Name: Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer geautomatiseerde kristallisatieprotocollen voor structurele biologie met nanoliter druppels en vapor-diffusie. Deze methode produceert tot 1.920 hoogwaardige kristallen voor macromoleculaire studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De faciliteit van de kristallisatie MRC-LMB is vriendelijk, ondersteund door de medische Raad voor onderzoek (UK). Wij danken de leden van de LMB voor hun steun: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent en Pat Edwards (structurele Studies), Steve Scotcher en de andere leden van de mechanische Workshop, Neil Grant en Jo Westmoreland (visuele hulpmiddelen), Paul Hart en Tom Pratt (IT). Ook wil wij bedanken Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart en Heather Ringrose (Hamilton Robotica, UK), Paul Thaw, Robert Lewis en Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Zwitserland), George Stephens en Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) en Graham Harris (The Cleveland Agency) voor technische hulp.

1. de twee geautomatiseerde volledig systemen (eerste screening)
<ol><li>
Systeem 1: voorbereiding van 72 kristallisatie van de 96-wells-platen gevuld met screening kits (LMB platen)
	<ol>
<li>Voordat u de procedure uitvoert, ervoor zorgen dat het systeem robots worden geïnitialiseerd en hun controlerende software open is. Zet de chiller van de buis-koeling vervoerder ongeveer 30 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.</li>
		<li>Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en controleer dat de film correct wordt toegepast. Herhaal deze test twee keer meer om te controleren dat de plaat sealer klaar is.</li>
		<li>Dan, Voeg 20 L gedeïoniseerd water aan de belangrijkste container van de vloeibare handler. Koppelt de koppeling invoegt vanuit de kleine container (20% ethanol oplossing spoelen) en sluit de inzetstukken op de belangrijkste container.</li>
		<li>Voer de juiste schermnaam (tabel 1) op de inkjet printer touchscreen. Vervolgens opent en sluit de deur van de carrousel om te activeren van de rotatie van de carrousel. De deur open wanneer de eerste stack zichzelf presenteert.</li>
		<li>Volledig laden de eerste stack met 22 kristallisatie platen, elk met kolom 1 naar beneden uit. De volgende twee stapels op dezelfde manier volledig te laden.</li>
		<li>De resterende 6 platen in de hoogste posities van de vierde stack worden geladen. Vervolgens sluit u de deur van de carrousel.</li>
		<li>Verifiëren dat de chiller display 14 ° C. verschijnt Zachtjes en herhaaldelijk omkeren de geselecteerde screening kits voor 1 minuut. Open vervolgens het voorpaneel van de vloeibare handler.</li>
		<li>Open de tubes en plaats ze in de koeling vervoerder volgens de standaard indeling van de 96-Wells (A1, A2, enz.). Bij het plaatsen van elke buis in de vervoerder, plaats de deksel op een dienblad in dezelfde 96-Wells-indeling.</li>
		<li>Toetsing de buis posities en ervoor zorgen dat alle buizen niveau zijn en vestigde zich in de drager. Vervolgens sluit het voorpaneel.</li>
		<li>In het venster 'Opstarten' van de vloeibare handler-software, selecteert u 'Run onderhoud' en open de afboekingsmethode programma. Voer het programma om de 20%-ethanol uit het systeem spoelen en te wassen van de buitenkant van de vloeistof-verstrekking tips.</li>
		<li>Wanneer spoelen voltooid is, klikt u op 'Annuleren' om terug te keren naar 'Opstarten'. Selecteer 'Uitvoeren een bestaand proces' en klik op 'Start uw selectie'. Open het programma 'MRC kit dispensing'. Invullen '18' voor 'Exemplaren' in de configuratie scherm en het programma start.</li>
		<li>Monitor het systeem als de eerste vier platen worden aangeduid, gevuld en verzegeld.</li>
		<li>Zodra alle 72 platen zijn opgesteld en de koppeling invoegt vanuit de belangrijkste container geplaatst terug in de carrousel, naar de kleine container overschakelen. Voer het programma 'Start omhoog vloed' (zie stap 1.1.10).</li>
		<li>Uitschakelen van de chiller en gooi de lege screening kit buizen. Verwijder voorzichtig de 72 bereid platen van de carousel. Gooi ten onrechte gevulde of slecht-verzegeld platen. Opslaan van de kant-en-klare platen bij 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Systeem 2: instellen van kristallisatie druppels (100 nL eiwit + 100 nL voorwaarde) vanuit één sample in 20 LMB platen
	<ol>
<li>Controleer eerst dat het systeem robots zijn op de nanoliter dispenser met haar open software is geïnitialiseerd en de vloeibare handler methode manager geopend is. Zet de vervoerder microtube-koeling ongeveer 15 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.</li>
		<li>Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en verifiëren dat de plaat goed wordt verzegeld. Test de plaat sealer driemaal.</li>
		<li>Voer vervolgens de nanoliter dispenser om in te stellen 100-nL druppels van meetoplossing ligt in een test-plaat. Kijk onder een Microscoop dat de druppels goed zijn ingesteld. Sluit de nanoliter dispenser software en verwijder het strip-houder blok van het dek.</li>
		<li>Steek vervolgens in de houder plaat maat ontworpen (Zie Vertegenwoordiger resultaten: kristallisatie apparaten ontwikkeld op de LMB) de LMB plaat met de hoogste relatieve hoeveelheid vluchtige reagentia in de voorwaarden (tabel 1). Verwijder de zelfklevende folie van de plaat.</li>
		<li>Open het voorpaneel vloeibare handler en plaats van de onverharde plaat op het dek, aan de achterkant van de eerste drager van de glijdende (Sliding vervoerders kan worden teruggetrokken voor gemakkelijke toegang).</li>
		<li>De afdekplaat met een SBS aluminium deksel. Genoegen nemen met het deksel naar de achterste linker hoek van de vervoerder door zachte druk toe te passen naar de tegenoverliggende hoek van het deksel.</li>
		<li>Verzegelde, in de glijdende vervoerders laden en dekking van de overige 19 platen op dezelfde manier, werken van meest naar minst vluchtige voorwaarden. Zodra de vervoerder microtube-koeling bij 4 ° C, is zoals aangegeven door een groen licht, verwijder de cover.</li>
		<li>Afgesneden het deksel van een microtube met (ten minste) 440 µL van eiwitSteekproef (tabel 2). Zorg ervoor dat het monster geen schuim boven de meniscus, als dit met het vloeibare detectiesysteem interfereren zal. Plaats de buis in positie 1 van de vervoerder microtube-koeling.</li>
		<li>Plaats een PCR-plaat op het dek met vloeibare handler voor de adapter plaat voortbewegende vervoerder. Vervolgens sluit het voorpaneel.</li>
		<li>Na het laden van het dek, ervoor zorgen dat het nanoliter dispenser dek duidelijk van het blok van de strip-houder is en dat de dragers aan de achterkant van de 50-µL tip stapels duidelijk van de aluminium SBS deksels zijn.</li>
		<li>Selecteer in de vloeibare handler ' methode ' beheerinterface, 'Setup platen'. De initialisatie van beide systemen controleren en invullen van de parameters uitvoeren. Volg de richtlijnen van de methode beheerinterface (aanwijzingen, cijfers en een tip-management systeem helpen met voorbereiding).</li>
