Name: Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer immunolabeling om stabiele, dynamische en ontluikende microtubuli te analyseren in ontwikkelende zebrafishembryo's. Deze methode optimaliseert in situ-detectie en kwantificering voor ontwikkelingsneurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De confocal microscoop werd gekocht met geld van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF), subsidie #DBI-0722569. Het onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse nationale instituten van gezondheid/nationale Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) subsidie #GM085290 en Amerikaanse departement van defensie (DOD) subsidie #W81XWH-16-1-0466 toegekend aan R.M. Brewster. E. Vital werd gesteund door een subsidie naar UMBC van het Howard Hughes Medical Institute via de pre college en Undergraduate Science Education Program, verlenen van #52008090. S.P. Brown werd ondersteund door een Amerikaanse departement van onderwijs GAANN Fellowship, een Meyerhoff Graduate Fellowship gefinancierd door subsidie van het NIH/NIGMS, #GM055036, en een onderzoek assistentschap gefinancierd door de V.S. DOD subsidie #W81XWH-16-1-0466.

<ol><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).</li>
<li>Conde, C., Cáceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).</li>
<li>Kaverina, I., Straube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+migration+by+dynamic+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell migration by dynamic microtubules.</a> Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).</li>
<li>Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+by+%CE%B3-tubulin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).</li>
<li>Howard, J., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+fluctuation+and+switching+at+microtubule+plus+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).</li>
<li>Schulze, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+stable+populations+of+microtubules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and stable populations of microtubules in cells.</a> J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).</li>
<li>Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+microtubules%3A+Tyrosinated+and+nontyrosinated+alpha+tubulin+are+distributed+differently+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo.</a> Cell. 38 (3), 779-789 (1984).</li>
<li>Li, R., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+polymer+polarity%3A+how+the+cytoskeleton+builds+a+polarized+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+for+monitoring+in+vivo+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).</li>
<li>Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol+CB%22%5BJournal%5D)">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).</li>
<li>Tran, L. D., Hino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+at+the+vegetal+cortex+predict+the+embryonic+axis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish.</a> Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).</li>
<li>Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+chemical+modulation+of+spastin-dependent+axon+outgrowth+in+zebrafish+embryos+indicates+a+role+for+impaired+microtubule+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia.</a> Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).</li>
<li>Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).</li>
<li>Andersen, E. F., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+movements+in+vivo+correlate+with+specific+neurite+formation+downstream+of+LIM+homeodomain+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity.</a> Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).</li>
<li>Lee, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+microtubule+and+actin+cytoskeleton+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly.</a> Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+and+post-translational+modification+of+microtubules+during+cellular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis.</a> BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).</li>
<li>Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).</li>
<li>Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polarity+protein+Pard3+is+required+for+centrosome+positioning+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation.</a> Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).</li>
<li>Westermann, S., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+regulate+microtubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications regulate microtubule function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).</li>
<li>Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+protein+1b+is+required+for+shaping+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube.</a> Neural Develop. 11, 1(2016).</li>
<li>Nam, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tau%2C+a+microtubule+associated+protein%2C+in+Drosophila+photoreceptor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+N+Y+N+2000%22%5BJournal%5D)">Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis.</a> Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).</li>
<li>Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+release+from+the+centrosome+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule release from the centrosome in migrating cells.</a> J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).</li>
<li>Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+and+anchoring+at+the+centrosome+are+independent+processes+linked+by+ninein+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function.</a> J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).</li>
<li>Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+centrosomal+protein+NEDD1+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development.</a> Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Lateral+Mounting+of+Zebrafish+Embryos%3A+Analysis+of+Spinal+Cord+Development%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development.</a> JoVE J Vis Exp. (84), e50703(2014).</li>
<li>FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+confocal+fluorescence+microscopy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview.</a> Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2010).</li>
<li>Z-functions - ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Z-functions">https://imagej.net/Z-functions</a> (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn momenteel vele methoden voor imaging-MT dynamiek in de vroege ontwikkeling van de zebravis, variërend van levende beeldvorming van tagged moleculen tot immunolabeling van vaste weefsel11,12,13,14. Hoewel MTs in één cel kunnen bestaan in dynamische of stabiele staten, is epithelialization een proces waarin de MTs is geleidelijk gestabiliseerd na verloop van tijd. Met behulp van merkers v...

