Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige kristallen te produceren uit de eerste kristallisatiescreeningscondities. De kristallen kunnen worden gebruikt om de structuren van eiwitten, DNA, RNA en hun complexen te bestuderen. Iets over macromoleculaire structuren is steeds uitdagender geworden.

En het bieden van een breed scala aan initiële omstandigheden verhoogt de opbrengst van bruikbare kristallen, terwijl het de behoefte aan monster- en kristaloptimalisatie vermindert. De twee volledig geautomatiseerde systemen, de LMB, vergemakkelijken de voorbereiding van maximaal 1.920 dampdiffusie-experimenten in nanoliter druppels. Voor de duidelijkheid wordt ervan uitgegaan dat gebruikers al bekend zijn met de basisfuncties en het onderhoud van de nanoliter dispenser, de inkjetprinter en de zelfklevende plaatverzegelaar.

Voordat u de procedure uitvoert, moet u ervoor zorgen dat de robots van het systeem zijn geïnitialiseerd en dat hun besturingssoftware is geopend. Zet de koeler van de buiskoeldrager aan, ongeveer 30 minuten voordat het hoofdprogramma wordt gestart. Plaats een testplaat op de gemotoriseerde SBS-drager van de plaatverzegelaar.

Laat de plaatverzegelaar lopen en controleer of de folie correct is aangebracht. Herhaal deze test nog twee keer om te verifiëren dat de plaatverzegelaar klaar is. Voeg vervolgens 20 liter gedeïoniseerd water toe aan de hoofdcontainer van de vloeistofhandler.

Ontkoppel de koppelingsuitsteeksels van de kleinere container met 20% ethanol spoelvloeistof en koppel de uitsteeksels aan de hoofdcontainer. Voer de juiste schermnaam in op de touchscreen van de inkjetprinter. Open en sluit vervolgens de carrouseldeur om de carrouselrotatie te activeren.

Open de deur wanneer de eerste stapel zich presenteert. Laad de eerste stapel volledig met 22 kristallisatieplaten, met kolom één naar buiten gericht. Laad de volgende twee stapels op dezelfde manier volledig.

Laad de resterende zes platen in de hoogste posities van de vierde stapel en sluit vervolgens de carrouseldeur. Controleer of de koeler 14 graden Celsius aangeeft. Draai de geselecteerde screeningkits gedurende één minuut voorzichtig en herhaaldelijk om en om.

Open vervolgens het voorpaneel van de vloeistofhandler. Open de buisjes en plaats ze in de koeldrager in de standaard 96-well lay-out. Plaats bij het plaatsen van elke buis in de drager het deksel erop in dezelfde 96-well lay-out.

Bij gebruik van Systeem 1 worden de labels op de drager geplaatst in de 96-well lay-out om het kruiscontroleren mogelijk te maken dat de buisjes correct zijn gerangschikt. Kruiscontroleer de buisposities en zorg er vervolgens voor dat alle buisjes horizontaal staan en in de drager zijn neergedaald. Sluit vervolgens het voorpaneel.

Selecteer in het opstartvenster van de vloeistofhandlersoftware 'Uitvoeren Onderhoud' en open het Spoelprogramma. Voer het programma uit om het 20% ethanol uit het systeem te spoelen en om de buitenkant van de vloeistofdispensertips te wassen. Wanneer het spoelen voltooid is, klikt u op Annuleren om terug te keren naar het opstartvenster.

Selecteer 'Uitvoeren Bestaand Proces' en klik op 'Uw Selectie Starten'. Open het MRC Kit-dispenserprogramma. Vul in 'voor Instances' in het Configuratiescherm in en voer het programma uit. Bewaak het systeem terwijl de eerste vier platen worden gelabeld, gevuld en verzegeld.

Laat het systeem niet onbeheerd totdat de voorbereiding van de eerste vier platen voltooid is. Zodra alle 72 platen zijn voorbereid en terug in de carrousel zijn geplaatst, schakel de koppelingsuitsteeksels van de container met gedeïoniseerd water naar de container met 20% ethanol. Voer het opstartspoelprogramma uit met behulp van dezelfde procedure als eerder.

Schakel de koeler uit en gooi de lege screeningkitbuisjes weg. Verwijder voorzichtig de 72 voorbereide platen uit de carrousel. Gooi onjuist gevulde of slecht verzegeld platen weg.

Bewaar de gebruiksklare platen bij 10 graden Celsius. Zorg er eerst voor dat de robots van het systeem zijn ingeschakeld, dat de nanoliter dispenser is geïnitialiseerd met geopende software en dat de methodebeheerder van de vloeistofhandler is geopend. Schakel de microbuiskoeldrager ongeveer 15 minuten voordat het hoofdprogramma wordt gestart.

Plaats een testplaat op de gemotoriseerde SBS-drager van de plaatverzegelaar. Laat de plaatverzegelaar lopen en controleer of de plaat goed is verzegeld. Test de plaatverzegelaar drie keer.

Laat vervolgens de nanoliter dispenser 100 nanoliter druppels testsolutie in een testplaat zetten. Hier is een lichtmicrograaf van een 100 nanoliter druppel te zien, geproduceerd door de nanoliter dispenser, met de testsolutie gemaakt met rode kleurstof. Sluit de nanoliter dispenser software en verwijder de striphouderblok van het dek.

Plaats vervolgens in een op maat ontworpen plaathouder een voorgevulde 96-well kristallisatieplaat met de hoogste relatieve hoeveelheid vluchtige reagentia in zijn omstandigheden. Verwijder de zelfklevende film van de plaat. Open het voorpaneel van de vloeistofhandler en plaats de onverzegelde plaat op het dek aan de achterkant van de eerste schuifdrager.

Bedek de plaat met een SBS aluminium deksel. Zet het deksel naar de achterkant links van de drager door lichte druk uit te oefenen op de tegenovergestelde hoek van het deksel. Bij gebruik van Systeem 2 moeten screeningkits met aanzienlijke hoeveelheden vluchtige reagentia als eerste worden verwerkt.

Dit voorkomt dat condens op de SBS-leidingen vormt, wat het geautomatiseerde hanteren van de leidingen of het verzegeld zijn van de plaat zou kunnen beïnvloeden. Ontdoe de resterende 19 platen op dezelfde manier van het verzegelen, laad ze in de schuifdragers en bedek ze, beginnend met de meest tot de minst vluchtige omstandigheden. Zodra de microbuiskoeldrager 4 graden Celsius bereikt, zoals aangegeven door een groen licht, verwijdert u het deksel.

Snijd het deksel af van een microbuis die minimaal 440 microliters eiwit