		<li>Controleer of alle vereiste componenten zijn klaar en start het proces.</li>
		<li>Monitor het systeem zeehonden als de dispenser nanoliter de druppels in de eerste plaat en de plaat sealer vervolgens ondergaat de plaat.</li>
		<li>Zodra alle 20 platen zijn bereid met kristallisatie druppels en automatisch terug naar de glijdende dragers, open het voorpaneel en de platen voorzichtig te verwijderen. Controleren dat de platen goed alvorens ze op te slaan voor de kristallisatie zijn verzegeld.</li>
		<li>Reinig de SBS deksels met een oplossing van 20% ethanol voordat stapelen ze op de linker kant van de vloeibare handler voor opslag. De PCR-plaat en de microtube negeren.</li>
		<li>Uitschakelen van de vervoerder microtube-koeling en veeg weg de condensatie. Laat een papieren handdoek op de top van het koeler te absorberen verder condensatie oppervlak. Dan, breng het klepje van de vervoerder en sluit het voorpaneel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimalisering van de voorwaarden
<ol><li>
Spuit-gebaseerde vloeibare handler: produceren van twee lineaire verlopen van concentraties in de reservoirs van een kristallisatie plaat (de 4-hoek-methode).
	<ol>
<li>Controleer eerst dat de vloeibare handler brandt en geïnitialiseerd met haar open software.</li>
		<li>Op het 'verloop' tab: Open het vereiste programma, selecteert u het type van de plaat kristallisatie en het eindvolume in de reservoirs (tabel 3). De geavanceerde instelling voor 'max shot vol' van 6.000 tot 3000 moet worden verlaagd wanneer met behulp van oplossingen met [isopropanol en] > 10% v/v en [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Voorbereiding van het spuiten. Plaats een zuiger in elke spuit (spits uiteinde naar beneden) en de achterkant van de spuiten invoegen de aangewezen groeven onder het hoofd van de robot. Draai een spuit met de klok mee om het te vergrendelen in positie (alleen met alle vereiste spuiten goed aangesloten zal het programma starten).</li>
		<li>Bereiden de troggen. Verwijder het roestvrijstalen frame en plaats van de troggen. De 4 standpunten aan de linkerkant komen overeen met de 4 hoeken A, B, C, D. gaat u naar 'Instellen' tabblad waarin de volumes van oplossingen nodig in elke spuit (op tabel 3, 0,5 mL dood volume werd toegevoegd aan de volumes weergegeven). Giet de hoekoplossingen in hun respectieve troggen en plaats het frame terug op het dek (het frame heeft in positie met 2 kleine magneten, gelegen aan de voorzijde van het dek). Een alternatieve manier om door te gaan met deze stap is om te gieten de oplossingen in de troggen wanneer zij al op het dek geplaatst zijn.
</li>
		<li>Plaats de kristallisatie plaat op de gemotoriseerde SBS vervoerder.</li>
		<li>Klik op 'Gecombineerd' en wacht tot deze stap voltooid moet zijn (wanneer zuigers op hun weg omhoog gestopt).</li>
		<li>Ga naar het tabblad 'Uitvoeren' en start programma.</li>
		<li>Na voltooiing van het programma, ga terug naar het tabblad instellen en klik op 'Verwijderen': het systeem zuiveringen van het spuiten van overgebleven oplossingen, en dan het liften van de zuigers helemaal naar boven. 'Leegmaken' in plaats van 'Verwijderen' kunnen worden verzocht; dit de zuigers laat in de onderste positie, klaar om meer oplossingen met de dezelfde spuiten gecombineerd.
</li>
		<li>Verwijder de spuiten door deze linksom te draaien.</li>
		<li>Spuiten en troggen in de juiste bak negeren (of spoel ze af met gedeïoniseerd water en vervolgens 20% v/v ethanol oplossing voor hergebruik).</li>
		<li>Afdichting van de plaat en plaats deze op de microplate-mixer voor 3 min op 1000 toeren per minuut, of 10 min wanneer zijn zeer viskeuze oplossingen worden vermengd. De plaat is klaar voor het opzetten van kristallisatie druppels op de nanoliter dispenser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additief screening van protocol 1 (het opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat vooraf gevuld met additieve scherm)
	<ol>
<li>Ten eerste bereiden de voorwaarde met een initiële concentratie van reagentia verhoogd met 10% (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de vloeibare handler bereid is te werken. Open het programma 'Scherm toevoegen aan additieven' voor een enkele plaat (voer volume in reservoirs: '72 µL'). Wordt gevraagd, cijfers en een tip-beheer systeem (12 x 1.000 µL tips nodig) hulp met ervoor te zorgen dat de robot is klaar om te werken volgens de selecties.
</li>
		<li>Ophalen van de additieve scherm uit de incubator van-20 ° C en verwijderen zijn aluminium zegel onmiddellijk (gebruik de plaat houder), dan plaatst de plaat op het dek van de vloeibare handler. Het programma werkt volgens een portret lay-out (de plaat is geplaatst met de A1-hoek gelegen in de voorkant-links van de drager). Ook plaatsen ook de container gevuld met de voorwaarde. Voer het programma.</li>
		<li>Zodra de reservoirs van de plaat zijn ingevuld, plaats het op het schudapparaat microplate en start het programma. Spoel de container van de conditie met gedeïoniseerd water en 20% ethanol voor hergebruik.</li>
		<li>
Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser. Eerst, unseal de kristallisatie plaat (gebruik de houder plaat). Dan, plaats de plaat en de proteïne 8-well strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder. De 'Setup'-tab op de controlerende software toont de werkelijke positie van elk onderdeel op het dek. Laden elk goed van de strip met eiwitSteekproef volgens de grootte van de druppel nodig (tabel 4). Uitvoeren van het programma voor te bereiden van druppels.
</li>
		<li>Na voltooiing van het programma, verwijderen de plaat uit het dek en verzegel het onmiddellijk (gebruik de plaat sealer, 3-inch breed plakband). Gooi de strip in de juiste bak.</li>
		<li>Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additief screening van protocol 2 (opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat met een herbruikbare additieve scherm)
	<ol>
<li>Eerst, het voorbereiden van het additief scherm: laat de overeenkomstige bevroren 96-Wells-cel cultuur plaat te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Vervolgens Centrifugeer het additieve scherm bij 1.000 x g gedurende 2 min.</li>
		<li>De voorwaarde (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler) voor te bereiden.</li>
		<li>Vul de reservoirs van een kristallisatie van de 96-wells-plaat met de voorwaarde. Van de vloeistof-handler, gaan op dezelfde manier als protocol 1, 2.2.2 stap, maar het invoeren van '80 µL' voor het volume in reservoirs.</li>
		<li>Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser met 3 componenten op het dek (de plaat met de additieve scherm, samen met de kristallisatie-plaat en de 8-well eiwit strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder, tabel 4).</li>
		<li>Zegel van de cel cultuur plaat met het scherm met een aluminium blad en plaats deze terug in de incubator van-20 ° C.</li>
		<li>Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