Microtubuli (MTs) zijn polymeren van α - en β-tubuline dat tot lineaire protofilaments samenvoegen, waarvan er verscheidene combineren om te vormen van een holle buis1,2. MTs zijn gepolariseerde structuren, met snelgroeiende plus uiteinden en langzaam groeiende minus uiteinden die zijn verankerd in de centrosoom of andere microtubulus-organiseren center (MTOC)3. DOVO MT vorming wordt geïnitieerd door nucleatie op de complexe γ-tubuline-ring (γ-TURC), waarmee een sjabloon voor MT vergadering4. In een bepaalde cel kunnen twee populaties van MTs worden onderscheiden die draaien tegen verschillende tarieven. Dynamische MTs verkennen hun cellulaire omgeving door te schakelen tussen de fasen van groei en krimp in een proces dat bekend staat als dynamische instabiliteit5. In tegenstelling tot dynamische MTs, stabiele MTs zijn niet-groeiende en hebben een langere halfwaardetijd dan dynamische MTs6.

Decennia van onderzoek in de celbiologie heeft geboden een verfijnde allerlei tools om te studeren MT structuur en functie en resulteerde in een grote hoeveelheid kennis over deze cytoskeletal elementen. Bijvoorbeeld, MTs spelen een centrale rol bij de totstandbrenging en het onderhoud van de polariteit van de cel, die toe te schrijven niet alleen aan hun intrinsieke polariteit, maar ook voor de differentiële subcellular verdeling van stabiel versus dynamische MTs7, is 8. daarentegen veel minder is begrepen over MT architectuur en functie in meer complexe driedimensionale (3-D) omgevingen, zoals het gewervelde embryo, gedeeltelijk als gevolg van de uitdaging van het cytoskelet van de MT op hoge resolutie beeldvormende. Niettegenstaande deze beperking, de recente generatie GFP-uiting te geven aan transgene lijnen dat label MTs of voorbijgaande expressie van fluorescently-tagged MT markers toegenomen ons begrip van de dynamische veranderingen die MTs ondergaan en hun cellulaire en Developmental rol in de zebravis embryo. Het hele MT-netwerk kan worden beeld in transgene lijnen in welke tubuline is ofwel rechtstreeks gelabelde9 of tubuline polymeren niet indirect worden aangeduid met behulp van MT-geassocieerde eiwitten Doublecortin-like-kinase (Dclk) of Ensconsin (EMTB)10, 11. Andere lijnen (en constructies) zijn gegenereerd die beoordeling van MT intrinsieke polariteit inschakelen door specifiek labeling MT plus eindigt of centrosoom-verankerd minus uiteinden11,12,13, 14. de kracht van deze tools ligt in de mogelijkheid te bestuderen van MT dynamiek in leven, ontwikkeling van organismen. Dergelijke studies is gebleken dat, bijvoorbeeld, de ruimtelijke en dynamische verdeling van MTs in specifieke cel populaties, de oriëntatie van de mitotische spindles in weefsels morfogenese (een indicator van het vliegtuig van celdeling), ondergaan de polariteit van het MT-polymeer met betrekking tot processen zoals cel rek en migratie, en MT groeitempo op jaarbasis bepaald door komeet snelheid9,13,15. De beperking van deze tools is dat ze niet gemakkelijk tussen stabiele en dynamische MT populaties discrimineren.

