Sholl-analyse op whole-mount beelden kunnen onderzoekers de ontwikkeling van de melkklier objectief evalueren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biologie van de melkklier
- Ontwikkelingsbiologie
- Kwantitatieve analyse
Achtergrond
- De ontwikkeling van de melkklier is cruciaal voor het begrijpen van diverse biologische processen.
- Traditionele beoordelingsmethoden zijn vaak subjectief en onnauwkeurig.
- Vertakkingsdichtheid is een belangrijke indicator voor de ontwikkeling van de melkklier.
- Objectieve kwantificering kan de onderzoeksresultaten verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het kwantificeren van de vertakkingskenmerken van de melkklier.
- Om de impact van chemische blootstelling op de ontwikkeling van de melkklier te beoordelen.
- Om de nauwkeurigheid van beoordelingen van de melkklier in onderzoek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van ImageJ-software voor beeldanalyse.
- Toepassing van een aangepaste Sholl-analyse op whole-mount beelden.
- Selectie van het klierepitheel bij een vaste vergroting.
- Objectieve kwantificering van vertakkingsdichtheid en verval.
Belangrijkste resultaten
- Vestiging van een gestandaardiseerde methode voor de analyse van de melkklieren.
- Demonstratie van de betrouwbaarheid en objectiviteit van de methode.
- Potentiële inzichten in de effecten van omgevingsfactoren op de ontwikkeling van de melkklieren.
- Facilitering van verder onderzoek naar de biologie van de melkklieren.
Conclusies
- De methode biedt een robuust kader voor het bestuderen van de ontwikkeling van de melkklier.
- Open source-software verbetert de toegankelijkheid voor onderzoekers.
- Objectieve kwantificering kan leiden tot nauwkeurigere wetenschappelijke conclusies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van de vertakkingsdichtheid van de melkklier biedt een objectieve, gestandaardiseerde maatstaf voor het beoordelen van ontwikkelingstoxiciteit in preklinische veiligheidsstudies. Deze methode ondersteunt mechanistische risicoreductie door een reproduceerbare, kwantitatieve evaluatie mogelijk te maken van de effecten van chemicaliën op de klierarchitectuur. Het vergroot het voorspellend vertrouwen in doelvalidatiepaden die gerelateerd zijn aan hormonale en ontwikkelingssignalering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar therapeutische hypothesen met betrekking tot ontwikkelingspaden van de melkklier.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van targets in knaagdiermodellen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door de vertakkingsdichtheid te kwantificeren als biomarker voor ontwikkelingsstoornissen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows voor compound screening.
- Reproduceerbaarheid: Pakt assay-standaardisatie aan via objectieve, softwaregebaseerde kwantificering.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het potentieel voor hergebruik van het platform via open-source ImageJ-implementatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie via ziekterelevante morfometrische analyse.
- Mechanistische Risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door structurele veranderingen te koppelen aan functionele uitkomsten.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Ondersteunt voortgangscriteria op basis van kwantitatieve metrieken voor vertakkingsverval en dichtheid.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen via lead-identificatie tot de preklinische veiligheidsbeoordeling, waarbij in elke fase kwantitatieve morfometrische gegevens worden geleverd.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en biologische risicoreductie via objectieve kwantificering van de klierarchitectuur.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten uit beeldanalyse.
- Analytics: Genereert kwantitatieve read-outs (Sum N, k, MEA) die vergelijking tussen condities en statistische evaluatie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt preklinische continuïteit via ziekterelateerde systeemmodellering in melkklieren van knaagdieren.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Positioneert de methode als een herbruikbare capaciteit binnen toxicologie- en screeningprogramma's voor endocriene disruptie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van ontwikkelingstoxiciteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen laboratoria door gebruik van open-source tools.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een late stadium bij veiligheidsprofielonderzoek.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantificeerbare vertakkingsfenotypes.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in histologische whole-mount preparatie en beeldanalyse.
- Afhankelijk van ImageJ-software en compatibele plug-ins voor het uitvoeren van Sholl-analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van protocollen voor beeldacquisitie, drempelwaarde-bepaling en skeletonisatie.
- Omvat overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, met name met betrekking tot glandulaire morfologie en kleuringsconsistentie.
- Praktische beperkingen omvatten gevoeligheid voor beeldkwaliteit, ruis en artefacten die de integriteit van de skeletonisatie kunnen compromitteren.