We stellen hierbij een conflicterende commercieel belang aangezien LifeArc de volgende producten commercialiseert: de 96 - en 48-well MRC platen, het MRC opknoping drop zegel, de MORPHEUS, Pi, ANGSTROM en LMB kristallisatie-schermen.

1 - voorbereiding en het gebruik van de eerste schermen opgeslagen in platen
Screening van kits moet worden vermengd voordat het wordt afgeleverd in platen, omdat lichte neerslag of fase scheiding in sommige buizen tijdens de opslag plaatsvindt. Wanneer een scherm is samengesteld uit twee kits (2 x 48 buizen), is de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie E1 van de koeling vervoerder. Wanneer een scherm bestaat uit 4 kits (4 x 24 buizen), de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie C1, de eerste buis van de derde kit wordt geplaatst in de locatie E1 en de eerste buis van de vierde kit is geplaatst in de locatie G1. Bij het invoegen van de buizen in hun koeling carrier, worden deksels geplaatst op een dienblad na de lay-out van de standaard 96-Wells-landschap. Aangezien goed nummers worden aangeduid op de top van de deksels met de fabrikanten, hierdoor kruiscontroles als alle buizen zijn geplaatst in de juiste volgorde. Dit helpt ook om de juiste deksels op de buizen vervangen bij het invullen van een beperkt aantal platen.
We slaan de vooraf ingevulde platen bij 10 ° C, een compromis invriezen en opslag bij 4 ° C, die leiden verslechtering van de omstandigheden en problemen met de afdichting tot kan te vermijden. Platen worden opgeslagen voor tot enkele maanden met normaal geen merkbare condensatie op de binnenzijde van het zegel. Dat geldt minder voor LMB05, LMB06, LMB09 en LMB10 platen zoals deze voorwaarden met relatief hoge concentraties van vluchtige reagentia (tabel 1 bevatten). Kleine hoeveelheid condensatie aan de binnenkant van het zegel afdichting efficiëntie vermindert en kruisbesmetting tussen putten terwijl de platen ontzegeling kan veroorzaken. Om te helpen met het voorkomen van condensatie tijdens eerste koeling, kunnen de platen eerst vanuit de carrousel in een geïsoleerde picknick koeler, dat is opgeslagen in een koelruimte van 4 ° C's nachts worden overgezet. De zeer langzame afkoeling minimaliseert de ontwikkeling van temperatuurgradiënten binnen de verzegelde putten en vandaar vermindert condensatie algemene15. Bovendien, zodra de platen worden opgeslagen in de 10 ° C incubator, wordt een in-house aangepaste SBS polystyreen deksel gezet op de plaat aan de bovenkant van elke stack (niet afgebeeld).
Het geheel van onze vooraf ingevulde platen kan worden gebruikt als een groot eerste scherm tegen een roman, in water oplosbare, eiwitSteekproef. Als alternatief kunnen minder platen worden geselecteerd om aan specifieke eisen voldoen. Bijvoorbeeld, LMB15 en LMB19 zijn schermen geformuleerd speciaal voor membraan eiwit monsters26,27, of LMB20 is een scherm met zware-atomen om experimentele fasering van diffractie gegevens28 geformuleerd (Zie ook : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulering van de MORPHEUS eiwit kristallisatie schermen</a>).
2. het opzetten van kristallisatie druppels
Wanneer u het systeem 2, moet screening kits met aanzienlijke hoeveelheid vluchtige reagentia worden verwerkt eerst. Dit vermijdt condensatie vormen op het rubber van de SBS-deksels, die invloed kunnen zijn op de behandeling van de deksel en plaat afdichting. Een SBS-deksel heeft een beetje van goedkeuring wanneer op de bovenkant van een plaat, dat is waarom ze moeten in eerste instantie worden aangepast (Zie Protocol, stap 1.2.6). De dode volumes van eiwit in de putjes van de plaat PCR zijn relatief genereuze (0.8 µL, zie legende van tabel 2). Merk op dat even gul dode volumes worden ingezet bij het gebruik van de dispenser nanoliter individueel met eiwit in 8-well strips (tabel 4). Kleinere dode volumes kan werken, maar sommige monsters voldoen aan de tips, kalibratie van een robot kan worden enigszins onnauwkeurig, de kamer kan worden warmer dan gebruikelijk, enz. Al leiden tot monster verliezen gedekt door de gulle dode volumes om te consolideren van de aanpak.
Recente ontwikkelingen ingeschakeld verdere miniaturisatie van experimenten en dus de hoeveelheid monster nodig voor het screenen van kristallisatie voorwaarden kan aanzienlijk worden verkleind door de integratie van de bijbehorende technologie29,30 . Bepaalde aspecten van verdere miniaturisatie moeten echter zorgvuldig, zoals de verdamping van druppels31 en de manipulatie van microcrystals32.
Ten slotte, centrifugeren van de plaat (2.000 rpm, 1 min) kan worden geïntegreerd als een routine laatste stap bij het instellen van kristallisatie druppels (in sferische boven-wells). Een meer consistente grootte en vorm van druppels als gevolg van centrifugeren kunnen verminderen reproduceerbaarheid kwesties33,34. Zeker, gecentreerd druppels zal verlichten de latere evaluatie van experimenten met behulp van een Microscoop, zoals de vereiste brandpuntsafstand gelijk over de gehele plaat zijn zullen.
3. de voordelen van de methode 4-hoek