Tekening uit de rijke cel biologie literatuur, worden immunolabeling methoden om het imago van stabiele en dynamische MTs in de zebravis embryo hier beschreven, die zijn een aanvulling op het gebruik van transgene lijnen. Het wijdverbreide gebruik van dergelijke methodes van de immunolabeling in de zebravis enigszins belemmerd door de moeilijkheid in het MT integriteit behouden tijdens de procedure fixatie. Protocol 1 schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling totaal, dynamische, en stabiele MTs in grensoverschrijdende secties van de ontwikkelingslanden zebrafish hindbrain. Bovendien, een eenvoudige methode met behulp van commercieel beschikbare software wordt beschreven om het kwantificeren van de populaties van deze MT. Stabiele MTs onderscheiden zich van dynamische MTs gebaseerd op verschillende posttranslationele modificaties van α-tubuline, zoals acetylation en detyrosination, die op stabiele MTs in de tijd16,17 accumuleren. In het embryo van de zebravis, vindt acetylation plaats op Ciliaire en axonale MTs maar niet op stabiele interfase MTs18, beperking van het nut van deze markering tot een subset van gestabiliseerde MTs. Daarentegen lijkt detyrosination optreden op alle stabiele MTs in de zebravis embryo18. Deze posttranslationele wijziging blootstelt de glutaminezuur carboxy-terminal van α-tubuline (detyrosinated tubuline)18 en kan worden opgespoord met behulp van anti-Glu-tubuline19. Hoewel detyrosination bij voorkeur op stabiele MTs plaatsvindt, experimenteel bewijs geeft aan dat deze posttranslationele wijziging een gevolg van, in plaats van een doodsoorzaak, MT stabiliteit16. De wederzijdse MT bevolking, samengesteld uit dynamische MTs, onderscheidt zich met behulp van een antilichaam, anti-Tyr-tubuline, die specifiek de tyrosinated vorm van α-tubuline19herkent. Na immunolabeling met deze markeringen en confocal beeldvorming, de kwantitatieve analyse van MTs (lengte, aantal en relatieve overvloed) kan worden uitgevoerd in bepaalde regio's van de ontwikkeling van de neurale buis. Een gestroomlijnde methode is hier geboden voor het uitvoeren van deze analyse met behulp van 3D-beeldverwerking software. Deze methode kan worden toegepast om vragen te stellen met betrekking tot voedselproductie en de inrichting of de rijping van cel polariteit20. Inderdaad, de uitwerking van gepolariseerde arrays van stabiele MTs begeleidt veel developmental evenementen, waaronder fotoreceptor morfogenese21, epithelialization van cellen in de ontwikkelingslanden neurale buis18 en axon vorming8.

Protocol 2 beschrijft een in vivo -bewerking van een cel biologie assay voor het analyseren van MTs tijdens hun vergadering fase (nucleatie/anchorage en groei)22,23. Ontluikende MTs zijn nucleated op de centrosoom en vervolgens verankerd aan de subdistal aanhangsels van de moeder centriool23. Een methode voor het analyseren van de ontluikende MT hergroei na depolymerization wordt beschreven. Dit protocol bevat details over de behandeling van de nocodazole aan de depolymerize van MTs, de drug washout-procedure en de herstelperiode na de behandeling. MT uitgroei is gecontroleerd op regelmatige intervals post wassen door immunolabeling met markeringen voor totale MTs (anti β-tubuline) naast markers voor het centrosoom (anti γ-tubuline) en kern (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), volgens de algemene procedures beschreven in Protocol 1. De MT depolymerization stap van dit protocol is essentieel omdat hierdoor beoordeling van DOVO MT groei en uitbreiding van bestaande MTs niet. Deze techniek verschilt dus van andere gepubliceerde procedures voor het meten van MT groeicijfers (in afwezigheid van depolymerization) met behulp van een plus tip marker zoals einde bindende eiwit 3 gesmolten tot groen fluorescent proteïne (EB3-GFP), zoals in Tran et al., 201211. Bovendien, deze bepaling is met name handig voor het analyseren van de embryo's met gebreken in DOVO MT vergadering, zoals de eerder gemelde NEDD1 mutanten waarin rekrutering van γ-tubuline tot de centrosoom bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat resulteert in onvolledige de formatie van de neurale buis en neuronale gebreken24.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om petrischalen te behandelen. &nbsp; Bereid 1% agarose door een oplossing van&nbsp; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryomedium in een magnetron te verwarmen tot polymerisatie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mounting medium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-&beta;-tubulin</td><td>Developmental studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Konijn anti-&gamma;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Konijn anti-&alpha;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Konijn anti-detyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp; Titrateer antilichaam bij eerste gebruik van nieuwe partij.</td></tr><tr><td>Konijn anti-tyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Muis anti-centrin</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Geit 488 anti-konijn</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Geit 594 anti-konijn</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Geit 594 anti-muis</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Geit 488 anti-muis</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petrischaal</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm petrischaal</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falconbuis</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Gevlochten nylon gaas 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipet</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium sealant</td><td>Amazon.com, door MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE buis, 0,022"ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Modelleerklei</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>Elke was of olie gebaseerde niet-giftige modelleerklei is voldoende</td></tr><tr><td>Klem</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml spuit</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Embryomedium (E3)</td><td></td><td></td><td>34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2&middot;2H2O 9,78 g MgCl2&middot;6H2O Om een 60X stockoplossing te bereiden, lost u de ingrediënten in H2O op, tot een eindvolume van 2 L. Pas de pH aan tot 7,2 met NaOH. Autoclaveer. Om 1X medium te bereiden, verdunt u 16,5 mL van de 60X stockoplossing tot 1 L.&nbsp;</td></tr><tr><td>Blocking oplossing</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40 2,5 ml normaal geitenserum 1 g BSA 625 &micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7,6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0,1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6,4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Commerciële 3-D beeldverwerkingssoftware</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6,2)</td><td></td></tr><tr><td>Dry block verwarmer&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Wordt gebruikt als een hot plate om agarose in Protocol 1 te smelten.</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Vlakke inbeddingsvorm</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Public domain beeldverwerkingssoftware</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1,5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Het resultaat varieert per partijnummer</td></tr></tbody></table>

gebruik van immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis embryo

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubuli (MTs) zijn dynamisch en broos structuren die uitdagend om te afbeelding in vivo, met name in gewervelde embryo's zijn. Immunolabeling methoden worden hier beschreven om te analyseren verschillende populaties van MTs in de ontwikkelingslanden neurale buis van de zebravis embryo. Terwijl de nadruk op zenuwweefsel ligt, geldt deze methode in grote lijnen voor andere weefsels. De procedures zijn geoptimaliseerd voor vroeg tot midden-somitogenesis-fase embryo's (1 Somiet tot 12 somieten), maar ze aangepast aan een scala aan andere etappes met relatief kleine aanpassingen worden kunnen. Het eerste protocol biedt een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke spreiding van stabiele en dynamische MTs en een kwantitatieve analyse van deze populaties met beeld-verwerkende software uit te voeren. Deze aanpak vormt een aanvulling op bestaande hulpprogramma's voor afbeelding microtubulus dynamiek en distributie in real-time, met behulp van transgene lijnen of voorbijgaande uitdrukking van tagged constructies. Inderdaad, dergelijke hulpmiddelen zijn zeer nuttig, maar ze maken geen gemakkelijk onderscheid tussen dynamische en stabiele MTs. De mogelijkheid om beeld en analyseren van de populaties van deze verschillende microtubulus heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van mechanismen ten grondslag liggen aan de cel polarisatie en voedselproductie. Het tweede protocol schetst een techniek voor het analyseren van ontluikende MTs specifiek. Dit wordt bereikt door het vastleggen van de DOVO groei eigenschappen van MTs na verloop van tijd na microtubulus depolymerization met de nocodazole van de drug en een herstelperiode na drug wassen. Deze techniek heeft nog niet vereffend op de studie van MTs in zebrafish embryo's, maar is een waardevolle assay voor het onderzoeken van de functie in vivo van eiwitten die betrokken zijn bij de vergadering van de microtubuli.