Het belangrijkste voordeel van de methode 4-corner is de eenvoud, die minimaliseert fouten en eenvoudige geautomatiseerde protocollen vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, zal de 4 hoekoplossingen altijd worden geplaatst op het dek van een vloeibare handler na de dezelfde lay-out. Ook zijn alle programma's gebaseerd op vaste verhoudingen tussen de oplossingen (Figuur 3 c). Handmatige voorbereiding van de 4 hoekoplossingen verdient de voorkeur aan geautomatiseerde behandeling van oplossingen bij hoge concentraties die zeer viskeuze kunnen. Relatief snel en accuraat aspiratie/verstrekking is dan mogelijk op de meeste soorten vloeibare handlers met minimumeisen voor optimalisatie van vloeibare klassen. Toch, sommige hoekoplossingen mogelijk nog niet al te visceus voor een robot met een vloeistof-systeem efficiënt kan werken. Daarom hebben we gekozen voor een vloeibare handler met verdringerpomp (figuur 3B).
Naast de 2 lineaire verlopen van concentraties, kan een derde component (dat wil zeggen, een aantal buffers/additieven) met een constante concentratie worden getest in een handige manier. Hiervoor is eerst een relatief grote hoeveelheid een kernset van hoekoplossingen op een voldoende hogere concentratie, met uitzondering van het onderdeel worden gevarieerd, bereid. Vervolgens voorraadoplossingen met inbegrip van dit onderdeel wordt toegevoegd aan de eindconcentraties aanpassen. Bijvoorbeeld zijn 50 mL een reeks van 4 hoekoplossingen bereid bij 10% hogere concentraties dan in eerste instantie. Dit basispakket is vervolgens opgesplitst in 5 kleinere subsets van 4. Tot slot, 10% in volume van verschillende buffer-pH oplossingen wordt toegevoegd aan elke deelverzameling.
4. formaten en soorten additieve schermen
De schermen worden normaal gesproken opgeslagen bij-20 ° C (Figuur 4) omdat ze niet regelmatig worden gebruikt en volatile/unstable verbindingen bevatten. Het gebruik van een bevroren additieve scherm opgeslagen in een diep goed blok (1 mL in putten) moet vroeg worden gepland, omdat het duurt 12-24 hr voor alle additieve oplossingen te volledig ontdooien bij kamertemperatuur. Ook een groot aantal gebruikers delen hetzelfde additief scherm, mogelijk veroorzaakt problemen met inbegrip van kruisbesmetting. Tot slot, de hoogte van diep goed blokken maakt ze ongeschikt voor de meeste nanoliter dispensers. Als een handige oplossing voor het omzeilen van deze kwesties, moet het scherm van het diep goed blok worden overgedragen aan laag-profiel platen (Figuur 4).
Historisch, additieve schermen die een breed scala aan enkele reagentia (met enkele concentraties omvatten) geweest zeer populaire35,,36. Echter, andere soorten additieve schermen hebben ontwikkeld die mixen van additieven37 of een beperkt aantal één additieven vinden op verschillende concentraties38 integreren. Tenslotte is een aanvullende benadering om te onderzoeken van het effect van additieven op de monsters voorafgaande aan de kristallisatie39,40.
5. meer overwegingen
Goede praktijken: De meeste schermen schadelijk of zelfs giftige stoffen bevatten en vandaar adequate persoonlijke bescherming moet worden ingezet tijdens de protocollen. Even, bewegende delen van de robots kan leiden tot verwondingen, vooral wanneer het proberen om handmatig een conflict veroorzaakt terwijl een programma wordt uitgevoerd (hoewel de meeste van de robots noodstop/knopsysteem hebben). Vanwege de technische complexiteit betrokken, regelmatige controle van de robots, schermen en programma's met eerder gekenmerkt monsters zijn belangrijk voor de aanhoudende hoge niveaus van reproduceerbaarheid.
Doorvoer: Als een indicatie, tussen 4000 tot 8000 LMB worden platen geproduceerd jaarlijks met het systeem 1 (en vervolgens werknemer door gebruikers voor de eerste screening). Het is niet aangepast aan de voorraad een grote hoeveelheid vooraf ingevulde platen bij 10 ° C wanneer de verwachte omzet veel lager, als na 4-5 maanden, sommige voorwaarden is beginnen zal te verslechteren en verdampen. Verschillende benaderingen van automatisering protocollen zijn doorgevoerd voor kleine tot middelgrote laboratoria41.
Opslaan en de evaluatie van experimenten: Na de voorbereiding van de druppels, worden platen opgeslagen op de planken van de lage-trillingen in een kamer op 4 of 18 ° C met strak gecontroleerde temperatuur (± 0,5 ° C maximale afwijking). Experimenten worden beoordeeld met behulp van koude licht bron microscopen. Verschillende geautomatiseerde beeldvormingssystemen commercieel beschikbaar zijn, maar men moet alle aspecten zorgvuldig overwegen: de snelheid die is vereist voor het scannen van een plaat zullen volstaan voor hoge doorvoersnelheid? Objecten die geen kristallen verstoort autofocus? De resulterende kwaliteit van beelden voldoende zal zijn om ter plaatse zeer kleine kristallen (met name rond de rand van de druppels)? 42 , 43 , 44
Vergelijking van kristallisatie voorwaarden: Na zorgvuldig onderzoek over de aard van de aanvankelijk verkregen kristallen, kunt een trends en overeenkomsten over voorwaarden gebruik van de <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB scherm database</a> of de C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45analyseren.