Analyse van stabiele en dynamische MTs met behulp van immunolabeling In Protocol 1, wordt de verdeling van de MT subpopulatie tijdens de vroege (neurale Kiel) en late (neurale rod) stadia van ontwikkeling van de neurale buis onthuld, met behulp van Glu-tubuline en Tyr-tubuline als markeringen voor stabiele en dynamische MTs, respectievelijk. Dynamische MTs overheersen in de hindbrain de neurale Kiel stadium (4-5 somieten) (Figuur 2...

Immunolabeling methoden voor het analyseren van verschillende populaties van microtubuli in de ontwikkelende hersenen van de zebravis zijn hier beschreven, die over het algemeen van toepassing zijn op andere weefsels. Het eerste protocol schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling stabiele en dynamische microtubuli. Het tweede protocol biedt een methode om beeld en kwantificeren van ontluikende microtubuli specifiek.

Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Het algemene doel van deze labelingsprocedures is het visualiseren en kwantificeren van stabiele, dynamische en beginnende microtubuli in het ontwikkelende zebravissembryo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsneurobiologie, zoals de vraag hoe microtubuli bijdragen aan de vestiging van celpolariteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de detectie en kwantificering van verschillende microtubuli-populaties in situ optimaliseert.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de moeilijkheden bij het behouden van de microtubuli-integriteit. Na het dechloreren van gefaseerde zebravissenembryo's volgens het tekstprotocol, brengt u deze over naar 1,5 milliliter centrifugebuisjes en verwijdert u zoveel mogelijk medium. Voeg één milliliter 4% PFA in microtubule assembly buffer of MAB toe om de embryo's gedurende vijf minuten te fixeren bij 28,5 °C.Gebruik vervolgens een pipette om het fixeer middel af te zuigen en vervang dit door één milliliter vers fixeer middel. Incubeer de monsters op een rocker bij kamertemperatuur gedurende drie uur. Zuig het fixeer middel af en voeg één milliliter TBS NP-40 buffer toe.Agiteer de embryo's voorzichtig gedurende vijf minuten op een rocker. Herhaal de wasstap nog twee keer. Vervang vervolgens de buffer door 1 mL verse TBS NP-40 en bewaar de embryo's bij 4 °C voor maximaal zeven dagen.Nadat de embryo's zijn ontdoekt en in agarose zijn ingebed volgens het tekstprotocol, wordt de doorsnijschaal gevuld met TBS NP-40 en wordt er een vibratoom gebruikt om coupes van 40 micrometers te maken langs de langste as van de in agarose ingebedde embryo's. Gebruik een fijne pincet om de coupes van belang over te brengen naar 500 microliters TBS NP-40 in een 24-wells plaat. Verwijder de buffer en voeg 500 microliters blokkeringsoplossing toe.Schud de coupes vervolgens gedurende ten minste één uur op kamertemperatuur. Vervang de blokkeringsoplossing door 300 µL primaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer en incubeer de monsters op een schudder bij 4 °C gedurende 36 tot 72 uur. Gebruik 600 µL TBS NP-40 om de monsters tweemaal te wassen.Plaats deze gedurende 30 minuten per stuk op een rocker bij kamertemperatuur. Voeg 300 µL fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen, verdund in blokkeringsbuffer, toe aan de coupes en incubeer deze in het donker op een rocker bij 4 °C gedurende 16 tot 24 uur. Was de monsters vervolgens twee keer zoals zojuist gedemonstreerd.Voeg vervolgens 500 µL DAPI-oplossing toe aan de embryo's en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de monsters daarna drie keer met TBS NP-40 gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats na het wassen een druppel monteermiddel met anti-fade-middel in het centrum van een stofvrije objectglas.Gebruik een fijne pincet om de coupes over te brengen naar de druppel montagemedium. Plaats vervolgens een stofvrij dekglas bovenop het monster. Bewaar de coupes in folie gewikkeld, op een droge, donkere en koele plaats tot de beeldvorming wordt uitgevoerd.Leg, volgens de details in het tekstprotocol, z-stack confocale beelden vast met kanaalinstellingen voor de geselecteerde fluorochromen van het secundaire antilichaam en sla de beeldbestanden op. Open de kopie van het databestand met 3D-analysesoftware, zoals Image J. Creëer een samengevoegd beeld door de gewenste kanalen over elkaar heen te leggen via image, color, merge channels.Selecteer de kanalen van 594 nanometer, 488 nanometer en DAPI om deze respectievelijk rood, groen en blauw te kleuren. Vink deze aan, maak een compositie en selecteer oké. Visualiseer de samengevoegde z-stack als één enkel 2D-beeld door een maximumintensiteitsprojectie van de z-stack uit te voeren via afbeeldingen, stack, z-projectie.Voer de begin- en eindposities van de beste innerlijke z-vlakken respectievelijk in als startslice en stopslice. Selecteer maximale intensiteit als projectietype en klik op oké. Selecteer in de 3D-analysesoftware 'create library' en geef de beeldbibliotheek een beschrijvende naam.Klik, maak en sleep ruwe afbeeldingsbestanden naar de bibliotheek. Selecteer vervolgens een bestand om te analyseren. Kies daarna in het weergavemenu voor uitgebreide focus om de samengevoegde kanaalafbeelding in het hoofdvenster weer te geven.Selecteer de tool 'vrije hand ROI' en omtrek het te analyseren interessegebied. Selecteer het tabblad 'acties' en kies vervolgens 'bijsnijden naar selectie' om de afbeelding bij te snijden. Sla het bijgesneden afbeeldingsbestand vervolgens op onder een nieuwe naam.Klik vervolgens op het tabblad 'metingen' om het protocol te maken voor het filteren van specifieke objecten die relevant zijn voor de 3D-analyse. Sleep daarna 'find objects' naar het protocolvenster en hernoem het eerste protocol naar DAPI. Selecteer het bèta-tubulinekanaal in het vervolgkeuzemenu.Sleep vervolgens de volgende instellingen naar het beta-tubulineprotocol en plaats deze onder 'find objects' in de volgende volgorde: Fill holes and objects, separate touching objects, exclude objects by size en exclude not touching ROIs. Selecteer nu 'measure' onderaan elk protocol.Kies vervolgens voor alle kanalen behalve DAPI de intensiteit- en volumemeting en de skeletlengte voor alle tubuline-labeling. Teken een ROI rond het gebied dat gemeten moet worden. Bekijk onder het tabblad samenvatting de metingen nadat de software het gebied heeft verwerkt.Kopieer vervolgens de gegevens en sla deze op in een werkbaar spreadsheet, zoals hier getoond. Om een apparatus voor doorstroom met meerdere putten te maken, splitst u met behulp van een mal of een bandzaag een centrifugebuis van 50 milliliter in de lengte doormidden. Snijd uit nylon gaas van 70 micrometer zeven halve cirkels met een straal van drie centimeter en trim deze zodat ze strak in één helft van de gespleten centrifugebuis passen.Lijm de halve cirkels met aquariumveilige siliconenkit in de centrifugebuis, parallel aan de maatstreepjes van 10 milliliter. Laat het apparaat twee dagen drogen en spoel het vervolgens door het twee tot drie uur in een bekerglas met water te weken. Bedek het bovenste schroefdraaduiteinde van de doorgesneden centrifugebuis met boetseerklei, zodat de hoogte van de vloeistof die in het doorstroomapparaat wordt vastgehouden een diepte van one quarter inch heeft.Bereid het spoelapparaat voor door de zuiger uit een spuit van 50 milliliter te verwijderen en 12 inches fijne slang in de tip te plaatsen. Duw de slang zo ver mogelijk naar binnen en gebruik boetseerklei om de verbinding af te dichten. Maak het gaas vooraf nat met embryo-medium zodat de vloeistof door het gehele flow-through-apparaat kan stromen.Plaats het apparaat schuin op ijs, zodat vloeistof in alle compartimenten stroomt maar nog steeds uit de voorzijde stroomt waar de kleirand zich bevindt. Hang het uitspoelapparaat aan een statief boven het doorstroomapparaat op ijs. Koel 200 milliliters embryo-medium op