Röntgendiffractie wordt uitgebreid toegepast op verder ons begrip van de mechanismen van de biologische en ziekte op het atomaire niveau en vervolgens bij het rationele aanpak van drug discovery1. Voor dit, gezuiverd en geconcentreerde (2-50 mg/mL) macromoleculaire monsters van eiwitten, DNA, RNA, andere liganden en hun complexen zijn trialed want hun neiging om vorm besteld driedimensionale roosters door kristallisatie2,3 ,4. Wanneer hoge kwaliteit kristallen worden verkregen die diffract van x-stralen, kan de kristalstructuur worden opgelost op in de buurt van atomaire resolutie5,6. Cruciaal, de voorwaarden om een nieuwe steekproef kristalliseren niet kan worden voorspeld en de opbrengst van hoge kwaliteit kristallen is meestal zeer laag. Een onderliggende reden is dat veel monsters van belang hebben uitdagende biochemische eigenschappen, waardoor ze unstable op het bijbehorende tijdschema voor de kristallisatie (meestal een paar dagen). Tot slot, het proces wordt nog verergerd door de tijd die nodig is om monsters en varianten van de steekproef te produceren, en voor het optimaliseren van hun zuivering en kristallisatie7,-8.
Een voorwaarde van kristallisatie is een oplossing met een neerslaande dat vermindert de oplosbaarheid van de steekproef en voorwaarden bevatten vaak ook buffers en additieven. Honderden van dergelijke reagentia zijn geschikt om te veranderen van de parameters van de kristallisatie experimenten zoals ze weinig geneigd hebben te bemoeien met monster integriteit (zoals eiwit of nucleïnezuur ontvouwen). Terwijl miljoenen combinaties van kristallisatie reagentia testen is niet haalbaar, is testen verschillende te veel screening kits - geformuleerd met verschillende strategieën9,10 - het mogelijk met verkleinde proeven en geautomatiseerde protocollen. In dit perspectief moet is het meest vatbaar techniek waarschijnlijk damp verspreiding met 100-200 nL druppels zittend op een kleine ruim boven een reservoir met de kristallisatie voorwaarde (25-250 µL), uitgevoerd in gespecialiseerde kristallisatie platen11 , 12. het eiwitSteekproef en voorwaarde die vaak worden gecombineerd in een 1:1 verhouding voor een totaal volume van 200 nL bij het opzetten van de druppels in de bovenste-putten. Robotic nanoliter eiwit kristallisatie kan worden geïmplementeerd met alternatieve technieken en platen zoals de minderjarigen olie batch13 en de Lipidic kubieke fase14 (de laatste een worden specifiek toegepast op trans-membraaneiwitten die zijn zeer slecht oplosbaar in water).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">De kristallisatie faciliteit in het MRC-LMB</a> werd gestart in de vroege 2000s, en een vroege overzicht van onze geautomatiseerde protocollen werd gepresenteerd in 200515. Een historische inleiding aan eiwit kristallisatie werd gepresenteerd en ook een overzicht van de voordelen van robotic nanoliter benaderen (en vervolgens een nieuwe benadering voor routinematige experimenten). Sinds macromoleculaire kristallisatie is in wezen een stochastisch proces met zeer weinig of geen nuttige informatie vooraf, met een breed scala van de initiële voorwaarden op grond (geschikt) verhogen het rendement van kwaliteit diffractie kristallen16. Bovendien, is een vaak vergeten voordeel van een grote aanvangsscherm aanzienlijk te verminderen de noodzaak voor optimalisatie van monsters en kristallen in veel gevallen. Natuurlijk kan een nog moeten gaan met de optimalisering van een aantal initiële voorwaarden later. De concentratie van de reagentia en de pH zijn meestal daarna systematisch onderzocht. Meer reagentia kunnen ook worden ingevoerd in de geoptimaliseerde of meerdere voorwaarden parameters van kristallisatie verder te wijzigen. Zeker, men kristallisatie moet proberen met een vers bereide monster, vandaar de bijbehorende protocollen moet eenvoudig en beschikbaar elk moment.
Hier twee volautomatische systemen ontworpen op het MRC-LMB (systemen 1 en 2) en de bijbehorende protocollen volledig worden beschreven. De belangrijkste toepassing van deze twee systemen is eerste screening door damp diffusie in drop kristallisatie platen zitten. Systeem 1 integreert een vloeibare handler, een geautomatiseerde carrousel op voorraad platen, een inkjet-printer voor het labelen van de plaat en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 1, zijn 72 96-wells-platen gevuld met verkrijgbare screening kits (80 µL van voorwaarde overgedragen aan reservoir van een startende volume van 10 mL in proefbuizen), label en verzegeld. De platen worden vervolgens opgeslagen in een incubator van de 10 ° C waar ze beschikbaar voor gebruikers op elk gewenst moment (als eerste schermen zijn 'LMB platen' genoemd).
Systeem 2 integreert een vloeibare handler, een nanoliter dispenser en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 2, druppels (100-1000 nL) zitten voor damp diffusie experimenten worden geproduceerd door het combineren van voorwaarden en het monster in de bovenste-putten van 20 48 - of 96-wells-platen vooraf gevuld met voorwaarden. Dit betekent 1.920 eerste screening voorwaarden trialed bij het gebruik van 20 LMB platen op het systeem 2.
Robots zijn ook individueel gebruikt voor de optimalisatie van de geselecteerde voorwaarden, en de bijbehorende semi-geautomatiseerde protocollen zijn ook beschreven. De 4-hoek methode17 is routinematig aangewend om te produceren optimalisatie schermen. Het bijbehorende protocol vereist eerst de handmatige voorbereiding van 4 oplossingen ('A, B, C en D'). Twee lineaire verlopen van concentraties (voor twee belangrijkste kristallisatie agenten) worden dan automatisch gegenereerd rechtstreeks in de reservoirs van een plaat van kristallisatie. Hiervoor opleidingscyclus een spuit-gebaseerde vloeibare handler de 4 hoekoplossingen in verschillende verhoudingen.
Voor het verder optimaliseren van een voorwaarde, kan een additief schermen die potentieel de eigenschappen van de resulterende kristallen18 verbeterendienst. Twee benaderingen zijn beschikbaar voor additieve screening: een protocol beginnen met additieven in de reservoirs van de kristallisatie platen afgeleverd vóór de oprichting van de druppels (protocol 1) en een ander protocol waar het additieve scherm wordt aangeboden direct op de druppels (protocol 2).
Andere nuttige ontwikkelingen die ingeleid bij het MRC-LMB ter vergemakkelijking van de geautomatiseerde macromoleculaire kristallisatie, worden ook gepresenteerd. In wezen, kristallisatie platen en bijbehorende voorzieningen zoals een stapelbare samenleving van biomoleculaire Screening (SBS) deksel dat minimaliseert verdamping van voorwaarden bij het gebruik van het systeem 2.
Bij beknoptheid, wordt ervan uitgegaan dat gebruikers bekend met de basisfuncties en het onderhoud van de nanoliter dispenser, de inkjetprinter en de zelfklevende plaat sealer zijn. Tenzij anders vermeld, platen op het dek van de robots zijn geplaatst zodat het goed A1 ('A1-corner') is naar de hoek van de rug links van de drager van een plaat.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&reg; STAR&trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&trade; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td></tr><tr><td>Mosquito&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dragonfly&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Adhesive plate sealer</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td></tr><tr><td>Inkjet printer 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td></tr><tr><td>Crystallization screens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Ammonium Sulfate</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Sodium Chloride</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 2

geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het mrc laboratory of molecular biology

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Wanneer hoge kwaliteit kristallen die diffract van x-stralen worden verkregen, kan de kristalstructuur op in de buurt van atomaire resolutie worden opgelost. De voorwaarden om te kristalliseren eiwitten, Ani, RNAs en hun complexen kunnen echter niet worden voorspeld. Dienst van een breed scala van voorwaarden is een manier om het verhogen van het rendement van kwaliteit diffractie kristallen. Twee volledig geautomatiseerde systemen ontwikkeld op het MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, Engeland, MRC-LMB) die kristallisatie screening tegen 1.920 uitgangsvoorwaarden vergemakkelijken door damp diffusie in nanoliter druppels. Semi-automatische protocollen zijn ook ontwikkeld om te optimaliseren van voorwaarden door het veranderen van de concentraties van de reagentia, de pH, of door de invoering van additieven die eigenschappen van het resulterende kristallen potentieel te verbeteren. Alle bijbehorende protocollen zullen worden in detail beschreven en kort besproken. Tezamen, hierdoor handig en zeer efficiënte macromoleculaire kristallisatie in een multi-user-faciliteit, terwijl het geven van de gebruikers controle over essentiële parameters van hun experimenten.

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige kristallen te produceren op basis van initiële kristallisatie-screeningcondities. De kristallen kunnen worden gebruikt om de structuren van eiwitten, DNA, RNA en hun complexen te bestuderen. Het bestuderen van macromoleculaire structuren is in toenemende mate uitdagend geworden.Het aanbieden van een breed scala aan begincondities verhoogt de opbrengst van bruikbare kristallen, terwijl de noodzaak voor monster- en kristaloptimalisatie wordt verminderd. De twee volledig geautomatiseerde systemen, de LMB, faciliteren de preparatie van tot wel 1.920 dampdiffusie-experimenten in nanoliterdruppels. Omwille van de beknoptheid wordt ervan uitgegaan dat gebruikers al bekend zijn met de basisfuncties en het onderhoud van de nanoliterdispenser, de inkjetprinter en de adhesieve plaatsealer.Voordat u de procedure uitvoert, moet u ervoor zorgen dat de robots van het systeem zijn geïnitialiseerd en dat de bijbehorende besturingssoftware is geopend. Schakel de koeler van de buizenkoelhouder in, ongeveer 30 minuten voordat het hoofdprogramma wordt gestart. Plaats een testplaat op de gemotoriseerde SBS-houder van de plaatsealer.Bedien de plaatsealer en controleer of de folie correct is aangebracht. Herhaal deze test nog twee keer om te verifiëren dat de plaatsealer gereed is. Voeg vervolgens 20 liters gedeïoniseerd water toe aan de hoofdcontainer van de liquid handler.Koppel de koppelingsinvoegen los van de kleinere houder met 20% ethanol spoeloplossing en verbind de invoegen met de hoofdhouder. Voer de juiste schermnaam in op het touchscreen van de inkjetprinter. Open vervolgens de deur van het carrousel en sluit deze weer om de rotatie van het carrousel te activeren.Open de deur wanneer de eerste stapel verschijnt. Vul de eerste stapel volledig met 22 crystallisatieplaten, waarbij kolom één telkens naar buiten is gericht. Vul de volgende twee stapels op dezelfde wijze volledig.Plaats de resterende zes platen in de hoogste posities van de vierde stapel en sluit vervolgens de deur van het carrousel. Controleer of het display van de koeler 14 °C aangeeft. Keer de geselecteerde screeningskits voorzichtig en herhaaldelijk gedurende één minuut om.Open vervolgens het voorpaneel van de vloeistofhandler. Open de buisjes en plaats deze in de koelhouder volgens de standaard 96-well lay-out. Plaats bij elk buisje dat in de houder wordt gezet het bijbehorende dopje op het plateau in dezelfde 96-well lay-out.Bij het gebruik van Systeem 1 worden de labelkabels op het plateau in het 96-wells layout geplaatst om te kunnen controleren of de buisjes correct zijn gerangschikt. Controleer de posities van de buisjes en zorg er vervolgens voor dat alle buisjes waterpas staan en goed in de houder rusten. Sluit daarna het voorpaneel.Selecteer in het Startup-venster van de software van de vloeistofhandler Run Maintenance en open het Flushing-programma. Voer het programma uit om de 20% ethanol uit het systeem te spoelen en de buitenkant van de vloeistofdoseertips te wassen. Wanneer het spoelen is voltooid, klikt u op Cancel om terug te keren naar Startup.Selecteer Run An Existing Process en klik op Start Your Selection. Open het doseerprogramma van de MRC Kit. Vul 18" in bij Instances in het configuratiescherm en start het programma. Monitor het systeem terwijl de eerste vier platen worden gelabeld, gevuld en verzegeld.Laat het systeem niet onbeheerd achter totdat de bereiding van de eerste vier platen is voltooid. Zodra alle 72 platen zijn voorbereid en teruggeplaatst in het carrousel, wisselt u de koppelingsinzetstukken van de container met gedeïoniseerd water naar de container met 20% ethanol. Voer het startup flush-programma uit via hetzelfde proces als voorheen.Schakel de koeler uit en gooi de lege buisjes van de screeningkit weg. Verwijder voorzichtig de 72 voorbereide platen uit het carrousel. Gooi platen die onjuist zijn gevuld of slecht zijn afgesloten weg.Bewaar de gebruiksklare platen bij 10 °C. Controleer eerst of de robots van het systeem zijn ingeschakeld, of de nanoliterdispenser is geïnitialiseerd met de software geopend, en of de methodemanager van de vloeistofbehandelaar is geopend. Schakel de koelhouder voor microtubes ongeveer 15 minuten voordat het hoofdprogramma wordt