ijs en giet voldoende in het uitspoelapparaat om ervoor te zorgen dat alle luchtbellen zijn verwijderd en dat de stroomsnelheid ongeveer zeven milliliters per minuut is.Pas de stroomsnelheid aan door de hoogte van de spuit te veranderen. Nadat de embryo's zijn gedechloreerd en nocodazol is voorbereid volgens het tekstprotocol, worden 10 milliliters koude nocodazol-werkoplossing gebruikt om het medium van de embryo's in de nocodazol-behandelingsgroep te vervangen. Plaats de petrischalen op ijs gedurende een tijd die passend is voor het ontwikkelingsstadium.Overbreng vervolgens de embryo's met een vuurgepolijste glazen pipet van 1 ml naar het flow-through apparaat, waarbij voor elke experimentele groep aparte compartimenten worden gebruikt. Start het uitwassen van nocodazol door ijskoud embryomedium in de bovenkant van de spuit van 50 ml te gieten. Laat de microtubuli na 20 minuten uitwassen bij kamertemperatuur opnieuw groeien door de embryo's met een vuurgepolijste glazen pipet van 1 ml over te brengen naar glazen petrischalen met warm embryomedium.Start een timer zodra de embryo's zijn overgeplaatst. Fixeer tot slot de controle-embryo's en de embryo's na het uitwassen na één, vijf en 10 minuten door ongeveer 10 embryo's met een pipet in een centrifugebuis van 1,5 milliliter te plaatsen, gevuld met één milliliter 4%PFA MAB fixeerder, en fixeer de monsters zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Gebruik glu-tubuline en tyr-tubuline als markers voor stabiele en dynamische microtubuli.Dynamische microtubuli blijken dominant te zijn in de achterhersenen tijdens het neurale kill-stadium. Naarmate de kill zich ontwikkelt tot de neurale staaf, een stadium van verhoogde epithelialisatie, zijn er kwalitatief minder microtubuli immunoreactief met het anti tyr-tubuline-antilichaam, in het bijzonder in de ventrale staaf. Daarentegen is glu-tubuline verspreid en punctaat aanwezig in de gehele neurale kill, maar is het verrijkt in de ventrale neurale staaf langs het microtubuli-tractus.Pijltjes wijzen naar specifieke microtubuli-bundels of structuren waar de labeling is toegenomen. De behandeling met nocodazol depolymeriseert microtubuli, wat resulteert in diffuse labeling. Naarmate de microtubuli opnieuw groeien, strekken ze zich uit vanuit het centrosoom.Dit is echter mogelijk niet duidelijk in een enkel vlak vanwege hun niet-planaire trajecten. Desalniettemin is sommige software voor beeldanalyse in staat om lengtes in 3D te meten, waardoor een beoordeling van de microtubuligroei na het uitwassen van nocodazole mogelijk is. De gemiddelde lengte van microtubuli lijkt in alle geanalyseerde regio's van de neurale buis in de loop van de tijd toe te nemen na het uitwassen van nocodazole.Zodra de data-analyse met de 3D-beeldanalyse-software is voltooid en de kwaliteitscontrole is uitgevoerd, kan nuttige informatie uit de ruwe data worden verkregen, zoals de gemiddelde lengte van de totale microtubuli en de stabiele microtubuli, evenals de ratio van stabiele microtubuli ten opzichte van de totale microtubuli. Zodra men deze techniek beheerst, neemt het proces van begin tot eind niet langer dan een week in beslag. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat monsters tijdig moeten worden verzameld en verwerkt, aangezien microtubuli gemakkelijk depolymeriseren.Deze procedure kan ook worden toegepast op de analyse van mutanten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe verschillende microtubuli-populaties in het intacte embryo kunnen worden vastgelegd.

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo&#39;s

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer immunolabeling om stabiele, dynamische en ontluikende microtubuli te analyseren in ontwikkelende zebrafishembryo's. Deze methode optimaliseert in situ-detectie en kwantificering voor ontwikkelingsneurobiologie.

Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

Meer video's verkennen