gestart in.Plaats een testplaat op de gemotoriseerde SBS-drager van de plaatsealer. Start de plaatsealer en controleer of de plaat correct is afgesloten. Test de plaatsealer drie keer.Gebruik vervolgens de nanoliterdispenser om druppels van 100 nanoliter van de testoplossing in een testplaat aan te brengen. Hier wordt een lichtmicrofoto getoond van een druppel van 100 nanoliter, geproduceerd door de nanoliterdispenser, met een testoplossing waarin rode kleurstof is gebruikt. Sluit de software van de nanoliterdispenser en verwijder het strip houderblok van het deck.Plaats vervolgens een vooraf gevulde kristallisatieplaat met 96 putjes, die de hoogste relatieve hoeveelheid vluchtige reagentia in de condities bevat, in een op maat ontworpen plaathouder. Verwijder de kleefilm van de plaat. Open het voorpaneel van de vloeistofhandler en plaats de onafgedichte plaat op het dek achter de eerste schuifhouder.Dek de plaat af met een SBS-aluminiumdeksel. Zet het deksel op zijn plaats richting de linkerachterhoek van de houder door voorzichtig druk uit te oefenen op de tegenoverliggende hoek van het deksel. Bij gebruik van Systeem 2 moeten screeningskits met aanzienlijke hoeveelheden vluchtige reagentia als eerste worden verwerkt.Dit voorkomt condensvorming op de SBS-leads, wat de geautomatiseerde hantering van de leads of het afsluiten van de platen zou kunnen beïnvloeden. Ontzegel, plaats in de schuifhouders en bedek de resterende 19 platen op dezelfde manier, beginnend bij de meest vluchtige condities en eindigend bij de minst vluchtige. Zodra de koelhouder voor microbuisjes 4 °C bereikt heeft, aangegeven door een groen licht, verwijdert u de afdekking.Snijd het dopje af van een microbuis die ten minste 440 µL van een eiwitmonster bevat. Zorg ervoor dat het monster geen schuim boven de meniscus heeft, omdat dit het vloeistofdetectiesysteem zal storen. Plaats de buis in positie 1 van de koelhouder voor microbuizen.Plaats een PCR-plaat op het deck van de liquid handler voor de plaatverplaatsingsadapterhouder. Sluit vervolgens het voorpaneel. Selecteer in de interface voor methodebeheer van de liquid handler de optie Setup Plates.Houd de initialisatie van beide systemen in de gaten en vul de run-parameters in, waaronder het type plaat en het aantal druppels per conditie, de druppelgrootte, de positie van de eerste te verwerken plaat en het aantal platen. Klik op Nee wanneer er wordt gevraagd of u hulp wilt bij het laden van het deck. Zodra u heeft gecontroleerd dat er geen lege tiprekken zijn, klikt u op OK. Zodra u heeft gecontroleerd dat er voldoende tips voor de run aanwezig zijn, klikt u op OK. Werk indien nodig het tipbeheersysteem bij en klik op OK. Zorg ervoor dat het deck van de nanoliter-dispenser vrij is van het stripHouder-blok, dat de drager zich aan de achterzijde bevindt van de 50 µL tipstacks, en dat deze vrij zijn van de aluminium SBS-deksels.Controleer dubbel of alle overige benodigde componenten gereed zijn en start vervolgens het proces. Monitor het systeem terwijl de nanoliter-dispenser de druppels in de eerste plaat plaatst en de plaatsealer vervolgens de plaat verzegelt. Laat het systeem niet onbeheerd achter tot de preparatie van de eerste plaat voltooid is.Zodra alle 20 platen zijn voorzien van kristallisatiedruppels en automatisch zijn teruggekeerd naar de schuivende dragers, opent u het voorpaneel en verwijdert u voorzichtig de platen. Controleer of de platen correct zijn afgesloten voordat u ze bewaart voor kristallisatie. Reinig de SBS-deksels met de 20% ethanol-oplossing voordat u ze voor opslag stapelt aan de linkerzijde van de liquid handler.Gooi de PCR-plaat en de microbuis weg. Zet de koelhouder voor microbuizen uit en veeg de condensatie weg. Leg een papieren handdoek op het koeloppervlak om verdere condensatie te absorberen.Vervang vervolgens de afdekplaat van de drager en sluit het voorpaneel. OmpF en MreB werden aanvankelijk gescreend met behulp van deze volledig geautomatiseerde protocollen. OmpF-kristallen van voldoende kwaliteit voor röntgendiffractie werden aangetroffen in well A4 van de LMB 7-plaat.Diffractiekwaliteitskristallen van MreB werden gevonden in well D12 van de LMB 20 plaat. Het bewaren van pre-fuel platen bij 10 graden Celsius is een compromis om bevriezing en opslag bij 4 graden te voorkomen, wat kan leiden tot verslechtering van de kristallisatiecondities en problemen door condensatie. Wanneer ze op deze manier worden bewaard, kunnen platen binnen vier tot vijf maanden worden gebruikt.Jaarlijks worden er tussen de 4.000 en 8.000 LMB-platen geproduceerd met Systeem 1, die vervolgens worden gebruikt voor de initiële screening. De protocollen moeten op een andere manier worden geoptimaliseerd wanneer de verwachte omzet veel lager is. Onze volledige set pre-fuel platen wordt gewoonlijk gebruikt als een grote initiële screening voor een nieuw monster.Afhankelijk van specifieke monstervereisten kunnen er echter minder platen worden geselecteerd. Na het bereiden van de druppels worden de platen bewaard op trillingsarme planken waarbij de temperatuur strikt wordt geregeld op 4 of 18 degrees Celsius. Experimenten worden beoordeeld met microscopen voorzien van een scroll-lichtbron.Na een zorgvuldige inspectie van de aard van de kristallen kunnen kenmerken en overeenkomsten tussen verschillende condities worden geanalyseerd met webgebaseerde tools zoals de LMB- of C6 Screen-databases. Verdere optimalisatie van de kristallisatiecondities kan mogelijk nog nodig zijn. Aanvullende geautomatiseerde protocollen, met de 4-corner-methoden en additief screening, worden beschreven in ons manuscript.

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De 3-D structuur van een molecuul zorgt voor een uniek inzicht in hoe het molecuul functies. De belangrijkste methode voor de bepaling van de structuur bijna-atomaire resolutie is X-ray kristallografie. Hier tonen we de huidige methoden voor het verkrijgen van drie-dimensionale kristallen van een bepaalde macromolecuul die geschikt zijn voor de structuur bepaling door X-ray kristallografie.

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.

Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening

Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

Een nieuwe steekproef houder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie samen met een geschikt behandelingsprotocol wordt voorgesteld. Het systeem maakt kristalgroei, Crystal soaken en in situ diffractie gegevens verzamelen op beide, ambient en cryogene temperatuur zonder de noodzaak van een kristal manipulatie of montage.

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Structurele studies van biomacromolecules door kristallografie vereisen hoogwaardige kristallen. Hier demonstreren we een protocol dat kan worden gebruikt door OptiCrys (een volledig geautomatiseerd instrument ontwikkeld in ons lab) en / of microdialyseknoppen voor het kweken van grote hoogwaardige kristallen op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.

Optimalisatie van kristalgroei voor neutronenmacromoleculaire kristallografie

De signaal-ruisverhouding van gegevens is een van de belangrijkste overwegingen bij het uitvoeren van röntgendiffractiemetingen vanaf microkristallen. De VMXm beamline biedt een geluidsarme omgeving en microbeam voor dergelijke experimenten. Hier beschrijven we monstervoorbereidingsmethoden voor het monteren en koelen van microkristallen voor VMXm en andere microfocus macromoleculaire kristallografiebundellijnen.

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

Hier beschrijven we hoe we de geautomatiseerde macromoleculaire kristallografiepijplijnen kunnen gebruiken voor eiwit-naar-structuur, snelle ligand-eiwitcomplexanalyse en grootschalige fragmentscreening op basis van de CrystalDirect-technologie in het HTX-laboratorium in EMBL Grenoble.

De geautomatiseerde kristallografiepijpleidingen in de EMBL HTX-faciliteit in Grenoble

Dit protocol beschrijft high-throughput kristallisatiescreening, variërend van de 1.536 microassay-plaatvoorbereiding tot het einde van een experimenteel tijdvenster van 6 weken. Details zijn opgenomen over de monsteropstelling, de verkregen beeldvorming en hoe gebruikers analyses kunnen uitvoeren met behulp van een grafische gebruikersinterface met kunstmatige intelligentie om macromoleculaire kristallisatieomstandigheden snel en efficiënt te identificeren.

High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.

Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source

Leer geautomatiseerde kristallisatieprotocollen voor structurele biologie met nanoliter druppels en vapor-diffusie. Deze methode produceert tot 1.920 hoogwaardige kristallen voor macromoleculaire studies.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Meer video's verkennen